タンパク結晶、生体分子の固体格子を取得はタンパク質の構造を解明し、タンパク質の機能の研究ができます。結晶化は、pH、温度、イオン強度、および蛋白質の集中を含む多くの要因の組み合わせで浄化された蛋白質を乾燥を伴います。結晶を取得すると、蛋白質の構造、x 線回折法と電子密度モデルの計算によって解明されうる。
このビデオは、タンパク質の結晶化を紹介し、一般的な手順を示しています。タンパク質の発現と精製、結晶化、x 線回折の手順で覆われています。タンパク質の結晶化のアプリケーションには、膜タンパク質の構造解析、サイト裁決、インシリコ創が含まれます。
タンパク質の結晶化、蛋白質の格子状固体のフォームを取得するプロセスです。これらの結晶は、構造生物学、タンパク質機能の研究を支援する特に貴重です。量産仕様や SDS ページなどの他の技術だけ蛋白質の一次元構造の情報を提供できます。組換え蛋白質の表現の x 線回折法によるタンパク質の結晶化、補完されます。このビデオは、生化学の分野でタンパク質の結晶化、一般的な研究室プロシージャ、およびそのアプリケーションのいくつかの原則が表示されます。
プロセスに必要な最初のステップは、通常組換え蛋白質の表現を使用して、非常に純粋な蛋白質のミリグラム量を得るすることです。興味の蛋白質に対応する遺伝子は、発現ベクターにクローン化し、発現タンパク質親和性クロマトグラフィーによる浄化を支援するポリ ヒスチジンなどの親和性タグに融合。詳細については、アフィニ ティー ・ クロマトグラフィーのこのコレクションのビデオを参照してください。
結晶に浄化された蛋白質の形成、pH、イオン強度、鉛塩法の濃度とタンパク質、温度、および平衡の率を含む多くの要因の組み合わせによって決まります。使用される最も一般的なメソッドは蒸気拡散、2 つのカテゴリがあります: ドロップと座っているドロップをぶら下がっています。純粋な蛋白質、バッファー、および鉛塩法は、イオンを含む液滴固体をバインド水の分子、蛋白質のための水の利用を削減し、同じバッファーと鉛塩法のより高濃度混合物貯留層で囲まれたマイクロウェルは、高蛋白質の集中を模倣しました。初めに、蛋白質および鉛塩法の濃度は、結晶化を引き起こすが低すぎます。実験の過程で、水液滴から気化で収集し、貯留層;液滴の水の量の減少により過飽和になるシステムと核形成、結晶化、続いてに発生することができます。液滴から水の純移動は平衡で、システムは、プロセスが完了するまで保持されます。
3 D 構造の視覚化、x 線回折を使用します。結晶からの x 線データを取得するには、ことがすべての角度でビームにさらされている単色 x 線ビームに置かれます。各露光量は、各スポットの回折結晶から出てくるし、検出器によって登録されているが、イメージを提供します。データは、結晶内の原子の配置のモデルを生成する結合されます。結果として得られる結晶構造 2 オングストロームの一般的な解像度と、原子の三次元配置を示しています。
タンパク質の結晶化の原理について説明しましたが、一般的なプロトコルを見てみましょう。
手順を開始するには、興味の遺伝子を含む表現のベクトルはセルに変換されます。細胞を培養し、中間ログ段階で式が IPTG 遺伝子の mRNA の転写をトリガーするなど、インデューサを追加することによって開始されます。タンパク質発現後粗材は換散バッファー中に浮遊し、遠心分離によって明らかに。
明らかにしライセートがニッケル列に読み込まれます、polyhistidine タグ付きタンパク質が他のすべての生体分子が洗い流される中列にバインドします。
純粋な蛋白質の数ミリグラムを取得すると、気相拡散による結晶化の準備が整いました。24 ウェル ハング/シッティング ドロップ トレイは、さまざまな濃度の塩化ナトリウムとナトリウム酢酸緩衝液でいっぱいです。座ってのドロップ、タンパク質と貯留層のソリューションの平等なボリューム、各井戸の上の棚の上に戻し、トレイは透明テープで覆われています。インキュベーション室に格納されます、トレイと井戸が次の日、その後、数日ごとの成長のため監視されます。
受けたことを適切な結晶 x 線回折分析の準備は完了です。結晶は、選択した方向に結晶を配置するゴニオ メーターにマウントされます。あらゆる角度で x 線回折パターンを作り出すの単色ビーム クリスタルが点灯します。ソフトウェアでは、結晶内の原子の位置を決定することで結晶内の電子密度の三次元モデルに、さまざまな方向で撮影した 2次元の画像に変換します。
今では手順を見直している、タンパク質の結晶化と別の結晶化の技術のいくつかの有用なアプリケーションを確認してみましょう。
タンパク質の結晶化は、インシリコ創薬に使えます。インフルエンザ ウイルスのポリメラーゼ基本的なタンパク質 2、哺乳類のウイルス感染症にリンクされている、三次元構造は、結晶化と x 線回折法によって決定しました。潜在的な結合部位蛋白質は、可視化、および三次元分子ドッキング プログラムを使って設計されたが、蛋白質の裂け目に挿入します。
タンパク質・ DNA 錯体の共結晶も役に立つテクニックです。DNA 結合タンパク質はさまざまな転写、DNA 重合、DNA 修復など生体機能を調節します。これらの複合体の結晶構造がタンパク質の機能、メカニズム、および特定の相互作用の性質に洞察力を提供できます。大腸菌タンパク質複製、DNA 複製の負の調節因子は hemimethylated DNA の結晶化されました。
不可欠な膜タンパク質など G 蛋白質によってつながれる受容器、または GCPRs、極表面領域融合によるタンパク質結晶の開発につながっている連絡先、結晶格子を形成するための彼らの限られた量のため結晶化が困難です。リゾチーム、GCPR、β 2 アドレナリン受容体をコードする遺伝子は、発現ベクターに挿入されました。Β2AR リゾチームの融合蛋白質の結晶化は、リゾチーム、結晶格子中のパッキング相互作用をかたちづくるために必要によって提供される、当然のことながら疎水性 β2AR 上増加細胞外親水性表面のため実現しました。
タンパク質の結晶化にゼウスのビデオを見てきただけ。このビデオはその原則、一般化されたプロトコル、およびいくつかを説明したバイオメディカル分野で使用。見てくれてありがとう!
タンパク質の結晶化は、タンパク質の格子状の固体形態を得るプロセスです。これらの結晶は、構造生物学者にとって特に価値があり、タンパク質機能の研究に役立ちます。質量分析やSDS-PAGEなどの他の手法では、タンパク質の一次元構造に関する情報しか提供できません。タンパク質の結晶化は、組換えタンパク質発現とX線回折の技術によって補完されます。このビデオでは、タンパク質の結晶化の原理、一般的な実験室手順、および生化学分野でのその応用のいくつかを紹介します。
このプロセスで必要な最初のステップは、通常は組換えタンパク質発現を使用して、ミリグラム量の非常に純粋なタンパク質を取得することです。目的のタンパク質に対応する遺伝子を発現ベクターにクローニングし、発現したタンパク質をポリヒスチジンなどのアフィニティータグに融合させて、アフィニティークロマトグラフィーによる精製を支援します。詳細については、アフィニティークロマトグラフィーに関するこのコレクションのビデオをご覧ください。
精製されたタンパク質の結晶への形成は、pH、イオン強度、沈殿物とタンパク質の濃度、温度、平衡化速度など、多くの要因の適切な組み合わせに依存します。最も一般的な方法は蒸気拡散で、吊り下げ式ドロップと座式ドロップの2つのカテゴリーがあります。純粋なタンパク質、バッファー、および沈殿物(水分子と結合するイオン性固体であり、タンパク質の水の利用可能性を減らし、より高いタンパク質濃度を模倣する)を含む液滴は、同じバッファーと沈殿物のより高濃度の混合物を含むリザーバーを備えた密閉されたマイクロウェルにあります。最初は、タンパク質と沈殿物の濃度が低すぎて結晶化を引き起こしません。実験の過程で、水滴から水が蒸発し、貯水池に集まります。液滴中の水の量が減少すると、システムは過飽和になり、核形成とそれに続く結晶化が発生する可能性があります。液滴からの水の正味の移動は平衡状態にあり、システムはプロセスが完了するまで維持されます。
3D構造を視覚化するために、X線回折が使用されます。結晶からX線データを取得するには、単色X線ビームの中に入れ、あらゆる角度でビームにさらします。各露光は画像を提供し、各スポットは回折X線であり、結晶から出て検出器によって記録されます。データを組み合わせて、結晶内の原子の配置のモデルを作成します。結果として得られる結晶構造は、原子の3次元配置を示しており、一般的な分解能は2オングストロームです。
さて、タンパク質の結晶化の原理について説明したので、一般化されたプロトコルを見てみましょう。
手順を開始するには、目的の遺伝子を含む発現ベクターを細胞に形質転換します。細胞をインキュベートし、中間対数期で、遺伝子のmRNAの転写をトリガーするIPTGなどの誘導剤を追加することで発現を開始します。タンパク質発現後、粗材料を溶解バッファーに懸濁し、遠心分離により清澄化します。
次に、清澄化されたライセートをニッケルカラムにロードし、ポリヒスチジンタグ付きタンパク質がカラムに結合する一方で、他のすべての生体分子を洗い流します。
数ミリグラムの純粋なタンパク質が得られたら、蒸気拡散による結晶化の準備が整います。24ウェルの吊り下げ式/座式ドロップトレイには、さまざまな濃度の塩化ナトリウムおよび酢酸ナトリウム緩衝液が充填されています。シッティングドロップ法では、等量のタンパク質とリザーバー溶液を各ウェルの上の棚にピペットで移動し、トレイを透明テープで覆います。次に、トレイをインキュベーションチャンバーに入れ、翌日、その後数日ごとにウェルの成長を監視します。
適切な結晶が得られたら、X線回折分析の準備が整います。結晶はゴニオメーターに取り付けられ、選択した向きに結晶を配置します。結晶は、あらゆる角度でX線の単色ビームで照らされ、回折パターンを生成します。このソフトウェアは、異なる向きで撮影された2次元画像を、結晶内の原子の位置を決定することにより、結晶内の電子密度の3次元モデルに変換します。
手順を確認したので、タンパク質の結晶化のいくつかの有用なアプリケーションと、別の結晶化技術を確認しましょう。
タンパク質の結晶化は、インシリコ医薬品の設計に使用できます。インフルエンザウイルスのポリメラーゼ塩基性タンパク質2は、哺乳類のウイルス感染と関連づけられており、結晶化とX線回折によって立体構造が明らかになりました。タンパク質の潜在的な結合部位が視覚化され、ドッキングプログラムを使用して、タンパク質の溝に挿入する三次元分子が設計されました。
タンパク質-DNA複合体の共結晶化も有用な技術です。DNA結合タンパク質は、転写やDNA重合、DNA修復など、さまざまな生物学的機能を調節します。また、これらの複合体の結晶構造は、タンパク質の機能、メカニズム、および特定の相互作用の性質に関する洞察を提供することができます。DNA複製の負の調節因子である大腸菌タンパク質SeqAは、ヘミメチル化DNAと共結晶化されました。
Gタンパク質共役型受容体(GCPR)などの内在性膜タンパク質は、結晶格子接触を形成するために利用できる極性表面積が限られているため結晶化が困難であり、これが融合タンパク質支援タンパク質結晶化の開発につながっています。?2アドレナリン受容体、GCPR、およびリゾチームをコードする遺伝子を発現ベクターに挿入しました。「2AR-リゾチーム融合タンパク質」の結晶化は、リゾチームによって提供される天然の疎水性「2AR」よりも細胞外親水性表面が増加したため、結晶格子内でのパッキング相互作用の形成に必要でした。
JoVEのタンパク質結晶化に関するビデオをご覧になりました。このビデオでは、その原理、一般化されたプロトコル、および生物医学分野でのいくつかの使用法について説明しました。ご覧いただきありがとうございます!
Chapters in this video
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Overview
0:50
Principles of Protein Crystallization
3:16
Protocol for Protein Expression, Crystallization, and X-Ray Diffraction
5:15
Applications
7:20
Summary
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