変形能と赤血球による血液中赤血球の不均一性を測定

この技術の全体的な目標は、赤血球の変形性と細胞の不均一性をエクタサイトメトリーによって測定することです。この方法は、赤血球がどの程度変形しやすいか、血液サンプルがどれほど不均一であるか、疾患の関数として実験がどのように変化するかなど、エクタサイトメトリーにおける重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、赤血球集団の変形性と不均一性を測定する際のアクセシビリティ、利便性、および信頼性です。

この技術は、鎌状赤血球貧血患者の治療に対する反応をモニタリングするのに役立つ可能性があります。なぜなら、赤血球の変形性と不均一性は、ヘモグロビンの組成と濃度と相関しているからです。これらの方法は、赤血球の変形能の低下が微小血管疾患の一因となる可能性のある糖尿病など、赤血球の変形性の低下を特徴とする他の疾患にも適用できます。

まず、ゼロ浸透圧チューブを低浸透圧PVP溶液に接続し、500浸透管を高浸透圧PVP溶液に接続します。ボブがカップに完全に下がっていることを確認します。ソフトウェアを起動し、[Hardware Check]、[Instrument IO]の順に選択してマシンを準備します。装置がプライミングサイクルを完了するのを待ちます。

サイクルが完了したら、ボブをカップから持ち上げ、糸くずの少ないクリーニングティッシュでボブとカップを完全に乾かします。採取したばかりの全血サンプルを、バイアルを数回反転させて穏やかに混合します。次に、25マイクロリットルの全血を5ミリリットルの等浸透圧PVP溶液にピペットで移します。

バイアルをキャッピングした後、再度数回反転させて穏やかに混合します。ソフトウェアのメインメニューから変形可能性を選択し、新しい解析を作成して実験の詳細を追加します。次に、エクタサイトメーターの蓋を持ち上げ、ボブがカップに完全に下がっていること、およびカップが回転していることを確認します。

1ミリリットルのPVP血液溶液をカップとボブの間のスペースにピペットで入れます。次に、ボブを少し持ち上げてサンプルを下ろします。すべての気泡が溶液から移動するのを待ってから、エクタサイトメーターの蓋を閉じます。

ソフトウェアのスクロールバーに沿って矢印を動かして、ゲインを200に調整します。温度が摂氏37度で安定し、回折像が安定したら、スタートを押します。データ集録が進むにつれて回折パターンを観察し、回折パターンが円形、楕円形、または菱形のままであることを確認します。

データ取得が完了したら、レポートを印刷してクリーニングします。せん断応力に応答して健康な血液から得られた回折パターンは、予想される楕円パターンを示しています。伸び指数は、ここに示す式を使用して計算されます。

サンプルを吸引したら、装置がクリーンサイクルのままである間に、脱イオン水をスペースに噴出してカップとボブの間のスペースをすすぎます。クリーニングサイクルが完了したら、ボブをカップから持ち上げ、糸くずの少ないクリーニングティッシュでボブとカップを完全に乾かします。残留水は赤血球を溶解し、干渉を引き起こすため、適切な乾燥が重要です。

[エクスポート] を選択してレポートを保存します。最後に、ソフトウェアのメインメニューボタンをクリックして、メインページに戻ります。前回と同様に別のサンプルをエクタサイトメーターにロードした後、画面上に安定した回折像が存在することを確認します。

カメラゲインを調整するには、画面に沿って定規を動かし、回折高さが3.8cmになるまで動かします。定規を使用して、コンピューター画面上の画像の高さを確認します。次に、スタートを押して、前と同じようにデータ集録を観察します。

この画像は、鎌状赤血球貧血患者の血液から得られた3.8cmの回折パターンを示しています。前に示すようにエクタサイトメーターを洗浄した後、手順を繰り返して4.5cmと5.4cmの高さで回折パターンを取得します。不均一な血液サンプルでは、硬質な赤血球が変形可能な細胞と適切に整列せず、ひし形の回折パターンが生じるため、回折パターンの歪みが発生します。

この歪みパターンは、カメラのゲインを調整してより大きな回折パターンを生成するにつれて、ますます検出可能になります。浸透圧勾配エクタサイトメトリーの場合は、まず、5ミリリットルの等浸透圧PVPを含むバイアルに250マイクロリットルの全血を加え、穏やかに混合します。ソフトウェアのメインメニューからOsmscanを選択します。

次に、血液PVP溶液が入ったバイアルを、機械の左側にある針の下に置きます。針がバイアルの底に触れるまで針を下げます。グラジエント生成のために、チューブが低浸透圧溶液と高浸透圧溶液に適切に接続されていることを確認してください。

エクタサイトメーターの蓋を閉め、下半分のドアを開けると、チューブに入る血液が見えます。New Analysisを押して、実験の詳細を入力します。カメラゲインを200に調整した後、機器の下のチューブから血液がカップに入るまでマシンを稼働させます。

コンピュータ画面に安定した回折パターンが表示されたら、ダイアログボックスのStart Nowボタンを押してデータ取得を開始します。エクタサイトメーターがキログラムあたり約500ミリオスモルまでのデータを取得するのを待ってから、装置を停止します。レポートを印刷します。

次に、古いPVP血液バイアルを取り外し、脱イオン水が入ったきれいなバイアルと交換します。針をバイアルの底に触れるように下ろし、ダイアログボックスのすすぎボタンを押してグラジエントシステムをすすぎます。すすぎが完了したら、コンピューターモニターのダイアログボックスでクリーンオプションを押し、[エクスポート]を選択してレポートを保存します。

前と同じようにボブとカップを乾かします。健康なボランティアに見られるような均質な血液集団は、回折サイズを測定するときに異なる変形性曲線を生成しません。対照的に、鎌状赤血球貧血患者の血液などの不均一な血液集団は、回折パターンサイズの関数として変形能測定値の大幅な減少を示しています。

鎌状赤血球では、回折パターンの歪みの程度をEI maxの関数として測定すると、ヘモグロビンS、および成人のヘモグロビン変異体であるヘモグロビンA2と相関します。輸血は、血液中の正常な成人ヘモグロビンの割合との反比例関係によって示されるように、歪みを補正します。回折パターンの歪みの程度が、半値の最大変形能を達成するために必要なせん断応力の関数として測定されるか、EI maxの関数として測定されるかにかかわらず、胎児のヘモグロビンと相関しています。EI max、EI min、O minなどの主要な浸透圧勾配エクタサイトメトリーパラメータは、それぞれ細胞の水分補給、表面と体積の比率、および浸透圧の脆弱性に関する追加情報を提供します。

これらのテクニックを習得すると、適切に実行すれば、約1時間で完了できます。この手順に続いて、顕微鏡検査などの他の方法を実行して、個々の赤血球の変形性に関する追加の質問に答えることができます。このビデオを見れば、血液サンプルの変形性と血清の不均一性を測定する方法について十分に理解できるはずです。