4.9: ゲルシフトアッセイ (EMSA)

EMSA(電気泳動移動度シフトアッセイ)は、ゲルシフトアッセイとも呼ばれ、汎用性が高く感度の高い生化学的手順です。EMSAは、ゲル電気泳動におけるバンドのシフトを検出することにより、タンパク質と核酸の間の結合を解明します。

このビデオでは、EMSA の原理を説明し、一般的な手順を説明し、いくつかのアプリケーションについて説明します。

DNAの複製、転写、修復、およびRNAプロセシングはすべて重要な生化学的プロセスです。それらはすべて、タンパク質と核酸との間の結合を伴います。多くの重篤な疾患や障害は、この結合の修飾に関連しています。EMSAは、特定のタンパク質が特定の核酸に結合するかどうかを定性的に判断する手法です。まず、核酸を通常は放射性リン32で標識してプローブを作成します。次に、試験タンパク質と核酸プローブを混合します。タンパク質が核酸プローブに結合すると、結果として生じる複合体は、核酸単独の場合よりも質量が大きく、コンフォメーションが異なります。

結合すると、錯体はゲル電気泳動で分析されます。この手法では、電場によって高分子がゲルマトリックス内を移動するように強制されます。成分は、質量、電荷、およびコンフォメーションに基づいて分離します。電気泳動は、結合していないプローブからタンパク質-DNA複合体を分離することができます。それらは異なる質量とコンフォメーションを持っているため、ゲル内を異なる速度で移動し、分離します。放射性リンの存在により、分離は容易に検出され、タンパク質が所定の核酸に首尾よく結合することが証明されています。タンパク質の同定を確認するために、「スーパーシフトアッセイ」では、タンパク質に対する既知の親和性を持つ抗体を使用します。これには、コンプレックスをさらにシフトし、解像度を向上させるという追加の利点があります。

原理を見てきたところで、研究室で見てみましょう。

手順を開始するには、タンパク質を単離する必要があります。これを行うために、分子生物学的手法を使用して細胞内でタンパク質を発現させ、その後精製します。

核酸を増幅して標識し、プローブを作成します。標識は、放射性リン-32を含むdCTPと10分間インキュベートすることによって行われます。放射線に安全な作業台と保護具が必要です。

次に、ゲルを調製します。ゲルは、電気泳動中にタンパク質がコンフォメーションを変化させ、プローブから結合を剥がすのを防ぐために、非変性である必要があります。ポリアクリルアミドゲルの細孔径は5〜20 nmで、長さが最大100塩基対の短いプローブに役立ちます。アガロースゲルの細孔径は70-700 nmで、より大きなプローブに有用です。

タンパク質と核酸プローブの準備ができたので、結合に進みます。TRIS緩衝液を調製し、タンパク質とプローブを添加します。pHは生理学的条件と同程度で、タンパク質が非標的核酸と弱い結合を形成するのを防ぐのに十分な塩濃度である必要があります。反応は4°Cで20〜30分間進行する。

次のステップは電気泳動です。低イオン強度のバッファーと、結合反応で使用されるものと同様のpHが利用されます。複合体を安定させ、移動性を高め、発熱を抑える「ケージ効果」をもたらします。電気泳動後、ゲルの成分を濾紙に移します。暗い部屋では、濾紙をフィルムにさらします。タンパク質がプローブに結合すると、転写中に2つの異なる標識領域が見えます。1 つは複合施設を表し、もう 1 つは非バインド プローブを表します。この分離は、タンパク質が核酸に正常に結合したことを示しています。

基本的な手順を確認したので、いくつかのアプリケーションを見てみましょう。

クロマチンは、真核細胞に見られるDNAとタンパク質の密集した複合体です。クロマチンリモデリング酵素は、DNAを転写するために構造を修飾します。これにより複合体の移動度が変化するため、EMSAを使用して酵素の結合活性を調べることができます。

標識の別のアプローチは、DNAとメチルトランスフェラーゼ酵素との間の相互作用を利用することです。補因子は、メチルトランスフェラーゼを介してDNAに永久に結合するように修飾することができます。リン32で標識するのではなく、補因子はビオチンに結合しており、放射性ではないため有利です。補因子はその結合において部位特異的であるため、ジェノタイピング、メチル化検出、および遺伝子導入に関連しています。ビオチン化核酸は、紫外線蛍光によって検出されます。

環境刺激がヒスチジンキナーゼを活性化すると、「応答調節因子」がリン酸化されます。これは次にDNAに結合し、転写に影響を与え、EMSAで研究することができます。たとえば、レスポンスレギュレーターは?Desulfovibrio vulgarisは、目的の遺伝子に結合することが示されました。EMSA を使用して、バインディングが行われたことを確認しました。

JoVEの電気泳動移動度シフトアッセイに関するビデオをご覧になりました。これで、その動作原理、手順のステップ、および主要な動作パラメータを理解できます。

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