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Co-免疫沈降 (CoIP) プルダウン ・ アッセイは、安定したタンパク質間相互作用を識別するために密接に関連するメソッドです。これらのメソッドは、免疫沈降、抗体と結合した自由な蛋白質からターゲット蛋白質を分離する方法に関連しています。CoIP、抗体結合蛋白質は抗体と結合しない別の蛋白質にバインド自体、これはタンパク質タンパク質を保持する分離プロセスによって、続いて複雑な。プルダウンの試金の違いは餌の親和性タグ付きタンパク質を交換して、抗体、アフィニ ティー ・ クロマトグラフィー蛋白質蛋白質の複合体を分離するために使用します。
このビデオでは、CoIP、プルダウンの試金、および研究室での実装について説明します。試薬、装置、浄化し、バインドされた蛋白質を分析するために使用楽器など、各テクニックの手順プロトコルが覆われています。このビデオのアプリケーション セクションが myxovirus 蛋白質がインフルエンザ蛋白、プルダウンの試金および変更されたプルダウン法を介してカルモジュリンにおけるカルシウム イオンの役割の捜査を阻害する方法を研究するための手順をについて説明しますさらに、一時的な蛋白質の相互作用を特徴付けます。
蛋白質蛋白質の相互作用は、さまざまな生物学的機能に重要な役割を再生します。蛋白質蛋白質の相互作用とその生体影響の大半は、識別することまだあります。Co-免疫沈降、または CoIP、プルダウン ・ アッセイは、安定したタンパク質間相互作用を識別するための 2 つの密接に関連方法です。このビデオは、2 つの試金、一般的な検査手順、およびこれらの技術の応用の原理を説明します。
CoIP プルダウン ・ アッセイは、免疫沈降、複雑なソリューションからの蛋白質種を選択的に分離する方法のバリエーション。免疫沈降実験では、サンプルでそのターゲットと免疫複合体を形成する標的蛋白質への抗体となっています。複合体は、通常タンパク質セファローズ ビーズにバインドされている、固体のサポートにキャプチャされます。キャプチャされていない任意のタンパク質は、遠心分離の手順で削除されます。タンパク質は、SDS ページ サンプル読み込みバッファーを減らす沸騰によって抗体および固体のサポートから解放されます。
そのまま蛋白質複合体が固体のサポートにキャプチャされる点を除いて、Co 免疫沈降は同じ方法で行われています。抗体は、ターンでは、抗体のない対象となる別の蛋白質にバインドされているターゲット蛋白質にバインドします。免疫沈降のように蛋白質の複合体は SDS-PAGE サンプルバッファーの読み込みを減らす沸騰によって抗体と固体のサポートから解放されます。
プルダウン アッセイは、co-免疫沈降、抗体ではなく、「餌」蛋白質の使用でのみが異なるに似ています。分子生物学的手法によるこのタンパク質の餌は、ヒスチジンの残余のシリーズなどの親和性タグと設計されています。これらの親和性の札、「生体分子分離クロマトグラフィー ベース」で説明タンパク質は、固定化のアフィニティーリガンド タグのために特定のキャプチャされます。キャプチャされたタンパク質を「餌」と複合体を形成するタンパク質を含むサンプルでインキュベーションします。蛋白質の複合体は、「餌」タンパク質にタグの特定の競争力のある検体を含む溶液で洗浄することにより親和性サポートから解放されます。プルダウン アッセイは、co-免疫沈降によって予測された蛋白質の相互作用を確認するため、未知の蛋白質の相互作用を発見するために役立ちます。
Co 免疫沈降とプルダウン ・ アッセイの原理が説明されている、今は実験室プロシージャを見てみましょう。
最初 co 免疫沈降を説明しましょう。一連の microfuge の管の次の追加: PBS バッファー、および蛋白抗体に結合する樹脂タンパク質複合体、即ち 50% 溶液です。適切な配分を確保するため microfuge の管が回転して、追加の PBS バッファーで樹脂を洗浄するし。細胞ライセート、目的のタンパク質を含むと 2 μ g の抗体が microfuge の管に追加され、混合物は 4 ° C で 1 時間の回転遠心分離によってビーズをペレット、上清を捨て、ビーズ 3 回洗浄バッファーを非バインド タンパク質を削除して再。抗体蛋白質の複合体を含むビーズは、SDS ページ サンプル読み込みバッファー、抗体の複合体の除去、SDS-PAGE とイムノブロット解析を減らすことです。
今、プルダウンの試金のための手順について説明します:「餌」タンパク質は適切な親和性タグとプラスミドで表されます。ログ相成長を達した後セルを溶解し, して遠心し。「餌」タンパク質のビオチン タグをキャプチャ、中断されたストレプトアビジン セファローズ ビーズがおよび microfuge の管に戻します。ビーズは遠心し、上清を吸引により慎重に削除します。それから、ビーズはバッファー、遠心、上清除去と洗浄されます。
「餌」タンパク質の親和性を持っていると推定される「獲物」タンパク質を含むセルは、遠心分離によって収穫されています。上澄みは、樹脂を含むおよび microfuge の管に追加し、シェーカーで 3 h の 4 ° C で培養しました。樹脂は、遠心、上清除去し、樹脂非バインド蛋白質を取除くことを洗浄します。樹脂に溶出バッファーが追加され、混合物はシェーカー上で 30 分間室温でインキュベートします。樹脂は遠心し、目的の複合体を含む上清をイムノブロット分析します。
今では手順を確認しましたところ、co 免疫沈降法とプルダウン ・ アッセイの有用なアプリケーションのいくつかを見てみましょう。
Co 免疫沈降は、酵素の作用機序の理解を深めるに役立ちます。Myxovirus-、または Mx-の抵抗蛋白質を阻害メカニズムはよく理解されていないインフルエンザを含むウイルスの広い範囲。Co 免疫沈降は、マウス Mx1 タンパク質とインフルエンザ蛋白間相互作用の研究に使用されました。
プルダウンの試金は、携帯電話の環境からの信号を通信する蛋白質である第 2 メッセンジャーの効果の研究に役立っています。彼らは、複数のタンパク質が環境手がかりに応えて対話するシグナル伝達経路のコンポーネントです。カルシウム イオンは、多くの種類の生物学的反応を仲介するターンでは、さまざまなタンパク質に結合するカルモジュリンに結合して二次メッセンジャーとして機能します。せず、カルシウム、タンパク質は、カルモジュリンにバインドできません。
Co 免疫沈降法とプルダウンの試金は通常がない一時的なものの安定・強力な蛋白質の相互作用の分析に使用されます。HaloTag、プルダウン法の最近の発展は一時的な蛋白質の相互作用の研究を簡素化します。HaloTag 固体支持体ハロゲン化アルキルと反応して化学的にことができる興味の蛋白質に溶ける、遺伝子にコードされたタンパク質融合タグであります。蛋白質の複合体、そのままの状態で、タグ マイナスでしたそれから隔離する機能解析が必要な場合にたばこの孵化によってウイルスのプロテアーゼをエッチングします。
Co 免疫沈降とプルダウン ・ アッセイのゼウスのビデオを見てきただけ。このビデオは、2 つの方法、一般的な研究室プロシージャ、およびアプリケーションのいくつかの原則を説明します。
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共免疫沈降法(CoIP)とプルダウンアッセイは、安定したタンパク質間相互作用を同定するための密接に関連する方法です。これらの方法は、抗体に結合した標的タンパク質を非結合タンパク質から分離する方法である免疫沈降に関連しています。CoIPでは、抗体に結合したタンパク質自体が、抗体と結合しない別のタンパク質に結合し、その後、タンパク質-タンパク質複合体を保存する分離プロセスが続きます。プルダウンアッセイの違いは、アフィニティータグ付きベイトタンパク質が抗体に置き換わり、アフィニティークロマトグラフィーを使用してタンパク質-タンパク質複合体を単離することです。
このビデオでは、CoIP、プルダウンアッセイ、およびラボでの実装について説明します。結合タンパク質の精製と分析に使用される試薬、装置、機器など、各技術の段階的なプロトコールがカバーされています。さらに、このビデオのアプリケーションセクションでは、ミクソウイルスタンパク質がインフルエンザ核タンパク質を阻害する方法を研究する手順、プルダウンアッセイによるカルモジュリン中のカルシウムイオンの役割の調査、および一過性タンパク質相互作用を特徴付けるための修正プルダウンアッセイについて説明します。
タンパク質間相互作用は、さまざまな生物学的機能において重要な役割を果たしています。タンパク質間相互作用の大部分とその生物学的影響はまだ特定されていません。共免疫沈降法(CoIP)とプルダウンアッセイは、安定したタンパク質間相互作用を同定するための2つの密接に関連する方法です。このビデオでは、2つのアッセイの原理、一般的な実験室手順、およびこれらの技術の応用について説明します。
CoIPおよびプルダウンアッセイは、複雑な溶液からタンパク質種を選択的に単離する方法である免疫沈降の変種です。免疫沈降実験では、標的タンパク質に特異的な抗体を、サンプル中のその標的と免疫複合体を形成することができます。次に、複合体は固体支持体(通常はセファロースビーズに結合したタンパク質A)に捕捉されます。捕捉されなかったタンパク質は、遠心分離ステップによって除去されます。その後、タンパク質は抗体と固体支持体から放出され、還元SDS-PAGEサンプルローディングバッファーで沸騰します。
共免疫沈降も同様に行われますが、無傷のタンパク質複合体が固体支持体に捕捉される点が異なります。抗体は標的タンパク質に結合し、さらに標的タンパク質は抗体が標的としない別のタンパク質に結合します。免疫沈降と同様に、タンパク質複合体は、SDS-PAGEサンプルローディングバッファーを減少させることで沸騰することにより、抗体および固体支持体から放出されます。
プルダウンアッセイは共免疫沈降と似ていますが、抗体とは対照的に「ベイト」タンパク質を使用する点のみが異なります。分子生物学的手法により、このベイトタンパク質は、一連のヒスチジン残基などのアフィニティータグを使用して操作されます。これらのアフィニティータグについては、「クロマトグラフィーベースの生体分子の分離」で説明しています。次に、タンパク質はタグに特異的な固定化されたアフィニティーリガンドに捕捉されます。次に、捕捉されたタンパク質を、「餌」と複合体を形成するタンパク質を含むサンプルとインキュベートします。タンパク質複合体は、「ベイト」タンパク質のタグに特異的な競合分析物を含む溶液で洗浄することにより、アフィニティーサポートから放出されます。プルダウンアッセイは、共免疫沈降によって予測されるタンパク質相互作用の確認や、未知のタンパク質相互作用の発見に有用です。
さて、共免疫沈降法とプルダウンアッセイの原理について説明したので、その実験手順を見てみましょう。
まず、共免疫沈降についてお話ししましょう。一連のマイクロチューブに、PBSバッファーと、抗体に結合する樹脂-タンパク質複合体であるタンパク質A-セファロースの50%溶液を添加します。マイクロフュージチューブを回転させて適切な分布を確保し、その後、レジンを追加のPBSバッファーで洗浄します。所望のタンパク質を含む細胞溶解物と2μgの抗体をマイクロチューブに添加し、混合物を4°Cで1時間回転させる。ビーズを遠心分離によりペレット化し、上清を廃棄し、ビーズをバッファーで3回再洗浄して非結合タンパク質を除去します。抗体-タンパク質複合体を含むビーズは、抗体からの複合体の除去、およびSDS-PAGEおよびイムノブロッティングによる分析のために、SDS-PAGEサンプルローディングバッファーを還元します。
次に、プルダウンアッセイの手順について説明します:「ベイト」タンパク質は、適切なアフィニティータグを持つプラスミドで発現されます。対数期の増殖に達した後、細胞を溶解し、次に遠心分離します。懸濁したストレプトアビジン-セファロースビーズは、ビオチンタグ付きの「ベイト」タンパク質を捕捉し、マイクロチューブにピペットで移します。次に、ビーズを遠心分離し、上清を吸引して慎重に除去します。次に、ビーズをバッファーで洗浄し、遠心分離し、上清を取り除きます。
「餌」タンパク質に親和性を持つ推定される「獲物」タンパク質を含む細胞は、遠心分離によって回収されます。次に、上清を樹脂の入ったマイクロチューブに加え、シェーカー上で4°Cで3時間インキュベートします。次に、レジンを遠心分離し、上清を取り除き、レジンを洗浄して非結合タンパク質を除去します。溶出緩衝液を樹脂に添加し、混合物を室温で30分間シェーカー上でインキュベートします。次に、樹脂を遠心分離し、目的の複合体を含む上清をイムノブロッティングで分析します。
手順を確認したので、共免疫沈降とプルダウンアッセイの有用なアプリケーションをいくつか見てみましょう。
共免疫沈降は、酵素の作用機序をより深く理解するのに役立ちます。ミクソウイルス(Mx)耐性タンパク質は、インフルエンザAを含む広範囲のウイルスを阻害しますが、そのメカニズムはよく理解されていません。共免疫沈降法を用いて、マウスMx1タンパク質とインフルエンザ核タンパク質との相互作用を研究しました。
プルダウンアッセイは、細胞環境からのシグナルを伝達するタンパク質であるセカンドメッセンジャーの影響を研究する上で有用であることが証明されています。これらは、環境の合図に応答して複数のタンパク質が相互作用するシグナル伝達経路の構成要素です。カルシウムイオンは、カルモジュリンに結合することで二次メッセンジャーとして作用し、カルモジュリンは多種多様なタンパク質に結合して、さまざまな種類の生物学的応答を媒介します。カルシウムがなければ、タンパク質はカルモジュリンに結合できません。カルシウムイオンの存在下または非存在下でタンパク質がカルモジュリンに結合する能力をテストするために、プルダウンアッセイを実施しました。
共免疫沈降およびプルダウンアッセイは、一般に、安定または強力なタンパク質相互作用の分析に使用されますが、一過性の相互作用は使用されません。プルダウンアッセイの最近の開発であるHaloTagは、一過性タンパク質相互作用の研究を簡素化しました。HaloTagは、遺伝子にコードされたタンパク質融合タグで、目的のタンパク質に融合し、ハロアルカン固体支持体と化学的に反応することができます。機能解析が必要な場合は、タグを除いたタンパク質複合体全体を、タバコエッチングウイルスプロテアーゼとインキュベートすることで単離できます。
JoVEの共免疫沈降およびプルダウンアッセイに関するビデオをご覧になりました。このビデオでは、2つの方法の原理、一般的なラボ手順、およびそれらのアプリケーションの一部について説明しました。
ご覧いただきありがとうございます!
タンパク質間相互作用は、さまざまな生物学的機能において重要な役割を果たしています。タンパク質間相互作用の大部分とその生物学的影響はまだ特定されていません。共免疫沈降法(CoIP)とプルダウンアッセイは、安定したタンパク質間相互作用を同定するための2つの密接に関連する方法です。このビデオでは、2つのアッセイの原理、一般的な実験室手順、およびこれらの技術の応用について説明します。
CoIPおよびプルダウンアッセイは、複雑な溶液からタンパク質種を選択的に単離する方法である免疫沈降の変種です。免疫沈降実験では、標的タンパク質に特異的な抗体を、サンプル中のその標的と免疫複合体を形成することができます。次に、複合体は固体支持体(通常はセファロースビーズに結合したタンパク質A)に捕捉されます。捕捉されなかったタンパク質は、遠心分離ステップによって除去されます。その後、タンパク質は抗体と固体支持体から放出され、還元SDS-PAGEサンプルローディングバッファーで沸騰します。
共免疫沈降も同様に行われますが、無傷のタンパク質複合体が固体支持体に捕捉される点が異なります。抗体は標的タンパク質に結合し、さらに標的タンパク質は抗体が標的としない別のタンパク質に結合します。免疫沈降と同様に、タンパク質複合体は、SDS-PAGEサンプルローディングバッファーを減少させることで沸騰することにより、抗体および固体支持体から放出されます。
プルダウンアッセイは共免疫沈降と似ていますが、抗体とは対照的に「ベイト」タンパク質を使用する点のみが異なります。分子生物学的手法により、このベイトタンパク質は、一連のヒスチジン残基などのアフィニティータグを使用して操作されます。これらのアフィニティータグについては、「クロマトグラフィーベースの生体分子の分離」で説明しています。次に、タンパク質は、タグに特異的に固定化されたアフィニティーリガンドに捕捉されます。次に、捕捉されたタンパク質を、「餌」と複合体を形成するタンパク質を含むサンプルとインキュベートします。タンパク質複合体は、「ベイト」タンパク質のタグに特異的な競合分析物を含む溶液で洗浄することにより、アフィニティーサポートから放出されます。プルダウンアッセイは、共免疫沈降によって予測されるタンパク質相互作用の確認や、未知のタンパク質相互作用の発見に有用です。
さて、共免疫沈降法とプルダウンアッセイの原理について説明したので、その実験手順を見てみましょう。
まず、共免疫沈降についてお話ししましょう。一連のマイクロチューブに、PBSバッファーと、抗体に結合する樹脂-タンパク質複合体であるタンパク質A-セファロースの50%溶液を添加します。マイクロフュージチューブを回転させて適切な分布を確保し、その後、レジンを追加のPBSバッファーで洗浄します。所望のタンパク質を含む細胞溶解物および2μgの抗体をマイクロフュージチューブに添加し、混合物を4μCで1時間回転させる。ビーズを遠心分離によりペレット化し、上清を廃棄し、ビーズをバッファーで3回再洗浄して非結合タンパク質を除去します。抗体-タンパク質複合体を含むビーズは、抗体からの複合体の除去、およびSDS-PAGEおよびイムノブロッティングによる分析のために、SDS-PAGEサンプルローディングバッファーを還元します。
次に、プルダウンアッセイの手順について説明します:「ベイト」タンパク質は、適切なアフィニティータグを持つプラスミドで発現されます。対数期の増殖に達した後、細胞を溶解し、次に遠心分離します。懸濁したストレプトアビジン-セファロースビーズは、ビオチンタグ付きの「ベイト」タンパク質を捕捉し、マイクロチューブにピペットで移します。次に、ビーズを遠心分離し、上清を吸引して慎重に除去します。次に、ビーズをバッファーで洗浄し、遠心分離し、上清を取り除きます。
「餌」タンパク質に親和性を持つ推定される「獲物」タンパク質を含む細胞は、遠心分離によって回収されます。次に、上清を樹脂を含むマイクロチューブに加え、4 ?シェーカーで3時間C。次に、レジンを遠心分離し、上清を取り除き、レジンを洗浄して非結合タンパク質を除去します。溶出緩衝液を樹脂に添加し、混合物を室温で30分間シェーカー上でインキュベートします。次に、樹脂を遠心分離し、目的の複合体を含む上清をイムノブロッティングで分析します。
手順を確認したので、共免疫沈降とプルダウンアッセイの有用なアプリケーションをいくつか見てみましょう。
共免疫沈降は、酵素の作用機序をより深く理解するのに役立ちます。ミクソウイルス(Mx)耐性タンパク質は、インフルエンザAを含む広範囲のウイルスを阻害しますが、そのメカニズムはよく理解されていません。共免疫沈降法を用いて、マウスMx1タンパク質とインフルエンザ核タンパク質との相互作用を研究しました。
プルダウンアッセイは、細胞環境からのシグナルを伝達するタンパク質であるセカンドメッセンジャーの影響を研究する上で有用であることが証明されています。これらは、環境の合図に応答して複数のタンパク質が相互作用するシグナル伝達経路の構成要素です。カルシウムイオンは、カルモジュリンに結合することで二次メッセンジャーとして作用し、カルモジュリンは多種多様なタンパク質に結合して、さまざまな種類の生物学的応答を媒介します。カルシウムがなければ、タンパク質はカルモジュリンに結合できません。カルシウムイオンの存在下または非存在下でタンパク質がカルモジュリンに結合する能力をテストするために、プルダウンアッセイを実施しました。
共免疫沈降およびプルダウンアッセイは、一般に、安定または強力なタンパク質相互作用の分析に使用されますが、一過性の相互作用は使用されません。プルダウンアッセイの最近の開発であるHaloTagは、一過性タンパク質相互作用の研究を簡素化しました。HaloTagは、遺伝子にコードされたタンパク質融合タグで、目的のタンパク質に融合し、ハロアルカン固体支持体と化学的に反応することができます。機能解析が必要な場合は、タグを除いたタンパク質複合体全体を、タバコエッチングウイルスプロテアーゼとインキュベートすることで単離できます。
JoVEの共免疫沈降およびプルダウンアッセイに関するビデオをご覧になりました。このビデオでは、2つの方法の原理、一般的なラボ手順、およびそれらのアプリケーションの一部について説明しました。
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