Ex Vivoイメージング実験アダルト ゼブラフィッシュから準備新鮮な網膜スライス

この手順の全体的な目標は、蛍光タンパク質やバイオセンサーのライブイメージングを必要とする実験のために、ゼブラフィッシュの網膜の新鮮なスライスを準備することです。この方法は、特定の細胞タイプや網膜内の細胞コンパートメントにおけるカルシウムイオンの生理学的および代謝的役割など、視覚研究の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、生体組織の主要な代謝物とシグナル伝達分子に関する空間的および時間的情報を提供することです。

ゼブラフィッシュから網膜色素上皮(RPE)を除去するために、組織スライスを作成する前に1時間魚を暗順応させます。スライスチャンバーの場合は、スライドにマニキュアのラインをペイントします。透明なマニキュアを使用して、細い線をペイントして長方形を作成します。

乾いたら一度ポリッシュを塗り直します。チャンバーを静的イメージングや最小限の溶液流量での注入実験に使用する場合は、シリンジを使用して、長さ1cm、間隔0.5cmの2本の平行なワセリンをカバーガラスに塗布します。次に、ブレードを準備します。

まず、両刃のカミソリをエタノールで洗浄し、自然乾燥させます。次に、はさみを使用して約1センチメートルの小片に切ります。次に、スライスチャンバーをティッシュスライサーのステージに置き、ステージの中央に水平に配置し、長辺に位置合わせ用の油性マーカーで印を付けます。

次に、ブレードの一部をスライサーアームにロードします。刃を固定して、エッジがスライドの中央を超え、スライド面と平行に走るようにしますが、マニキュアには触れないようにします。次に、4分の1回転させてブレードアームを下げます。

では、濾紙をスライスしてみます。必要に応じてブレードを再度取り付けます。続行するには、シリンジを使用して、中点から約1.5センチメートルの10センチメートルの皿にゼリーの単一の小さな点を沈殿させます。

次に、鉗子を使用してカバースリップの乾いた面をゼリーに押し込みます。次に、イメージングチャンバーの入口端から約1センチメートルのところにゼリーの小さな点をもう一つ入れます。次に、20ゲージの針を使用して、スライスチャンバーの中心に沿って縦に約1センチ間隔で長さ1センチメートルのワセリンの細い平行ストリップを2つ作成します。

次に、ゼブラフィッシュを皿に移し、首を切らずに魚を頸椎脱臼させます。次に、ワイヤーループを使用して片方の目の周りの結合組織を緩め、次に目をそっと前方に引きます。次に、目の下の白い視神経をマイクロハサミで丁寧に切りますが、目の奥は切らないようにします。

続行するには、氷の上の冷たいリンガー溶液の皿に目を移します。次に、もう一方の目を収穫します。すべてのRPEが取り外されるまで、赤信号の下で作業を続けます。

次に、片方の目をペトリ皿の上のスライドガラスの上の冷たいリンガー溶液の滴に移します。次に、皿を低倍率の解剖顕微鏡の下に置き、赤色光の下でアイカップを解剖します。まず、細かい鉗子で角膜に穴を開けます。

次に、鉗子とはさみを使用して、透明で脆い角膜と銀色の強膜の破片をやさしく取り除きます。次に、レンズを取り外して廃棄し、ほとんどの強膜をアイカップを分離します。最小限の取り扱いで、網膜を取り外すことなく、アイカップに付着したままの脂肪や強膜の断片をすべて取り除きます。

網膜がRPEから分離する場合は、繊細な網膜を損傷しないように細心の注意を払って進めてください。次に、開いた面を下にしてアイカップの位置を変え、新しいブレードで3分の1または4分の1にカットします。湾曲しすぎて平らにならないアイカップの部分を捨てます。

これらのピースは、いずれにせよ小さすぎて役に立たないことがよくあります。網膜切片を取り付けるには、濾紙をリンガー溶液で濡らし、平らな鉗子を使用してアイカップピースの隣に置きます。次に、濾紙とティッシュを冷たいリンガー溶液に浸します。

次に、鉗子を使用して、RPEと光受容体を上にして、濾紙の上に網膜片を配置します。アイカップピースの端を細い鉗子で優しく扱い、濾紙の中央に一本の線を向けます。次に、鉗子を使用して網膜を取り付けた濾紙を持ち上げ、乾いたペーパータオルの上に置いて、網膜を平らにします。

約3秒間、ペーパータオルに液体を吸い上げる力で網膜を平らにします。この方法ですべての網膜片を処理し、乾燥させないでください。次に、リンガー溶液を一滴塗布し、細い鉗子を使用して、組織から残っているRPEの黒いシートを剥がします。

そっと剥がし、網膜が紙から浮き上がったら、前と同じようにさらに溶液を吸い取ると、再び平らになるはずです。次に、網膜ピース付きの紙をスライドに移し、ティッシュの列の両側に約0.5センチメートル残して紙を長方形にトリミングします。次に、濾紙を準備したスライスチャンバーに移動します。

鉗子を使用して長い濾紙の端を細いワセリンの線に押し込み、次に網膜を冷たいリンガー溶液の3〜4滴に浸します。まず、調製物をティッシュスライサーステージに移します。マークされた線に沿って長い方の端を配置し、チャンバーの端を実験室用テープでステージに固定します。

次に、一方の端から始めて、網膜をカットし、スライスアームにしっかりと穏やかな圧力で濾紙を濾過します。最初のスライスが完全にカットされたことを確認してから、マイクロメータを使用して約400ミクロンの厚さのスライスをカットします。次に、スライスされた部分を持つチャンバーを、準備したカバースリップを含むシャーレに移し、これはイメージングのはしごとして機能します。

冷たいリンガー溶液を皿に浸し、解剖顕微鏡のステージに置きます。次に、低倍率で、鉗子を使用してストリップを固定し、下にあるペトリ皿をスライドさせてイメージングはしごに移動します。スライスを90度回転させ、濾紙の端をゼリーに埋めます。

網膜を水没させ、網膜に直接接触しないようにすることが重要です。次に、網膜層がはっきりと見えるように、はしごのスライスを再配置します。はしごの両端にあるスライスについては、網膜を他のスライスに向けて内側に向け、注射またはフロー中の動きを最小限に抑えます。

紙にしっかりと付着していないスライスは捨ててください。次に、ティッシュを染色します。その間に、イメージングチャンバーと注入装置を準備します。

まず、気泡がなくなるまでチューブをリンガー溶液で洗い流します。次に、チューブをイメージングチャンバーインレットに取り付け、ストップコックを閉じます。その後、注射器に注射用溶液を補充し、チューブに再取り付けします。

次に、鉗子を使用して、準備したイメージングラダーをイメージングチャンバーに移します。それを入口の端近くのゼリーの点に押し込み、チャンバーにリンガー溶液を充填してスライスを覆います。その後、イメージングを進めます。

記載された技術を使用して、完全に横切られたスライスを、すべての網膜層を通して画像化することができる。少し回転させると、外側のセグメントの束が見えます。PI染色を用いることで、死んだ細胞を解析から排除することができます。

健康なPI陰性光受容体は、ステレオタイプの分極した細長い形態を持っています。酸素化リンガー病では、最大4時間画像化できます。イメージング戦略の1つは、核に対する錐体光受容体小胞体のダイナミクスを視覚化することです。

GFPを発現する組織と錐体ERを使用し、核色素で対比染色します。同様の戦略を用いて、GFP融合アクチンを発現する組織を有するアクチン細胞骨格を観察することができる。タイムラプスイメージングを用いることで、錐体視細胞内の細胞質カルシウムの揺らぎなどの細胞動態を観察することができます。

例えば、GCaMPはイメージングチャンバー内のナトリウムを等張的に枯渇させながら、細胞質カルシウム濃度の上昇を可視化することができます。単一錐体外セグメント、細胞体、シナプスからの蛍光応答を定量化することにより、薬理学的操作などにおいて細胞内カルシウム動態を決定することができる。この手順を試行するときは、RPEを取り外す前に赤色のライトを使用することを忘れないでください。

スライスする前にアイカップを慎重に平らにし、スライスを常に水に浸しておきます。習得すれば、組織の解剖、スライス、イメージングの準備を30分以内に行うことができます。このビデオを見れば、ゼブラフィッシュから網膜スライスを調製して代謝を研究する方法や、細胞コンパートメント内の特定の細胞タイプの生理機能を十分に理解できるはずです。