対象に次世代シーケンサーとバイオインフォマティクス パイプライン体質性疾患の遺伝的決定因子を評価するには

ターゲット次世代シーケンシングの全体的な目標は、特に関心のあるゲノム領域に焦点を当てることにより、さまざまな体質疾患の遺伝的決定要因を解明することです。この方法は、特に以前に既知の遺伝的関連性がある場合に、病気の遺伝的イデオロギーに関する重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法は非常に効率的です。

短期間で数百万回の読み取りを生成し、比較的低コストで取得でき、特に他の次世代シーケンシングアプローチと比較すると、計算負荷が比較的低くなります。この技術の意味は、表現型的および遺伝的に不均一であるが、多くの既知の関連する遺伝的遺伝子座を持つ神経変性疾患の診断にまで及びます。この方法は特に神経変性疾患を対象としていますが、以前に関心のあるゲノム領域が特定されている他のさまざまな体質疾患にも適用できます。

一般に、この手法を初めて使用する人は、最終的な希少バリアント解析に必要なバイオインフォマティクス処理が計算量が多く、多くのエラーの原因を生み出す可能性があるため、苦労するでしょう。この手順では、ヒトの血液サンプルを3本、4ミリリットルのEDTA K2チューブに収集して、総量約12ミリリットルを提供します。血液サンプルを重力の750倍で20分間遠心分離します。

これにより、各サンプルが血漿の上相、白血球の薄い中相、赤血球の下相に分画されます。使い捨てのトランスファーピペットを使用して、血液サンプルの上部から血漿をピペットで取り出します。複数の500マイクロリットルのアリコートに分注し、将来の生化学分析のために摂氏マイナス80度で保存します。

製造元の指示に従って、血液抽出キットを使用して血液サンプルからDNAを抽出します。抽出されたDNAは、次世代シーケンシングのためのシーケンシングライブラリーを調製するために使用されます。シーケンス実行が完了したら、コンピューターで、ナビゲーション パネルで [実行] を選択して、クラウドベースのコンピューティング環境内のファイルを見つけます。

適切なシーケンシングランを選択して、ランサマリーページに移動します。[ダウンロード] を選択して、クラウドからデータを取得します。表示されるダイアログボックスで、ダウンロードするファイルタイプとしてFASTQファイルを選択し、[ダウンロード]をクリックします。

クラウドベースのコンピューティング環境の「Run Summary」ページから、「Charts」にナビゲートして、コンピューティング環境によって生成されたさまざまな図を使用してシーケンシング実行の品質を分析します。[Run Charts] ページで [Data By Cycle] とラベル付けされた図を見つけ、[Chart] で [Intensity] を選択し、[Channel] で [All Channels] を選択して信号強度プロットを作成します。「Run Navigation」パネルで「Indexing QC」タブを選択し、ページの右側にある「Indexing Quality Control」ヒストグラムを見つけます。

クラウドベースのコンピューティング環境の「実行サマリー」ページで、「実行」ナビゲーション・パネル内の「メトリック」をクリックして、品質メトリックに移動します。[Density kelvin per millimeter squared] で、シーケンシング実行のクラスター密度が、使用するエンリッチメントキットが推奨する範囲内にあることを確認します。この場合、ミリメートルの二乗あたり1, 200から1, 400ケルビン

Total Percent greater than or equal to Q30] で、シーケンシング読み取りの品質を反映した値が 85% 以上であることを確認します。「Aligned」で、値がシーケンシング実行に含まれたポジティブコントロールのパーセンテージと類似していることを確認します。たとえば、1% のポジティブ コントロールを使用した場合、予想される位置合わせされたパーセントは約 1 から 5% になり、小数点以下数桁以内の変動が許容されます。

このプロセスは、FASTQシーケンシングリードをデータ処理ソフトウェアにインポートすることから始めます。ナビゲーション領域内で、右クリックして[新しいフォルダ]を選択します。実行されたシーケンス実行が明確になるように、フォルダーに名前を付けます。

上部のツールバーから [インポート] を選択し、ドロップダウン リストからシーケンシングが実行されたプラットフォームを選択します。ONDRISeqの目的のために、Iluminaが選択されます。ダイアログボックスで、処理中のシーケンシング実行からFASTQファイルに移動して選択します。

ダイアログボックスの[一般]オプションで、[シーケンシングでペアの末端ケミストリーが使用された場合のペアリード]の横にあるボックスをクリックします。ダイアログボックスのペア読み取り情報から、ファイルリストでフォワードリードFASTQファイルがリバースリードの前に表示される場合は、[ペアエンド]を選択します。[ペアの読み取りの最小距離] を 1 に、最大距離を 1000 に設定します。

ダイアログボックスの Ilumina オプションから、「失敗した読み取りの削除」を選択します。[Quality score] ドロップダウンリストから、シーケンシングに使用した NGS パイプラインを選択します。ダイアログ ボックスの下部にある 次へ を選択します。

[保存] を選択し、バッチ単位ごとにサブフォルダーを作成します。ダイアログ ボックスの下部にある 次へ を選択します。以前に作成したフォルダを選択します。

ここでFASTQファイルがインポートされます。ダイアログボックスの下部にある[完了]を選択し、FASTQファイルがインポートされるまで待ちます。「プロセス」タブをクリックして、ファイルのインポートのステータスを確認します。

次に、ソフトウェア内でワークフローを設計し、メーカーの指示に従ってリシーケンシングとバリアントコールを実行します。リシーケンシングとバリアントコールのワークフローの設計は、この手順の最も難しい側面です。私たちのチームはベストプラクティスを調査し、試行錯誤を重ねて、私たちのニーズに合った最も堅牢なワークフローを考え出しました。

インポートしたFASTQシーケンシングリードファイルをカスタマイズされたバイオインフォマティクスワークフローで実行するには、まずソフトウェアのツールボックスでワークフローを特定し、ダブルクリックします。表示されるダイアログボックスで、ナビゲーション領域内にインポートされたFASTQファイルのフォルダを見つけます。ナビゲーション領域内ですべてのフォルダを選択して強調表示し、[バッチ]の横にあるボックスをクリックします。

右向きの矢印を使用して、選択した要素にファイルを移動します。ダイアログボックスの下部にある「次へ」をクリックします。ダイアログボックスでバッチの概要を確認し、正しいFASTQファイルが選択されていることを確認してから、[次へ]をクリックします。

ダイアログボックス内でワークフローの手順を見直し、ワークフローの設計時に正しいファイルとエクスポート場所が選択されていることを確認します。これらの手順には、参照シーケンスへのリードのマッピング、重複するマッピングリードの削除、ターゲット領域の統計の作成、BAM ファイルのエクスポート、タブ区切りテキストのエクスポート、オーバーラップに基づくフィルタリング、VCF ファイルのエクスポートが含まれます。ダイアログボックスの最後のステップである[結果の処理]で、[入力フォルダに保存]オプションを選択します。

ダイアログボックスの下部にある「完了」をクリックします。最後のステップは、テキストプロトコルで説明されているように、各サンプルのVCFファイルに対してバリアントアノテーションを実行することです。このビデオで示した方法論は、ONDRIに登録された個人の528人の参加者DNAサンプルに適用されました。

サンプルは、ONDRISeq パネルで 24 サンプルを 22 回実行しました。全体として、シーケンシングデータは、平均サンプルカバレッジが78回で高品質であると判断されました。平均95.6%のリードが参照配列と一致し、すべてのONDRISeqランで90%を超えるリードがマッピングされていました。

マッピングされた読み取りのうち、92.0%で、Phred スコアが Q30 以上。このターゲット NGS ワークフローの有用性を実証するために、パーキンソン病患者の 68 歳の男性の例を示し、N オーバーアウトプットの減少を示します。注釈付きの分散は、赤いボックスで示されているように、臨床的に重要である可能性が最も高いものを特定するためにキュレーションされます。

この手順を実行する際には、シーケンシングプラットフォーム、使用された濃縮キット、および研究のニーズに適切に対応するための手順を忘れないようにすることが重要です。開発後、この技術は、遺伝学の分野の研究者が、全エクソームや全ゲノムの対応物よりも安価でありながら、高品質の領域特異的データを取得する道を開きました。