CRISPR/Cas9 によるマウスおよび人間の造血前駆細胞の高効率遺伝子破壊
2018年4月10日
高速のためのプロトコル マウスに CRISPR/Cas9 を介した遺伝子破壊とひと造血細胞はこの資料に記載されています。Cas9 sgRNA ribonucleoproteins は、sgRNAsの in vitro転写と商業 Cas9 を介して生成されたとエレクトロポレーションを介して紹介しています。限られた時間と金銭的コスト高の編集効率を実現します。
このプロトコルの全体的な目標は、リボ核タンパク質アプローチを使用して、CRISPR/Cas9および初代造血前駆細胞を通じて迅速かつ効率的な遺伝子破壊を達成することです。この方法は、遺伝子X.Theの主な利点の喪失の分子的および表現型の結果は何かなど、正常および悪性の造血の分野における重要な質問に答えることができます。実験の構想から実行までに必要な推定時間は1週間未満です。
この方法は造血前駆細胞に最適化されていますが、初代T細胞、マウスおよびヒト造血細胞株、初代白血病サンプルなど、他の細胞タイプにも適用できます。この方法を最初に思いついたのは、プラスミドやウイルスなど、他のCRISPR/Cas9デリバリーアプローチが細胞に毒性があるか、ターンアラウンドタイムが遅いことに気付いたときでした。目的のシングルガイドRNAをデザインするには、まずCRISPRscanのウェブサイトにアクセスしてください。
目的の細胞に基づいて、[Mouse]または[Human]ボタンを押し、UCSCの検索ボックスに目的の遺伝子を入力して[Go]をクリックします。次に、ターゲットにしたいエクソンを拡大します。遺伝子のCRISPRscan予測の見出しの下に、シングルガイドRNAターゲット配列がリストされているかどうかを確認します。
次に、緑色の長方形でラベル付けされたターゲットシングルガイドRNAをクリックし、オリゴ配列の下に表示されている全配列をコピーします。次に、シーケンスをテキストドキュメントに貼り付けます。次に、ヌクレオチドATAGCを配列の3つのプライムエンドに追加します。
全長シーケンスを注文します。次に、シングルガイドRNAのDNAテンプレートを合成するために、シングルガイドRNAフォワードプライマーとユニバーサルリバースプライマーを溶解してから希釈します。次に、PCRチューブ内のすべての試薬を添加して、オーバーラップPCRを実行します。
PCR反応を構成した後、チューブをサーモサイクラーに入れ、プログラムを実行します。プログラムが終了したら、DNA精製カラムを使用してPCR産物を精製します。DNAを11.5マイクロリットルの溶出バッファーで希釈します。
次に、溶出バッファーをブランクとして分光光度計で使用します。分光光度計でサンプルDNAの濃度を測定します。まず、溶出したDNA、デオキシヌクレオチドリン酸、反応バッファー、T7 RNAポリメラーゼ酵素ミックスをPCRストリップチューブで混合します。
次に、サンプルを摂氏37度で4時間インキュベートします。次に、RNase洗浄剤を塗布して、使用中の手袋からRNaseを取り除きます。次に、ヌクレアーゼフリーの水で各RNAサンプルの容量を50マイクロリットルに調整します。
製造元の指示に従ってRNAを精製します。最後に、50マイクロリットルのヌクレアーゼフリー水でRNAを溶出します。まず、ヌクレアーゼフリーの水を使用して分光光度計をブランクにし、溶出したRNAの濃度を測定します。
トリパンブルーの除外を使用して、セルの数をカウントします。各反復について、反復ごとに200, 000の生存細胞を収集し、次にリン酸緩衝生理食塩水を加えて細胞を洗浄します。次に、チューブを300倍gで7分間回転させます。
遠心分離後、上清を慎重に取り除きます。遠心分離の過程で、1.5 μgのCas9と1 μgの総シングルガイドRNAをPCRチューブ内で20〜30分間インキュベートします。これは、各複製に対してCas9-sgRNA RNP複合体を調製するためです。
必要な再懸濁緩衝液Tの容量を計算した後、再懸濁緩衝Tで得られた細胞ペレットを溶解し、次に、Cas9-sgRNP複合体を含むPCRチューブに溶解した細胞懸濁液10マイクロリットルを加えます。次に、エレクトロポレーションユニットのスイッチを入れます。キュベットをキュベットホルダーにスライドさせます。
次に、3ミリリットルのバッファーを追加しますE.エレクトロポレーションデバイスの条件を設定します。エレクトロポレーションを行うには、まずエレクトロポレーションピペットを持ち、次に爪を伸ばしてピペットチップ内のディスクをつかみ、ピペットをしっかりと押し下げてチップを固定します。次に、サンプルをピペッティングで10回上下させて混合します。
サンプルを10マイクロリットル引き出し、気泡がないことを確認します。次に、チップをエレクトロポレーションキュベットの電解バッファーに直接挿入します。次に、画面上の[開始]をクリックします。
完全なメッセージを画面に表示します。次に、ピペットをキュベットから取り外します。次に、キュベットから内容物を新しいHSPC培地で満たされたウェルに分注します。
Cas9-sgRNP エレクトロポレーションの有効性を調べるために、マウスから単離した HSPC を GFP または tdTomato を標的とするシングルガイド RNase でエレクトロポレーションします。これらのHSPCは、GFPまたはtdTomatoをユビキタスに発現していました。フローサイトメトリー解析では、HSPCにおけるGFPまたはtdTomatoの発現がタンパク質レベルで約75%および74%失われていることが示されています。
次に、エレクトロポレーション細胞のGFP遺伝子座からPCR増幅されたDNAを用いて、T7エンドヌクレアーゼ1ベースのアッセイを行います。これは、GFPの遺伝子破壊効率を定量化するためです。ImageJソフトウェアを使用して、劈開されたバンドと切断されていないバンドの強度の比率を計算し、劈開の割合を計算します。
ヒトCD45を標的とする3つの異なるシングルガイドRNAの効率をHL-60 AML細胞株で試験しました。フローサイトメトリーは、シングルガイドRNA1がコントロールと比較して98%のノックアウト効率を持つ最も効率的なものとして示されています。次に、CD45ノックアウトは、シングルガイドRNA1を使用して、一次ヒト臍帯血CD34陽性HSPCでも行われます。
フローサイトメトリー解析では、Cas9のみと比較して、CD34の発現に変化がなく、ほぼ80%の細胞がCD45を失っていることが示されています。ヒトCD45ノックアウトHSPCの生着を研究するために、CD34陽性の眼窩後トランスフェクションNSGマウスから骨髄および脾臓細胞を採取して解析し、編集された細胞をHLA-ABC陽性およびCD45陰性として示しました。一度習得すると、このプロトコルは修正して実行すれば、3日で完了することができます。
この手順を試みる際には、すべての表面と試薬をRNaseフリーに保ち、複数の手法で効率的な遺伝子破壊を検証し、適切な実験コントロールを使用することを覚えておくことが重要です。このビデオを見れば、Cas9-sgRNAリボ核タンパク質を設計、合成、造血前駆細胞にトランスフェクションして、迅速かつ効率的な遺伝子破壊を得る方法について十分に理解できるはずです。
概要
本記事では、リボ核タンパク質（RNP）アプローチを用いた、マウスおよびヒトの一次造血細胞におけるCRISPR/Cas9媒介の迅速な遺伝子破壊プロトコルについて解説します。この手法により、最小限の時間とコストで高い編集効率を実現することが可能です。
研究の主要構成要素
科学分野
- 遺伝子編集
- 造血細胞生物学
- CRISPR/Cas9技術
背景
- CRISPR/Cas9は、遺伝子破壊のための強力なツールです。
- 造血幹細胞・前駆細胞（Primary hematopoietic cells）は、造血研究において極めて重要です。
- 従来のCRISPR導入法は、毒性があるか、あるいは効率が低い場合があります。
- 本プロトコルは、効率の向上とコストの削減を目的としています。
研究目的
- 迅速かつ効率的な遺伝子破壊法を開発すること。
- 造血前駆細胞における遺伝子欠損の影響を調査すること。
- さまざまな細胞型に適用可能なプロトコルを提供すること。
使用された手法
- CRISPRscanを用いたシングルガイドRNAの設計
- RNAの合成およびCas9-sgRNAリボ核タンパク質（RNP）複合体の調製
- RNP複合体を用いた初代造血細胞へのエレクトロポレーション
- フローサイトメトリーおよびT7エンドヌクレアーゼアッセイによる遺伝子破壊効率の評価
主な結果
- HSPCにおいて、標的遺伝子の発現を約75%抑制することに成功した。
- HL-60 AML細胞株において、98%のノックアウト効率を実証した。
- ヒト臍帯血一次細胞において、効果的な遺伝子破壊を示した。
- NSGマウスにおいて、編集済み細胞の生着を確認した。
結論
- このプロトコルは効率的であり、1週間以内に完了させることが可能です。
- さまざまな造血細胞種に適用できます。
- 成功のためには、RNaseフリーの状態を維持することが極めて重要です。
よくある質問
産業界への実用的意義
初代造血細胞における効率的な遺伝子破壊は、血液疾患の創薬における迅速なターゲット検証とメカニズムのリスク低減を可能にします。リボ核タンパク質CRISPR/Cas9アプローチは、外来DNAを用いることなく高いノックアウト効率を実現することで生物学的不確実性を低減し、初期のターゲット選定における予測の信頼性を高めます。このワークフローは、疾患に関連する造血系における機能ゲノミクスにスケーラブルで費用対効果の高い手法を提供し、オンコロジーおよび免疫学プログラムの探索期間を短縮します。
バイオ医薬品R&Dにおける戦略的活用
初期発見およびターゲットバリデーション
- 科学的価値： マウスおよびヒトの初代造血前駆細胞における迅速な遺伝子ノックアウトにより、治療仮説の検証を可能にする。
- 実用的価値： AML細胞株で最大98％、ヒト臍帯血由来の初代HSPCで80％のノックアウト効率を達成し、生物学的なリスク低減を支援する。
- 戦略的価値： 疾患関連システムにおける遺伝子欠損表現型の迅速な評価を可能にし、ターゲットへの信頼性確認およびポートフォリオの選別を促進する。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 科学的価値： 下流の化合物スクリーニングおよび表現型解析に使用するための、検証済みノックアウト造血細胞を調製します。
- 運用的価値： RNPエレクトロポレーションによる標準化され再現可能な遺伝子破壊を実現し、フローサイトメトリーによる定量的な解析およびT7エンドヌクレアーゼアッセイによる判定を行います。
- 戦略的価値： 原代細胞、細胞株、および原代白血病サンプルにわたるスケーラブルなプラットフォーム利用を可能にし、一貫したターゲット検証を実現します。
トランスレーショナル・前臨床研究
- 科学的価値： 編集済みヒトHSPCsのNSGマウスへの生着を実証し、発見から前臨床検証までのトランスレーショナルな連続性を裏付ける。
- 運用の価値： 標的検証研究の前臨床スケジュールに適合した、効率的な3日間のワークフローを提供する。
- 戦略的価値： 造血系標的におけるメカニズムの曖昧さを軽減し、腫瘍学および免疫学のパイプラインにおけるリスク調整後の開発判断を可能にする。
パイプラインおよびワークフローの統合
この手法は、ターゲットの同定からリード最適化に至る創薬の連続的なプロセスに組み込まれ、化合物スクリーニングに先立つ造血系ターゲットの迅速な機能的検証を可能にします。
- ディスカバリーバイオロジー：一次造血細胞における効率的な遺伝子破壊により、仮説検証およびパスウェイの解明を支援します。
- スクリーニング：高い再現性と定量的なアウトプットを備えた、アッセイ可能なノックアウトモデルを提供し、信頼性の高い化合物評価を実現します。
- 分析：フローサイトメトリーおよびT7エンドヌクレアーゼアッセイを通じて測定可能な編集効率を算出し、条件間の比較分析を可能にします。
- トランスレーショナルリサーチ：編集済みHSPCのin vivoにおける生着を実証することで、基礎研究から前臨床検証への橋渡しを行います。
- エンタープライズ再利用：造血系モデル全般に適用可能な再利用可能なCRISPR/Cas9 RNPプラットフォームを確立し、冗長なプロトコル開発を削減します。
運用および企業への影響
- 科学的価値： ターゲット検証における予測精度の向上、メカニズムの曖昧さの軽減、およびDNA組み込みを伴わない高忠実度な遺伝子破壊。
- 運用的価値： 初代細胞および形質転換造血細胞における遺伝子編集の標準化、再現性、およびスケーラビリティ。
- 戦略的価値： 血液疾患治療薬プログラムにおけるgo/no-go決定の改善、資本効率の向上、および後期段階における生物学的リスクの軽減。
- ポートフォリオへの影響： 高速かつ高効率なターゲットノックアウトデータに基づく、リスク調整後の優先順位付けおよび推進決定。
実施上の検討事項
- 分子クローニング、RNA操作、およびエレクトロポレーション技術の専門知識が必要です。
- 検証のため、サーマルサイクラー、分光光度計、エレクトロポレーション装置、およびフローサイトメトリーへのアクセスが不可欠です。
- RNPの安定性と編集効率を確保するため、RNaseフリーの環境および標準化された試薬操作が必要です。
- 多様な造血モデルおよび標的遺伝子に合わせて、ガイドRNAの設計の調整と最適化が必要です。
- 実際上の制限：効率は細胞型や標的遺伝子座によって異なる可能性があるため、目的の遺伝子ごとに実証的な検証が必要です。
