Name: そのまま子豚脳内麻酔神経毒性の研究のための微小電極アレイ技術の適応 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 23 s
Description: 学ぶ 酵素微小電極アレイ技術を用いて新生子豚の脳内グルタミン酸動態をリアルタイム測定し、麻酔誘発神経毒性のメカニズムを解明する方法。臨床的に関連性の高い動物モデルで神経伝達物質の時空間分解能に優れた測定が可能です。

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著者らは、電極技術 (CenMeT) のためのケンタッキー大学センターと、オハイオ州立大学研究所動物リソース センター (ULAR) の貢献を認めると思います。

子豚 (イノシシ) は、オハイオ州立大学 (OSU) 機関動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) によって事前承認されたローカル ファームを通じて受信されます。次のプロトコルの承認、動物実験は IACUC ポリシーに従って行われています。
1. 豚と子豚の処理
<ol><li>あらゆる潜在的な性による交絡因子に到着ガイドライン第19を排除するために体系的かつ無作為にオスとメスの豚を利用します。 注: 最大の脳の成長の期間は、子豚の誕生の 3-5 日以内は、実験が 3-5 日齢の子豚でのみ行われます。</li>
	<li>豚ビバリウム、少なくとも 24 の実験環境に順応できるようにする前に h に到着を確認します。 注: 訓練された獣医のスタッフは日常的動物のケアを提供します。豚は個別に温度管理、継続的に監視対象のケージで保持され、低血糖を防ぐために栄養完全ミルク代用自由を受け取る。豚麻酔前に少なくとも 3 時間の代用乳 (os ごと nil) なしもし、毛布と刺激の正常なレベルを確保するためのおもちゃが付属します。可能であれば、社会化を許可するように同じケージで複数の子豚を維持します。</li>
</ol>2 開発とピグレット モデルのアイン学測定のカスタマイズ
注: この技術は、酵素でプレコート、m-フェニレンジアミン二塩酸塩 (mPD) 電気めっき酵素法による測定を使用します。電極は、40 mm 硬質シャフト設計し、子豚 (図 1) で使用するために製造されたカスタム.
<ol><li>冗長性を避けるためには、MEA 作製し校正の詳細については、前述したように15 (図 2) を参照してください。</li>
</ol>3. 麻酔と子豚のカスタムの脳定位固定装置の使用
<ol><li>麻酔ワークステーションを用いた適切な人工呼吸器、監視装置、動物を麻酔し、パルス酸素濃度計、非観血的血圧、心電図、全体温度など生理学的パラメーターを監視、実験の全体は、19を前述しました。挿管し換気、子豚および 3.5 h. 訓練された実験室のスタッフのメンバーは、これらの実験の存在確認のため 1 最小肺胞内濃度 (MAC) (約 2.5-3%) におけるセボフルラン麻酔を管理します。外科領域を覆う毛皮は、皮膚の準備の前に電気バリカンを使用して削除されます。 注: 濃度と使用する麻酔薬の時間は、手術中に実際の麻酔の露出の時間をシミュレートする実験をことができます。また、セボフルランは最も一般小児人口周囲の最も重要な安全性調査を行うことで全身麻酔に利用です。</li>
	<li>脳定位固定装置のフレームに配置される前に 2.5 mg/kg、1.5 mg/kg の投与を読み込みロクロニウムを開始/フレームに保護動物の動きを防ぐために h。<ol>
<li>つま先ピンチによって麻酔の十分な深さを確認したら豚特有の固定フレームに子豚を配置します。</li>
		<li>(例えば、流動ポジショナ) 褥瘡を防ぐために追加のパディングと強制空気地球温暖化パッドに子豚を置くことによって脳定位固定装置のフレーム内の十分なパディングを提供します。</li>
		<li>上部顎の歯を歯にかぶせますバー (図 3)。 注: 歯バーは非常にしっかりと場所で頭蓋骨を保持するのに十分なレベルでする必要があります。</li>
		<li>修正、子豚が正中線の位置にあるように世話耳内貫通イヤバーを締めます。耳と耳の鼓膜の浸透に関連付けられている「ポップ」の音を聞くことしっかりと十分なバーの挿入内の保持する横方向の先の尖った先端の位置。しっかりと頭蓋骨に耳バーをアタッチし、(図 4、パネル A) 実験中に頭蓋骨の動きを防ぐために両側に等しい深さに挿入します。 注: それは子豚を暖かく保つために極めて重要な (~ 37.8-38.6 ° C) 常温療法の維持のための全体の手順中に温度を継続的に監視し、。これは達成を介して毛布からや熱ランプをすることができます。動物の皮膚の燃焼を避けるために適切な距離で熱ランプを配置することを確認します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>メスと頭蓋骨を得点を避けるために注意を使用して頭蓋骨に沿って 4-6 cm 正中切開を作成します。切開は、頭皮を頭蓋骨から昇格するのに穏やかな後退と鈍的切離を使用します。任意の結合組織を除去し、縫合線 (図 4、パネル B) を公開するガーゼのパッドと頭蓋骨をやさしくスクラブします。 注: 非生存実験中に無菌性を維持する必要はありません。ただし、不妊は生存実験中に維持されなければなりません。</li>
	<li>さらに必要に応じて、関心のある領域を公開し、開頭術 (図 5、パネル A) の位置を決定する、頭皮を反映してください。手術ドリルを使用して、約 0.25 cm2 (実験の目標に応じて大小あります) の開窓を作成する硬膜または基になる脳 (図 5 を傷つけないように注意を使用して興味の構造を覆う 、パネル B)。微細手術用ハサミを使用して、(図 5、パネル C) 脳を覆う硬膜を切除します。</li>
	<li>ピグレット stereotax のマイクロマニピュレーターにパッチアンプ用アダプターの金属製の腕を保護することによって、前に可能な限り垂直に電極を置きます。頭蓋骨の表面に触れることがなくできるだけ多くの電極を下げます。(図 6、パネル A) 前の座標を記録します。<ol>
<li>前後と内側外側を決定する前に関連するだけでなく、興味の構造の深さを調整します。種および年齢に応じた地図を使用して定位座標を決定します。この場合、子豚20用に開発された定位アトラスを使用します。</li>
		<li>電極と装置の両方が表面に垂直の確保、適切な前後と内側外側場所にある電極の位置を変更します。擬似参照電極 (図 6、パネル B) 動物との接触を確保する、頭皮の下に配置します。</li>
		<li>ゆっくりと優しく、適切な深さに電極を脳定位固定装置のアームを使って脳に下ろします。最終的な 2 mm のため正確な場所 (図 6、パネル C) にさらなるドライブ電極に油圧マイクロ ドライブを使用します。 注: 電極位置は開窓を覆う必要があります。興味の脳構造によって電極深度が異なります。非生存実験でのデータ収集の完了時に切開を閉じるする必要はありません。</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. セボフルラン麻酔下で細胞外グルタミン酸の測定
<ol><li>子豚はこの手順の全体を通して継続的な生理学的監視の下を確認します。麻酔子豚は、プロシージャの準備のために inhalationally (顔コーン) を経由。</li>
	<li>MEA の注入後 3 h (図 7) の正確な測定が得られることを確認するためにベースラインに到達する電極を許可する 30 分を待ちます。</li>
	<li>0.25% ブピバカイン (1 mL/kg) 皮下投与は手術術後疼痛管理のためのサイト。さらに、必要に応じて q72h、徐放ブプレノルフィンは皮下与えられました。</li>
</ol>5. 血流と犠牲
<ol><li>前述の21として血流と脳組織のコレクションのプロシージャを実行します。非生存手術用動物は全身麻酔下にいながら実験後すぐに安楽死させた。</li>
	<li>固定豚脳の総断面積を取るし、前述22 MEA 配置、関心の領域に適切な配置を確保することとして電極のトラックを可視化する顕微鏡を使用します。</li>
</ol>

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</ol>

グレッグ ゲルハルト Quanteon LLC のプリンシパルの所有者であります。ホルヘ ・ キンテロとジェイソンみな Quanteon LLC へのコンサルタントを務めています。

実験開始から、子豚の生理的恒常性この演習の事前文書21で説明されているように維持されなければなりません。パルス酸素濃度計、心電図やカプノグラフィー、非観血的血圧、温度監視を最小化を含めます。生理学的な摂動 (例えばハイポ/温熱療法、低酸素、低血圧、不整脈) を適切に修正できますので、訓練を受けた捜査が必要です。
誘導前に機能と知られている条件の下で MEA の選択性を確立する体外MEA 校正が実行されます。校正・測定のメッキ技術の活用が重要です。校正中に発生することができます多くの潜在的なエラーがあります。校正には、不適切な interferent 応答につながる不適切なめっきと同様に、これらの問題を特定できます。MEA の応答で発生するエラーの詳細表アカウントがコンパイルされている、に沿って顕著な原因と推奨される解決方法を証明する必要可能性があります (表 1) のトラブルシューティングに有用な機器です。MEA の機能と精度を記録に悪影響か、キャリブレーションとめっきする前にガラス電極を空気の泡や白い変色の有無を確認するかに注意することが重要です。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>症状</td>
			<td>原因</td>
			<td>是正措置</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">信号がないです。</td>
			<td>電極が接続されていません。</td>
			<td>正しくパッチアンプ用アダプターと高速アンペロメトリー システムにパッチアンプ用アダプターに電極を接続します。</td>
		</tr>
<tr>
<td>高速アンペロメトリー システムに電源が入らない</td>
			<td>高速システム背面の電源スイッチをオンに</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="5">信号ノイズ</td>
			<td rowspan="2">血液で汚染された電極</td>
			<td>継続的に電極挿入時に脳の表面に水を引く</td>
		</tr>
<tr>
<td>DH2O で電極をすぐに洗い流してください。</td>
		</tr>
<tr>
<td>酵素コーティングが緩んでいます。</td>
			<td>きれいにし、電極を再塗装</td>
		</tr>
<tr>
<td>参照電極の挿入または被覆されていません。</td>
			<td>コートし、頭皮の下遠く参照電極を配置</td>
		</tr>
<tr>
<td>電極は、脳の表面の動きを検出します。</td>
			<td>表面的な構造で通常発生します。可能であれば電極より深い (一度に 1 mm) を挿入します。</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">動物の動き</td>
			<td>動物が保護されていません。</td>
			<td>頭蓋骨の後方でより安全な earbars に動物を移動します。良い体の配置のために胴体を昇格させます。</td>
		</tr>
<tr>
<td>動物は麻酔不十分</td>
			<td>麻酔器の整合性を確認します。実効線量と麻酔薬を滴定し、筋肉内のロクロニウム用量 (5 mg/kg) を管理</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">不正確な電極配置</td>
			<td>電極の配置が正しくないです。</td>
			<td>ヘッドへの適切な接続を維持しながら電極を調整してください。</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">定位座標は正確ではありません。</td>
			<td>別の基準点または平面配置の参照されている子豚アトラスを使用しないことを確認します。</td>
		</tr>
<tr>
<td>頭蓋骨の得点で縫合マークを不明瞭にしない注意します。</td>
		</tr>
</tbody></table>表 1: 子豚の MEA のトラブルシューティングの手順を使用します。考えられる原因と是正措置の最適化とトラブルシューティングを支援します。
子豚用脳定位固定装置アトラスは、前18など不明点に関して関心のある領域の脳定位固定装置の座標を決定する使用されます。頭蓋骨がレベルと完全に固定されたことを確認する耳バーを適切に保護する必要があります。注意は、頭蓋骨の縫合線の可視化に影響を与える可能性がありますこの得点を避けるために頭皮の正中切開中にすべき。開窓は MEA を収容するのに十分な大きさでする必要があります。
このプロトコルは、品揃え豊富な手術室と治験責任医師/チーム プロトコルの手術と麻酔の面で熟練を必要とする技術的課題の数を示します。ピグレット モデルが齧歯動物のモデルよりもより高価なモデルがまた財政上の制限を示しますしかし、数千ドルを要することができるヒト以外の霊長類の使用よりもかなり安価です。MEA 技術の使用は、塗装の手順として独自の課題を提示し、熟練した調査官または十分な選択性と信頼性の高い機能を確保するためのアシスタントを必要とする手動で電極をめっきします。電極自身は、セラミック、こうして簡単に適切な注意を見られない場合を破損して、壊れやすい。電極は予告記録サイトを見えなくことができます手術の部位で血液からの録音でノイズを作成することができます、他の電気機器からの干渉があります。特殊な装置の必要性は、定位手術フレームはカスタム注入中にピグレット頭蓋骨を固定するように構築する必要がありますように追加負担を提示します。脳定位固定装置フレーム、グルタミン酸オキシダーゼ、電極自体はすべて高価です。さらに、最後の十年の内子豚定位アトラスの欠如子豚脳内の深部構造の特定の場所を決定する特定の専門知識を必要とする技術的な制限が生じます。おそらく核磁気共鳴を用いた新しい脳定位固定装置アトラスの開発は非常に豚でこの技術を使用する機能を高めます。
子豚は主に本種と人間の新生児との間に存在する類似点のための窒化アルミニウムの研究の臨床的に関連するモデルと同様の脳の構造と開発の双方します。マウスやラットなど一般的に使用されるモデルとは異なり子豚類似がある大きい中枢神経系、人間モデルの結果の訳しに貸す。ピグレット モデルはさらに安価であり、ヒト以外の霊長類モデルよりもそれほど複雑な処理が含まれます。ピグレット モデル プロセスを調べるものではのどの麻酔が発達神経毒性を誘発する神経学的損傷への貢献を測定、交絡因子による被害の問題に対処します。例えば、低酸素血症は、脳に対する世界的な効果があり、麻酔薬によって生じた損害について誤解されること。子豚は、結果の再現性を確保するため人間の薬で使用されるものと同じ手術と麻酔の条件で利用されています。
MEA 技術のセラミック ベースの使用はマイクロダイアリシスの現代の技術に関連付けられている欠点のいくつかを排除します。継続的に複数のグルタミン酸イベントを記録することができます MEA など電流測定方法と比較して時間的・空間的解像度が限られているマイクロダイアリシス最大 10 Hz23微視的領域。この急速なサンプリング レートは、ローカライズされた神経伝達物質拡散はマイクロダイアリシス24のような遅いサンプリング メソッドに固有の交絡因子を排除します。また、MEA は、挿入時に重要な神経膠症を引き起こすことができますと挿入サイト22で神経伝達物質の活動を変える可能性がありますマイクロダイアリシス プローブより低侵襲の方法です。
哺乳類モデル、測定技術、および脳の領域の範囲を利用した先行研究は、グルタミン酸の基底レベルに匹敵するこの手法を使用してを実証しています。MEA 技術、ピグレット モデルに適合した生体内でグルタミン酸濃度 (表 2) の有効な録音を提供することが示唆されました。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>著者 (年)</td>
			<td>記録技術</td>
			<td>動物モデル</td>
			<td>年齢</td>
			<td>脳の地域</td>
			<td>平均基底グルタミン酸濃度 (μ M)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Hascup et al. (2008)23
</td>
			<td>MEA (酵素ベース)</td>
			<td>齧歯動物</td>
			<td>20-24 週</td>
			<td>前頭前皮質、線条体</td>
			<td>3.3 ± 1.0;5.0 ± 1.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>Hascup et al. (2010)25
</td>
			<td>MEA (酵素ベース)</td>
			<td>齧歯動物</td>
			<td>3-6 ヶ月</td>
			<td>海馬</td>
			<td>4.7 10.4</td>
		</tr>
<tr>
<td>ラザフォード et al. (2007)9
</td>
			<td>MEA (酵素ベース)</td>
			<td>齧歯動物</td>
			<td>3-6 ヶ月</td>
			<td>前頭前皮質、線条体</td>
			<td>44.9 ± 4.7;7.3 ± 0.9</td>
		</tr>
<tr>
<td>ミーレ et al. (1996)26
</td>
			<td>マイクロダイアリシス (酵素ベース)</td>
			<td>齧歯動物</td>
			<td>-</td>
			<td>線条体</td>
			<td>3.6 ± 0.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>27日 et al. (2006)
</td>
			<td>MEA (酵素ベース)</td>
			<td>齧歯動物</td>
			<td>3-6 ヶ月</td>
			<td>前頭皮質、線条体</td>
			<td>1.6 ± 0.3; 1.4 ± 0.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>キンテロ et al. (2007)28
</td>
			<td>MEA (酵素ベース)</td>
			<td>非ひと霊長類</td>
			<td>5.3 5.5 年</td>
			<td>前野、大脳皮質運動野</td>
			<td>3.8 ± 1.7;3.7 ± 0.9</td>
		</tr>
<tr>
<td>スティーブンスら。 (2010 年)29
</td>
			<td>MEA [スペンサー ・ ゲルハルト-2 (SG-2)]</td>
			<td>非ひと霊長類</td>
			<td>11-21 歳</td>
			<td>被殻</td>
			<td>8.53</td>
		</tr>
<tr>
<td>児玉 et al. (2002)30
</td>
			<td>マイクロダイアリシス (酵素ベース)</td>
			<td>非ひと霊長類</td>
			<td>-</td>
			<td>前頭前野</td>
			<td>1.29 2.21</td>
		</tr>
<tr>
<td>ガルバン et al. (2003)31
</td>
			<td>マイクロダイアリシス (酵素ベース)</td>
			<td>非ひと霊長類</td>
			<td>少年</td>
			<td>線条体</td>
			<td>28.74 ± 2.73</td>
		</tr>
<tr>
<td>間に、スペンサー (1993)32
</td>
			<td>マイクロダイアリシス (酵素ベース)</td>
			<td>人間</td>
			<td>18-35 歳</td>
			<td>海馬</td>
			<td>20.3 ± 6.6</td>
		</tr>
<tr>
<td>Reinstrup et al. (2000)33
</td>
			<td>マイクロダイアリシス (酵素ベース)</td>
			<td>人間</td>
			<td>-</td>
			<td>前頭皮質</td>
			<td>16 ± 16</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cavus et al. (2005)34
</td>
			<td>マイクロダイアリシス (酵素ベース)</td>
			<td>人間</td>
			<td>15-52 年</td>
			<td>大脳新皮質</td>
			<td>2.6 ± 0.3</td>
		</tr>
</tbody></table>表 2。基底細胞外グルタミン酸 levelsacross の比較様々 な動物モデル。マイクロダイアリシスや電極を使用して健康な目を覚まし、麻酔下の動物に通常細胞外グルタミン酸レベルを確立する研究の選択したレビュー。
ピグレット神経学的転帰後麻酔の今後の評価 MEA ピグレット モデルで生体内でグルタミン酸濃度を監視する技術の使用を許可できます。生存実験が計画されている、これがヒトの新生児の神経認知もてなしが麻酔の長期的な影響の理解を深めます。生存実験行動テストとグルタミン酸の監視を可能にする麻酔暴露後長期間変更します。また、外科的介入の形で生理学的ストレスを発生する可能性が条件で麻酔を受ける子供のため一般的です。神経毒性の神経学的損傷と増加の観点から手術の影響に対処する未来研究子供の一般的な臨床設定のモデリングより正確ななります。慢性的な注入、私たち神経毒性に関連する行動の変更を追跡することができますを介してこれらの様々 なモデルの研究は、代替動物モデルの使用可能、です。今後の研究はグルタミン酸レベルの解析に限定する必要はありませんので、MEA 技術自体は、汎用性 (例えばGABA、コリン、リジンなど分析できる)。

毎年、子供たちの何百万は米国1の侵襲的、非侵襲的な手順のための麻酔を受けます。長年、麻酔プロバイダーは小さな子供や新生児にも、麻酔薬の安全性の両親を安心させます。しかし、1999 年に、それは遷移を発見いた幼少時のグルタミン酸受容体の N-メチル-D-アスパラギン酸 (NMDA) サブタイプの閉塞ラット2の広範な神経細胞のアポトーシスを引き起こす可能性があります。最近、FDA は、麻酔と 3 歳以下のお子様の発展途上の脳に、潜在的な悪影響について警告を含むように麻酔薬のラベルを必要とする医薬品安全通信をリリース (米国食品と医薬品管理、2017)。しかし、まだ可能なメカニズムと神経保護方策を解明する必要があります。
Γ-アミノ酪酸 (GABA)、グルタミン酸などの神経伝達物質の正常な活動が発生する通常の神経発達に重要です。アインに関与する経路のほとんどがまだとらえどころのない、神経伝達物質システム、麻酔薬は、無意識を生成するこれらの経路を調節する知られているので関与する可能性が高い。特に、興奮性神経伝達物質グルタミン酸により応需型、その活性が調節不全。この神経伝達物質は、通常神経新生、神経可塑性、シナプス ・神経の成長、他の非常に重要な脳機能の数に関与しています。しかし、毒性とニューロンのアポトーシス、減らされたエネルギー可用性3酸素欠乏、手術などのストレス条件下で特にグルタミン酸受容体の長期にわたる活性化を引き起こす可能性が。NMDA グルタミン酸の結合受容体は、+の Na および Cl−流入を引き起こすこと示されています。その後脱分極は、Ca2 +チャネル開口につながると考えられているし、細胞内 Ca2 +のリリースは4を格納します。この機能不全の可能性がありますは、最終的に神経細胞増殖を減少、炎症を増加し、神経細胞死につながる代謝のかく乱の連鎖に します。これらの仮説にもかかわらずアインの該当カ所不明5のまま。、アポトーシスの役割のためグルタミン酸調節不全は、以前発表されたニューロンのアポトーシス、アインの機能のメカニズムに貢献するかもしれない経路を表します。
神経プロセスに関する障害の 1 つは神経の開発の設定で特にその高い複雑さです。人生の最初の数ヶ月は、ほとんど生理的なアポトーシス (神経剪定) などの神経の開発の重要なステップの時の怪我に最大の脆弱性の期間、シナプス形成、gliogenesis、髄鞘形成を取る場所6.神経回路の複雑な性質と正常な中枢神経系機能を中断することがなくこれらのプロセスを学ぶことの難しさを考えると、新しい技術が開発されて体内検出と重要な要素の定量化を目指して神経細胞のコミュニケーション。
MEA 技術の酵素は、本研究では臨床的に関連するピグレット モデルのアインのメカニズムを研究する新しい方法として使用されました。この技術は、グルタミン酸不全を含む電気化学脳プロセス複雑な生体内での研究に使用できます。Mea (2 グルタミン酸に敏感なサイトと 2 センチネル サイト) の組み込まれた 4 チャンネル プラチナ記録サイトこと自己参照が検出精度に貢献します。さらに、除外レイヤーは各電極に印加、授与されてから他の妨害分子を防止する選択検出7。さらに、MEA のロープロファイル設計は、以前のテクノロジと比較して最小限の組織外傷のためことができます。これと同じ機能は、MEAs の脳の微細な領域の研究を容易に高い空間分解能を与えます。たとえば、海馬 (海馬歯状回、CA1、CA2) の不連続な領域は特に勉強8をすることができます。測定の機能の詳細は、上記9をされています。
MEA 電気化学と比較してマイクロダイアリシスを組み込んだ関心の間に配置された膜と細胞外液の検出を許可すると同様の構成のソリューションを変更10。マイクロダイアリシス神経化学の主力である神経伝達物質の検出のため長い間使用されている、低時間分解能、グルタミン酸、および重要な組織外傷11発見が遅れの不利な点があります。
MEAs 直接検出できるない、コリン、アセチルコリン、グルタミン酸などの神経伝達物質など H2O2 O212,13 ゲルロボット レポーター分子を生成する適切なオキシダーゼ酵素を使用して.
MEA 技術は、アイン7,14以外の病態生理学的プロセスのコンテキストでの神経毒性の研究用ラットとヒト以外の霊長類で広く使用されています。これらの病態生理学的プロセスのいくつかの間で MEA 技術がアルツハイマー病、てんかん、外傷性脳損傷、およびシナプス通信8,15に及ぼす薬理学的化合物の研究のために使用されています,16,17. 測定は、ラットとヒト以外の霊長類でこれらの病態を研究に使用されている、人間と豚の脳の発達の高い類似性 MEA 技術の適応でなります子豚研究に非常に適した手法アイン言い18。

<table><tbody><tr><td>アドバンスリキウィーン豚乳代用</td><td>PBSアニマルヘルス</td><td>292-13</td><td></td></tr>子<tr><td>豚麻酔フェイスコーンマスク</td><td>VetEquip</td><td></td> 921428<td></td></tr><tr><td>インテグラSL麻酔ワークステーション</td><td>DRE獣医</td><td>2350</td><td>この麻酔ワークステーションは、手術室の小児患者が経験する臨床モニタリングを最もよく模倣するように選択されています。十分な生理学的モニタリングと介入が可能な状態であれば、どんな麻酔器でも使用することができます。</td></tr><tr><td>セボフルラン</td><td>ウルタン</td><td>0074-4456-04</td><td></td></tr>臭<tr><td>化ロクロニウム注射</td><td>ホスピーラ</td><td>0409-9558-05</td><td></td></tr><tr><td>メドフュージョン4000IV注入&nbsp;</td><td>スミスメディカル</td><td></td><td></td></tr><tr><td>モデル1530ヘビーデューティーリサーチモデルステレオタックス</td><td>Kopf</td><td></td>カスタム<td>メイド</td></tr><tr><td>モデル1541ピグレット</td><td>アダプターKopf</td><td></td><td>カスタムメイド</td></tr><tr><td>赤外線スポットランプアマゾン</td><td></td><td>B000HHQ94C</td><td></td></tr><tr><td>ベアハガー胴体ブランケット</td><td>3M540</td><td></td><td></td></tr>ベア<tr><td>ハガー3M750</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>滅菌アルコール準備パッドフィ</td><td>ッシャーブランド</td><td>22-363-750</td><td></td></tr><tr><td>炭素鋼リブバック外科用ブレードバード</td><td>パーカー</td><td>#10</td><td></td></tr>メス<tr><td>ヘンデル</td><td>ハベルの</td><td>HAN-G4</td><td></td></tr><tr><td>外科用ハサミ</td><td>ワールド精密機器</td><td></td>504615<td></td></tr><tr><td>蚊の鉗子</td><td>Sklar外科用器具</td><td>17-1225</td><td></td></tr><tr><td>ガーゼパッド</td><td>フィッシャーブランド</td><td>22-246-069</td><td></td></tr><tr><td>Adson 組織鉗子</td><td>Teleflex</td><td>181223</td><td></td></tr><tr><td>Dremel 111 彫刻カッター</td><td>Amazon</td><td>Dremel 111</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Microelectrdoe Technology, University of Kentucky</td><td></td><td>S2 4Ch MEA; カスタムメイド</td></tr><tr><td>Headstage</td><td>Quanteon</td><td></td><td>2pA/mV</td></tr><tr><td>ワイヤー、銀、PFA、.008"むき出し、.0110 "コーティング</td><td>されたAMシステム</td><td>786500</td><td></td></tr><tr><td>ファインマイクロマニピュレーター</td><td>成重科学機器ラボ</td><td>MO-8</td><td></td></tr></tbody></table>

そのまま子豚脳内麻酔神経毒性の研究のための微小電極アレイ技術の適応

Adaptation of Microelectrode Array Technology for the Study of Anesthesia-induced Neurotoxicity in the Intact Piglet Brain

毎年、何百万もの子供たちのプロシージャの多数のための麻酔を受けます。ただし、両方の動物と人間の研究が麻酔薬として開発中の脳に潜在的に有毒の十三の子供の麻酔の安全性問題に呼び出されます。日には、研究が正常に解明しないカ所を麻酔によって神経があります。動物研究はそのようなメカニズムの調査を許可する、新生子豚が人間の脳に発達印象的な類似のためにこれらの効果を研究する優れたモデルを表します。
このプロトコルは適応麻酔神経毒性 (アイン) 機構を研究する新しい方法として酵素法による微小電極アレイ (MEA) 技術を使用します。測定は体内の神経伝達物質の活動のリアルタイム監視を有効にして例外的な時間・空間分解能を提供します。それは、麻酔薬の神経毒性はグルタミン酸の調節不全に原因の一部と MEAs グルタミン酸の測定方法を提供する仮定されます。ピグレット モデルにおける MEA 技術の新しい実装は、アインの研究のためのユニークな機会を提示します。

酵素法によるセラミック MEA 技術ピグレット モデルのこの概念実証研究は、アインの基になるグルタミン酸動態に優れた洞察力を提供できます。さらにこの研究を示します酵素ベースの MEA 技術が神経伝達物質活性の高感度、高時空および麻酔関連の生理学的変化を測定するピグレット モデルで正常に合わせることができます。解像度。臨床的に関連するメソッドおよび標準を使用して実験中の生理的恒常性を維持し、生理学的摂動の子豚の兆候がないです。
得られたデータは、Mea の皮質およびサブ皮質頭脳の構造の神経伝達物質の測定を正確に空間的解決能力を示します。脳定位固定装置の使用は、子豚のサイズおよび解剖学の個人差に関係なく一貫して興味の領域を見つけるために参照表面構造 (前) の明確な同一証明をできます。縫合の明確に可視化精度のマイクロ メートルの範囲 (図 4) で MEA の一貫した地域配置が容易になります。脳の皮質表面へのアクセスを得ることは最低限、ごくわずかな出血と外傷性生体内でグルタミン酸ダイナミクスが意図しない全身またはローカル侮辱 (図 5) 原因ではないことを確保します。カスタム、堅い MEA に配置されます (図 6) ピグレットの前頭面に垂直な。挿入前に MEA を正しく合わせて障害は対象領域、特に皮質領域の正確な空間記録を防ぐことができます。
グルタミン酸測定リアルタイム生体内では、3-4 日古い子豚のなったで撮影された (n = 4) 下 2.5-3% セボフルラン麻酔 (約 1 MAC)。電流測定は 4 Hz で記録され、濃度校正パラメーター (図 8、パネル A) に基づく線形回帰を使用してに変換します。各時点の修正されたグルタミン酸信号を生成するため平均センチネル信号を減算する前に 2 つのグルタミン酸感受性サイトからの信号の平均をとる。これらの観測された (図 8、パネル B) 時間をかけてより良い全体的な傾向を視覚化する移動平均を適用することによって平滑化。平均基底グルタミン酸濃度は 4.61 ± 0.02 μ M と計算され、麻酔露出のコース上に比較的安定している残った。センチネル信号と相関がなく信号のピークを分析することによって一時的なグルタミン酸の作用 1 つの動物にされた (R2 &lt; 0.5) 3 (図 9、パネル A) の信号対雑音比を超えた。(図 10、パネル A) 3.5 時間の期間にわたって合計 116 一時的なピークが検出されました。結果の一時的なピークの振幅は、(図 10、パネル B) 1 μ M の範囲内にある一般に観察されました。各遷移の期間を定量化するためにそれぞれの最大ピーク値 80% を減衰するために必要な時間 (t80) は、(図 9、パネル B) を得られました。3.5 h レコーディング期間中にすべてのグルタミン酸トランジェントの平均 t80 4.68 ± 0.82 s (図 10、パネル C) であった。これらのデータを示す麻酔豚脳の皮質領域で長引くと一時的な神経伝達物質活動の両方を正確に測定することが可能です。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57391/57391fig1.jpg"> 図 1: SG 2 微小電極配列型の視覚的な比較します。SG 2 アレイには、2 つのグルタミン酸感受性サイトと 2 つのグルタミン酸を区別しないセンチネル サイト (サイトごと 150 μ x 20 μ m) が含まれています。(A) フレキシブル シャフト微小電極配列が左に表示されます。シャフト剛性微小電極配列は、大動物で子豚と許可のより深い注入で使用するためにカスタム設計されただった。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57391/57391fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57391/57391fig2.jpg"> 図 2: 微小電極アレイの作製やキャリブレーションのプロセスの概要。合計 MEA 作製し校正最後の約 1 週間。コーティング酵素、除外レイヤー、およびキャリブレーション analytes は興味の神経伝達物質に固有です。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57391/57391fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57391/57391fig3.jpg"> 図 3: 脳定位固定装置で子豚を配置します。豚口は、犬歯に直接後方口バーに配置されます。鋭い耳バーは、頭蓋骨の後端を保護する耳の三半規管に挿入されます。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57391/57391fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57391/57391fig4.jpg"> 図 4: 開頭術の脳定位固定装置で子豚の配置。(A) 子豚の頭は MEA の一貫した配置を確保するカスタムの脳定位固定装置フレーム内でしっかり固定されています。鋭い耳バーの等距離配置が表示されます。(B) 頭皮に沿って正中前方後方切開。頭蓋骨の得点コロナおよび矢状縫合を可視化し、最適化前の可視化は回避されました。切開の相対的なサイズおよび開頭術ウィンドウの位置を示すスケール バーは表示されます。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57391/57391fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57391/57391fig5.jpg"> 図 5: 海馬へのアクセスのための開頭します。定位座標によると MEA 挿入のおおよその位置を公開する (A) 頭皮がさらに反映されます。丸で囲んだ領域は、開頭術をガイドする (黒い点) がマークされます。(B) 開窓 (0.25 cm2) 頭蓋骨とフラップが基になる硬膜を公開するために削除します。(C) 髄膜は、組織の外傷のない表面的な大脳皮質を公開する慎重に削除されます。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57391/57391fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57391/57391fig6.jpg"> 図 6: MEA ポジショニングと海馬に挿入します。(A) 配置の MEA 前で海馬の相対的な固定位置を決定します。(B) 海馬挿入深さを判断する脳の表面で MEA の脳定位固定装置の配置。頭皮 (矢印によって示されます) の下で安全に置かれた銀の擬似参照電極。MEA (C) が、海馬の細胞外グルタミン酸測定を体内リアルタイムを取得する適切な深さに挿入されます。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57391/57391fig6large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57391/57391fig7.jpg"> 図 7: 30 分ベースラインの設定期間中に MEA 動作します。初期の急激な増加は、マニピュレーターを使用して海馬に MEA の降下に対応します。基準期間は、MEA が到達する適切な深さ (点線) を開始します。細胞外グルタミン酸測定 30 分の期間にわたって減少して生理学的測定値として解釈されるべきではないです。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57391/57391fig7large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57391/57391fig8.jpg"> 図 8: セボフルラン麻酔下で新生仔豚の海馬におけるリアルタイム細胞外グルタミン酸測定。(A) 移動平均 (10 のデータ ポイントを使用して) セボフルラン麻酔下で 1 つの新生児の豚の海馬のグルタミン酸濃度。測定は、簡単な 30 分ベースライン期間後 3 h の 4 Hz で撮影されました。(B) 100 点 15 分毎の移動平均を使用してより良い傾向を視覚化するグルタミン酸測定のスムージング。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57391/57391fig8large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57391/57391fig9.jpg"> 図 9: セボフルラン麻酔下で新生仔豚の海馬に一時的なグルタミン酸活動の Id 。リアルタイム グルタミン酸トレース上 (赤) は (A) 一時的なグルタミン酸ピークに示されます。信号対雑音比は 3 を超えた場合、その信号のセンチネル信号と相関を認めなかったとき、ピークは重要な考えられていた (R2 &lt; 0.5)。(B) A 代表的な一時的なピーク図 9、パネル Aで特定しました。点線は、ピーク 80% を減衰するために必要な合計時間を示しています。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57391/57391fig9large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57391/57391fig10.jpg"> 図 10: セボフルラン麻酔下で新生仔豚の海馬グルタミン酸トランジェント特性。(A) A 15 分箱に一時的なグルタミン酸ピーク数信号対雑音比は 3 を超えた場合、その信号のセンチネル信号と相関を認めなかったとき、ピークは重要な考えられていた (R2 &lt; 0.5)。(B) 一時的なグルタミン酸の振幅のピーク。誤差範囲は、平均値の標準誤差を示します。(C) 一時的なグルタミン酸のピークの意味 T は80 。誤差範囲は、平均値の標準誤差を示します。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57391/57391fig10large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

本研究は、子豚.の生体内で神経伝達物質の活動を監視する酵素法による微小電極アレイ (MEA) 技術の新しい使用法を探るそのグルタミン酸不全麻酔神経毒性のメカニズムに貢献しました。ここでは、麻酔神経毒性の機構解明のための MEA 技術を適応するためのプロトコルを提案する.

Every year, millions of children undergo anesthesia for a multitude of procedures. However, studies in both animals and humans have called into question ...

この実験手順の全体的な目標は、新生仔豚の神経伝達物質を測定するための酵素ベースの微小電極アレイ技術の新しいアプリケーションを利用することです。この例では、麻酔誘発性神経毒性を研究するために、in vivo のグルタミン酸活性を調べます。この技術の主な利点は、麻酔誘発性神経毒性の臨床的に関連する動物モデルにおいて、in vivoの神経伝達物質活性を優れた空間的および時間的分解能で測定できることです。この方法は、麻酔誘発性神経毒性のメカニズムについての洞察を提供することができますが、小児の脳外傷、てんかん、脳卒中などの他の病理学的状態にも適用できます。一般に、この方法に不慣れな個人は、子豚モデルの使用には実装の経験と練習が必要なため、苦労するでしょう。さらに、微小電極アレイの使用には、専門的なスキルセットが必要です。外科的および微小電極の配置手順は、その繊細な性質のために習得が難しいため、この方法の視覚的なデモンストレーションは非常に重要です。この実験では、子豚が生後3〜5日で脳の成長がピークに達する時期に子豚を使用します。実験の少なくとも24時間前に彼らが順応するのを待ちます。訓練を受けたスタッフが子豚の世話をしなければなりません。彼らはアドリブで栄養、毛布、刺激のためのおもちゃへのアクセスを提供されるべきです。麻酔の少なくとも3時間前に、子豚の胃が空になっていることを確認するために、ケージから代用乳を取り外してください。ARRIVEガイドラインに従って、性別に基づく可能性のある交絡因子を排除してください。その後、小児用人工呼吸器と適切なモニタリング装置を備えた麻酔ワークステーションで、子豚を挿管し、機械的に換気します。次に、セボフルラン麻酔を1MACで3.5時間の麻酔で投与します。次に、つま先をつまんで適切な麻酔の深さを確認し、適切なパッドが付けられた子豚専用の定位固定装置フレームに子豚を固定します。上顎骨の歯を歯のバーの上に置きます。次に、子豚を正中線の中央にして、2つの貫通するイヤーバーを固定して締めます。耳バーを鼓膜がはじける音が聞こえるほどしっかりと挿入します。子豚がフレームに固定されている間、ロクロニウム負荷量と注入を開始して動きを防ぎます。子豚を暖かく保ち、そのバイタルサインを監視することが重要です。ヒートランプおよび/または毛布を使用して、正常な体温を維持します。ヒートランプが燃えるほど近くにないことを確認してください。子豚の生存が望ましい場合は、手術野を無菌に保つために追加の準備をしてください。次に、微小電極アレイの埋め込みを進めます。まず、メスで頭蓋骨を傷つけないように注意しながら、頭蓋骨に沿って4〜6センチの正中線を切開します。切開が完了したら、穏やかな収縮と鈍い解剖を使用して、頭蓋骨から頭皮を持ち上げます。次に、ガーゼパッドで頭蓋骨をやさしくこすり、結合組織を取り除き、縫合線を露出させます。次に、開頭術の意図された場所を決定します。関心のある領域が不明瞭なままの場合は、頭皮をさらに反映します。次に、外科用ドリルを使用して、目的の構造を覆う約0.25平方センチメートルの開頭窓を作成します。硬膜やその下にある脳を傷つけないように注意してください。必要に応じて、細かい手術器具を使用して、脳組織を覆う硬膜を切除します。脳に損傷を与えないように細心の注意を払ってください。この実験では、グルタミン酸オキシダーゼでプレコートされ、mPDで電気メッキされた前述の酵素ベースの微小電極アレイを利用しています。微小電極アレイには、子豚用にカスタマイズされた40mmの剛性シャフトがあります。金属アームをマイクロマニピュレータに固定し、マイクロ電極アレイをブレグマ上でできるだけ垂直に配置します。次に、頭蓋骨の表面に触れないようにアレイをできるだけ低く慎重に下げ、ブレグマの座標に注意してください。次に、子豚の脳アトラスを使用して、目的の構造の正確な定位固定座標を決定し、それに応じて微小電極を再配置します。次に、疑似参照電極を頭皮の下に置き、動物との接触を確保します。次に、微小電極アレイを脳内にゆっくりと適切な深さ近くまで下げます。最後の2mmの移動では、油圧マイクロドライブを使用して、組織の外傷を最小限に抑えながらアレイを目的の構造にゆっくりと下げます。微小電極アレイを配置した後、電極がベースラインに達するまで30分待ちます。その後、約3時間測定します。子豚が実験を生き残るためには、データを収集した後、切開部を閉じます。記載されているように、セボフルラン麻酔下で生後3〜4日の子豚の海馬でリアルタイムのin vivoグルタミン酸測定が行われました。録画セッションは3時間を超えました。アンペロメトリーの測定値は4ヘルツで記録され、キャリブレーションパラメータに基づく線形回帰を使用して濃度に変換されました。各時点について、2つのグルタミン酸感受性部位からの信号を平均化してから、平均化されたセンチネル信号を差し引くと、修正されたグルタミン酸シグナルが得られました。グルタミン酸基礎の平均濃度は約4.6マイクロモルで、麻酔薬への曝露期間中は比較的安定していました。トランジェントなグルタミン酸作動性活性は、センチネルシグナルと相関せず、シグナル対ノイズ比が3より大きいシグナルのピークを分析することにより同定されました。実験期間中に合計116の過渡ピークが検出されました。結果として生じるトランジェントピークの振幅は、一般に1マイクロモルの範囲内にあることが観察されました。各トランジェントの持続時間を定量化するために、各最大ピーク値が80%崩壊するのに必要な時間を求めたところ、約4〜5.5秒であることがわかった。このテクニックを習得すれば、系統的かつ慎重に実行すれば、4時間で完了します。この手順を試みる際には、実験データを混乱させる可能性のある意図しない組織の損傷を最小限に抑えることを覚えておくことが重要です。この手順に続いて、他の電気化学分析種の測定などの他の方法を実行して、追加の質問に答えることができます。

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