免疫手術でヒト胚性幹細胞の導出

こんにちは、私の名前はアリス・チェンです。私は融解研究室のポスドクで、今日はヒト胚から胚性幹細胞を導き出す方法をご紹介します。私たちは、発生のすべての異なる段階で胚を受け取り、適切な拡大芽球段階に達するまでin vitroで培養します。

これらは、胚が最初の1細胞段階から初期の芽球アシスト、そしてヒト胚性幹細胞を導出する拡大芽球まで、どのように発達するかの例です。その後、誘導のために選択された高品質の胚は、3滴のACEロードを介して移植され、そこでそれを離れ、ルシータのZの溶解を監視します。脳神経外科のプロセスは、ウサギの抗ヒト抗体が細胞の外層に結合する非特異的なプロセスです。

この場合、それはトリフェクタダームです。モルモット血清補体を適用すると、抗体が付着したこれらすべての細胞が溶解されます。まず、3つのプレートを用意したいと思います。

最初のプレートはACEチロ用で、ジータを取り除くために使用します。2枚目と3枚目のプレートは免疫手術用です。まず、酸性チロス滴とヒト胚性幹細胞の誘導物を配置するプレートを生成することから始めます。

メディアがドロップします。プレートの左側に酸チロを3滴、プレートの右側にヒトES培地を3滴調製します。2番目のプレートは、ウサギの抗ヒトRBCである一次抗体で構成されています。

繰り返しになりますが、プレートの左側は一次抗体専用で、胚ごとに3滴、プレートの右側はヒトES培養専用になります。培地は、再び、補体プレートの胚ごとに3滴滴下します。ここでも、プレートの左側に3滴の補体を置き、次にプレートの右側に3滴のヒトES培地を置きます。

繰り返しになりますが、各行は胚専用です。3つのプレートはすべて、蒸発を防ぐために鉱油で覆われ、平衡化のためにインキュベーターに入れられます。これは、組織培養と同じように層流があるピッキンググッズ内の解剖範囲であり、これは私たちが人間のアナ操作の大部分を行う場所です。

胚を始める前に最初に準備したいのは、マウスピペットです。これが標準的なマウスピペットチューブですが、口とピペットの行き先の間に0.2ミクロンのフィルターを挿入しています。そして、これは無菌性を確保するためだけです。

マウスピペットの引き方を実演します。私はさまざまなサイズを引っ張るのが好きです。これらはすべてVWRから入手でき、私は10マイクロリットル、50マイクロリットル、100マイクロリットルの直径を引っ張るのが好きです。

次に、ダイアモンドピンを使用してマウントパイプを切断しています。この最初のステップでは、全胚を扱っているため、かなり大きな直径が必要です。その後、Derivationに選ばれた高品質の胚を3滴で移植します。

最初のドロップから2番目のドロップ、3番目のドロップに移動するばかりのOfci道路は、そこから離れてザップパリタの溶解を監視します。このプロセスは通常30秒未満で完了し、実際にzop palitaが溶解するのを見ることができます。ザップパリタが完全に溶解したとき。

胚は次に、ヒトES培養培地の3つの洗浄滴を介して移動し、洗浄の1滴目、2滴目、および3滴目を通過します。その後、胚は一次抗体に移され、再び落下し、最初の滴から2番目の滴、3番目の滴へと移行し、トリフェクタの組織培養インキュベーター溶解で30分間インキュベーションし、胚の外側の細胞の泡立ちを見ると皮膚が明らかになります。これが三連単の真皮細胞が嘘をつき始める始まりです。

溶解が胚の外縁全体に明らかになると、胚は3滴のhumanus培養培地で洗浄する準備が整います。免疫手術後、胚は小型のマウスピペットを使用して機械的に粉砕されます。この口ピペットは、最初のピペットよりも直径を小さくする必要があるため、lys trifectaを剃り落とすためのテーションプロセスをより効率的に行うことができます。

真皮細胞。機械化の最後には、中央にセルのクラスターが残ります。無傷である内部細胞塊があります。

これの周りには、多くのlys trifecta dermal細胞と、いくつかの無傷のtrifecta dermal細胞があります。次に、この内部細胞質量分離物を、マウス胚のフィーダー層細胞で調製したウェルに入れます。フィーダー層細胞のプレートは前日の夜に調製したもので、今朝はマウス胚性線維芽細胞培地からヒトES誘導培地に培地を切り替えました。

次いで、内部細胞質量分離物は、補体後の洗浄液滴からフィーダー層細胞を含むこのウェルに移されます。その後、この皿をインキュベーターに戻して、内部細胞塊分離物の付着を可能にするために数日間手つかずのまま放置します。これは、成長がどのように進行するかの一例です。

成長が十分に大きくなるとき。次に、この成長を半分に分割して最初のパッセージを開始できます。さて、最初の派生から14日が経ちましたが、以下は私たちの派生の1つからの派生例です。

これは、今日私が成長の半分を摘み取るつもりであるそのような成長の1つの例です。この成長物は半分に分割され、次に正方形に切断され、これらの各ピースはフィーダーセルを含む新しいウェルに移されます。成長の半分を手つかずのままにしておくと、細胞を増幅し、実行する継代をバックアップするために戻る細胞の継続的な供給源を確保できます。

最初の2〜3パッセージ。この方法で機械的に継代し、最終的には細胞を酵素解離に適応させて、より効率的なパッケージングを実現するのは良い考えです。私たちの研究室では、発生と分化の使用と理解のために、ヒト胚性幹細胞株を一貫して導出しています。

これらの系統は、幹細胞研究者にも世界中に配布されています。導出の成功に影響を与える主な要因は4つあると思います。最初のものは胚の品質に関係しており、これは遺伝的背景、胚の凍結と融解の程度、そしてブラストアシストでの誘導段階までのin vitro培養の品質にも依存します。

第2の要因は、おそらく単離後の内部細胞塊の品質完全性であり、これは内部細胞塊を単離するために使用される技術に依存する可能性があり、経験とスキルにも依存する可能性があります。3番目の要因は、単離された内部細胞塊がフィーダー層にどれだけうまく付着するかであり、4番目の要因は、このICM分離株の伸長です。技術的に難しいプロセスではないと思います。

少し練習が必要です。実際、各ステップはかなり簡単なので、少し練習すればプロトコルに従うことができれば、誰でもできると思います。ラボでわかったのは、私たちが完全に理解しているかどうかわからない理由で、すべての行が少しずつ異なるということです。

たとえば、10系統の分化能力をテストする場合、おそらくそれらの系統のうち2つまたは3つは、関心のあるタイプの細胞に発展する可能性が高いかもしれません。これらの違いは、細胞がいた段階、胚性幹細胞株が胚の段階、つまりこれらの細胞の手動取り扱いに由来したことに関係しているのではないかと思います。その特性が細胞株の不均一性を変化させることがあり、その可能性はすべての幹細胞研究者が心に留めておく必要があるものだと思います。

繰り返しになりますが、何が原因なのかはわかりませんが、私の研究の一例として、私たちの最終的な目標は、膵臓のインスリン産生ベータ細胞を作ることです。このタイプの細胞株を作るための最初のステップは、胚性幹細胞から内胚葉を生成することであり、10〜20の系統で比較したところ、これらの系統のうち1つまたは2つは効率的に内胚葉を生成できる一方で、半分は内胚葉を効率的に生成できる可能性があり、中には内胚葉をまったくうまく生成できないものもあることがわかりました。そこで、この初期スクリーニングプロセスを通じて、目的の細胞種を形成する傾向が高い細胞を選抜し、残りの細胞種をその細胞種を用いて分化を追求します。

ヒト胚性幹細胞の最初の誘導は、1998年にThompson Etalによって報告され、2004年には、私たちの研究室で17の新しいヒト胚性幹細胞株の誘導が報告されました。これらの公開されたプロトコルを変更することにより、これらの変更は実際には導出プロセスをより合理化するためでした。それらは、培地組成の変化、細胞の継代方法、および凍結融解の方法で構成されています。

それ以来、すべての導出において、プロトコールと導出率を改善するための新しい方法を探しています。例えば、私たちの研究室では、ウサギ抗体やモルモット血清補体のような異種試薬を使用するのではなく、より機械的に内部細胞塊を解剖するなど、内部細胞の数学を分離する別の方法を模索しています。うまくいけば、これらの方法が、内部細胞塊を分離するためのより良い方法ではないにしても、少なくとも同等の方法につながるでしょう。