Name: 免疫手術でヒト胚性幹細胞の導出 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-12-13T00:28:00.000+00:00
Duration: 11 min 56 s
Description: 学ぶ免疫手術によるヒト胚性幹細胞の導出プロトコル。胚盤胞期の胚から内細胞塊を分離し、フィーダー細胞上で培養することで多能性幹細胞株を樹立する方法を解説。再生医療研究に応用可能。

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AECは、医学研究とメルク研究所のためのジェーン棺チャイルズメモリアル基金の仲間です。我々は実験的なアドバイスや議論のためにD.エグリとC. Cowanさんに感謝。

<html>ヒト胚性幹（HES）のセルの導出に使用する凍結ヒト胚は、ハーバード大学でヒト被験者の利用に関する委員会や胚性幹細胞研究の監督委員会の両方による確認と承認された研究のプロトコールの下で適切なインフォームドコンセントは、次の研究のために寄付されました。 以下の書面によるプロトコルは、コーワンらによって報告された公開パラメータに基づいています。 2004年、わずかな修正を加えた。 胚培養拡張胚盤胞期への発展まで、15％のPlasmanateを補充グローバル培地のドロップにクインのアドバンテージ融解キットとカルチャを使用して、ヒトの胚を融解する。 内部細胞塊の免疫手術ベースの分離準備： <ol><li> 10cmのプレートに各溶液の滴を設定することによって、透明帯と免疫手術の除去（下記参照）のためのプレートを準備します。蒸発を防ぐためにミネラルオイルを重層する。導出を目的とした胚ごとに単一行を準備します。 <ul><li> EmbryoMax酸性Tyrodesは、そのまま使用してください。 </li><li> hES細胞の導出メディア：75％KO - DMEM、10％KO -血清代替、10％のPlasmanate、2.5％ES細胞テスト済みウシ胎児血清（FBS）、2mMのグルタミン- I、1％非必須アミノ酸、50ユニット/ mlペニシリン、50μg/mlストレプトマイシン、0.055mMβ-メルカプトエタノール、5ng/ml bFGFを。 </li><li>ウサギ抗ヒト赤血球一次抗体は、ヒトES細胞の派生のメディアで1:10に希釈し、メーカーの提案にしたがって再構成。 </li><li>モルモット補体血清は、ヒトES細胞の派生のメディアで1:10に希釈し、メーカーの提案にしたがって再構成。 <img src="/files/ftp_upload/old/574_2008_9_18_6/574_Figure-01.png" alt="574_Figure - 01" width="600" height="166" /> </li></ul></li><li> ℃の組織培養インキュベーターで使用する前に、37に、すべてのプレートを平衡化させます。 </li><li>転送する胚の使用のために50μlの-100μlのキャピラリーピペット（VWR）を引き出します。ダイヤモンドのペンと0.2μmのフィルターを装備した口のピペットチューブでの使用で端をカット。 </li></ol>免疫手術の手順： 注意事項： <ul><li>この手順では、栄養外胚葉の細胞が補体活性と並行してヒト細胞に対する抗体の短期間の暴露によって破壊されています。胚盤胞の唯一の構造的な整合性は、免疫学的反応への影響を受けているからICMを防ぐしたがって、プロトコルは、無傷の栄養外胚葉と高品質の胚に最適です。 </li><li>すべての手順は、加熱ステージを装備した解剖スコープを使用して実行。 </li></ul>手順： <ol><li>くっつくの胚を防ぐためにFBSを持つ胚移植に使用される口のピペットをすすぐ。 </li><li>培養皿から皿ATのヒトES保持ドロップに胚盤胞を転送します。 </li><li>滴ATシリーズのを介してヒトESドロップダウンリストから胚盤胞を転送することで手順を開始します。 3番目のドロップでは、透明帯（通常は5〜30秒）の解散を監視します。ではない過剰治療や胚の整合性に注意してください損なわれる可能性があります。 <img src="/files/ftp_upload/old/574_2008_7_21_2/574_Figure-02.png" alt="574_Figure - 02" width="551" height="273" /> </li><li> hES細胞の派生のメディアのシリーズを通じて、転送胚盤胞は、AT洗い流しますに低下します。メディアとのプリロードピペットは、即座に反応、AT​​中和することをお勧めします。すべてが、AT -処理されるまで、胚盤胞は、ここで開催することができます。 </li><li> 37インキュベーションの30分間3番目のドロップ°組織培養インキュベーターでCに残し、一次抗体の滴の一連の胚盤胞を転送します。 </li><li> hES細胞の派生のメディアのシリーズを通じて、転送胚盤胞は、プライマリをオフリンスに低下します。 </li><li>栄養外胚葉細胞の溶解を監視するために3番目のドロップに残して、補液滴の一連の胚盤胞を転送します。彼らは溶解と栄養外胚葉細胞の&quot;バブリング&quot;の舞台での最初の30秒間、胚盤胞を観察。溶解がこの時間枠内で観察された場合、完了するまで反応を監視するために顕微鏡のステージ上で料理をしてください。何泡立ちが最初の30秒の間に観察されていない場合は、栄養外胚葉のほとんどが溶解するまで5分ごとにチェック、インキュベーターに戻す。これは5〜15分かかることがあります。反応時間と内部細胞塊への潜在的な被害を最小限に抑えるために密接に反応を監視する。 <img src="/files/ftp_upload/old/574_2008_7_21_3/574_Figure-03.png" alt="574_Figure - 03" width="571" height="273" /> </li><li> hES細胞の派生のメディアのシリーズを通じて、転送胚盤胞は、補体活性を洗い落とすに低下します。 </li><li> （10μlのVWRキャピラリーチューブからプル）胚盤胞よりわずかに小さい直径のガラスピペットを用いて、溶解した栄養外胚葉のほとんどを離れて除去するには、上下の胚盤胞を描く。 G&quot;ALT =&quot;574_Figure - 0&quot;幅=&quot;577&quot;高さ=&quot;270&quot;/&gt; </li><li>プレートICMは、有糸分裂不活化マウス胚繊維芽細胞（MEF）のフィーダー細胞上に隔離する。 MEFは導出前日の準備とのhES細胞の派生のメディアデーに切り替える必要があります。 4ウェルNUNC料理は、導出の最初のステップに適しています。 </li><li>第一1〜2日のためのプレートを邪魔しないでください。その後、胚性幹細胞のコロニー（通常見かけ1-2週間以内）の伸長のために毎日確認してください。メディアは3日目の初めおきに半日ボリュームに変更する必要があります。 </li></ol> ES細胞の伸長や継代 hES細胞の伸長が約0.5mm以上に達したとき、それは機械摘みによる膨張のための準備ができています。 <ol><li>機械的に伸長の半分を分散し、新鮮な餌を含む新しいプレートに移す。胚性幹細胞塊は約30〜50セルごとにする必要があります。バックアップ初通過（P1）用として、伸長の残りの半分を残す。それは拡大し続けて伸長（P0）は、数回から選択できる。 <img src="/files/ftp_upload/old/574_2008_7_21_5/574_Figure-05.png" alt="574_Figure" width="639" height="219" /> </li><li>二次コロニーも同様に分散させ、新しい細胞株は、酵素トリプシンで継代に適応することができる時に通路3-5まで大きな培養皿全体に拡張することができます。培地の血清含有量も徐々にES細胞の分化を最小限に抑えるためにこれらの初期継代の間に1％、0％に軽減する必要があります。 </li><li>すべての確立された胚性幹細胞株は、将来の拡張のための初期の通路の部分を下に凍結するバンクレジスタすべきである。 </li><li>さらに、各細胞株は、核型分析によって特徴付けされるべきであり、in vitroおよび in vivo における分化能と分化の研究によって検証。 </li></ol>

<ol><li>Cowan, C. A., Klimanskaya, I., McMahon, J., Atienza, J., Whitmyer, J., Zucker, J. P., Wang, S. P., Morton, C. C., McMahon, A. P., Powers, D., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+embryonic+stem-cell+lines+from+human+blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22N+ENGL+J+MED%22%5BJournal%5D)">Derivation of embryonic stem-cell lines from human blastocysts.</a> N ENGL J MED. 350 (13), 1353-1356 (2004).</li>
</ol>

著者に開示すべき事項はありません。

ここで紹介するプロトコルは、内部細胞塊のimmunosurgicalの分離により、ヒト胚性幹細胞株を導出する方法を簡潔に、わかりやすい概要を研究者に提供します。

<table><tbody><tr><td>Quinn&amp;rsquo;s Advantage Thaw Kit </td><td>Sage</td><td>ART-8016</td><td></td></tr><tr><td>Global medium</td><td>Life Global</td><td>GMGB-050</td><td></td></tr><tr><td>Plasmanate</td><td>Talecris</td><td>61325</td><td></td></tr><tr><td>EmbryoMax Acidic Tyrodes</td><td>Chemicon International</td><td>MR-004-D</td><td></td></tr><tr><td>KO-DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>10829-018</td><td></td></tr><tr><td>KO-Serum Replacement</td><td>Invitrogen</td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>ES細胞テスト済み定義ウシ胎児血清</td><td>Hyclone</td><td>SH30070.03</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax-I</td><td>Invitrogen</td><td>35050-079</td><td></td></tr><tr><td>非必須アミノ酸</td><td>Invitrogen</td><td>11140-076</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>Invitrogen</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>リコンビナントヒト塩基性線維芽細胞成長因子</td><td>Invitrogen</td><td>13256-029</td><td></td></tr><tr><td>Beta-mercapt&amp;#8211;thanol </td><td>Invitrogen</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>ウサギ抗ヒト赤血球一次抗体</td><td>Rockland Immunochemicals</td><td>109-4139</td><td></td></tr><tr><td>モルモット補体血清</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-1639</td><td></td></tr><tr><td>キャピラリーピペット（10 µL、50 µL、100 µLサイズ）</td><td>VWR international</td><td></td><td></td></tr><tr><td>チューブ付きマウスピペット</td><td>VWR international</td><td></td><td>VWR社製キャピラリーピペットに付属</td></tr><tr><td>0.2 µm Acrodisc シリンジフィルター </td><td>Pall Corporation</td><td>PN4192</td><td></td></tr><tr><td>0.5% Trypsin-EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>25300-120</td><td></td></tr><tr><td>組織培養皿</td><td>VWR international</td><td></td><td></td></tr><tr><td>組織培養皿</td><td>Nalge Nunc international</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon Tokai Hit ThermoPlate 加温ステージ搭載 Nikon SMZ1500 解剖顕微鏡 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>マウス胚性線維芽細胞 (E12.5)</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

免疫手術でヒト胚性幹細胞の導出

Derivation of Human Embryonic Stem Cells by Immunosurgery

自己複製能と身体のあらゆる細胞タイプに分化するヒト胚性幹細胞の能力には、両方の医療アプリケーション用の開発や病気の根本的な問題に対処するための研究ツールとして有望視されて保持することを示唆している。ここでは、内部細胞塊のimmunosurgicalの分離による胚からのヒト胚性幹細胞の派生のための簡潔な、ステップバイステップのプロトコルを提供しています。

ヒト胚性幹細胞が持つ自己複製能および体内のあらゆる細胞種へと分化する能力は、それらが…の両方において大きな可能性を秘めていることを示唆している。

こんにちは、アリス・チェンです。私はメルティング研究室のポストドクターです。本日は、ヒト胚から胚性幹細胞を誘導する方法を実演します。私たちはさまざまな発生段階の胚を受け取り、それらが適切な拡張胚盤胞期に達するまでin vitroで培養します。これらは、1細胞期の最初の段階から初期胚盤胞、そしてヒト胚性幹細胞を誘導する拡張胚へと胚が発達する過程の例です。誘導用に選別された高品質な胚は、ACE溶液の3つの液滴の中を順次移動させ、透明帯（zona lucida）が溶解するまで静置して観察します。脱細胞化プロセスは非特異的なプロセスであり、ウサギ抗ヒト抗体が細胞の外層に結合します。このケースでは、trifecta dermを用います。モルモット血清補体を添加すると、抗体が結合したこれらの細胞はすべて溶血されます。まず、3枚のプレートを準備します。最初のプレートはACE tyros用で、zitaの除去に使用します。2枚目と3枚目のプレートは免疫手術用です。まず、acid tyros液滴の滴下およびヒト胚性幹細胞の誘導を行うプレートの作成から開始します。培地ドロップ。プレートの左側に酸性チロシン溶液を3滴、右側にヒトES細胞培養培地を3滴準備します。2枚目のプレートには、一次抗体であるウサギ抗ヒトRBC抗体を用います。繰り返しになりますが、プレートの左側は一次抗体用とし、胚1個につき3滴ずつ滴下します。プレートの右側はヒトES細胞培養液用とします。補完プレートについても同様に、培地を胚1個につき3滴ずつ滴下してください。具体的には、プレートの左側に補完液を3滴、そしてプレートの右側にヒトES細胞培養液を3滴配置します。繰り返しになりますが、各行は1つの胚に割り当てられています。蒸発を防ぐため、3枚のプレートすべてをミネラルオイルで覆い、平衡化のためにインキュベーターに入れます。こちらはピッキング用フード内の解剖顕微鏡で、組織培養と同様にラミナーフロー（層流）となっており、ここで行われる操作の大部分がヒト胚の操作です。胚の操作を開始する前に、まず準備すべきものがマウスピペットです。これは標準的なマウスピペットのチューブですが、口とピペットの挿入箇所の間に0.2 micronフィルタを挿入しています。これは、無菌状態を確実に維持するためです。マウスピペットの作製方法を実演します。私はさまざまなサイズのピペットを作製するようにしています。これらはすべてVWRから購入でき、私は10 µL、50 µL、および100 µLの径のものを製作しています。次に、ダイヤモンドピンを用いてマウントパイプを切断します。この最初のステップでは、胚全体を扱うため、比較的大きな直径のものを使用します。分化誘導用に選別した高品質な胚を、3滴の液滴を介して転送します。1滴目から2滴目、そして3滴目へと順に滴下し、そのまま放置してザップ・パリータ（zap palita）の溶解を観察します。この工程には通常30秒未満しかかからず、ザップ・パリータが溶解していく様子を実際に確認できます。ザップ・パリータが完全に溶解したら、その後、胚をヒトEs培養液の3つの洗浄ドロップに順次移し、1番目、2番目、そして3番目の洗浄ドロップへと通過させます。次に、胚を一次抗体ドロップに同様に移し、1番目のドロップから2番目、そして3番目のドロップへと移動させ、組織培養インキュベーター内で30分間インキュベートします。胚の外側の細胞に気泡が見え始めたとき、トロフェクトダームの溶解が明らかになります。これが、トロフェクトダーム細胞が溶解し始めた兆候です。胚の外縁全体に溶血が認められたら、3滴のhumanus培養液を用いて胚を洗浄します。免疫手術後、口ピペットを用いて胚を機械的に摩砕します。この口ピペットは、溶血した三叉神経を効率的に削り取れるよう、最初のピペットよりも口径の小さいものを使用してください。皮膚細胞。機械的な処理の最後に、中心部に細胞塊が残ります。ここには、無傷の状態の内部細胞塊が存在します。この周囲には、多くの溶解したtrifecta皮膚細胞および一部の完全なtrifecta皮膚細胞が存在します。この分離された内細胞塊を、マウス胚性フィーダー細胞で準備したウェルに配置します。フィーダー細胞のプレートは前夜に準備しており、今朝、培地をマウス胚性線維芽細胞用培地からヒトES細胞誘導用培地に交換しました。その後、補完後の洗浄ドロップから内細胞塊分離物を、フィーダー層細胞を含むこのウェルに移します。このディッシュをインキュベーターに戻し、内細胞塊分離物が接着するまで数日間そのままにします。これは、アウトグロース（外向成長）がどのように進展するかの例です。アウトグロースが十分に大きくなったら、このアウトグロースを半分に分割して、最初の継代を開始することができます。元の誘導から14日が経過した、私たちの誘導例の一つによるアウトグロースがこちらです。これはそのようなアウトグロースの一例であり、本日はこのアウトグロースの半分を採取します。このアウトグロースを半分に分け、さらに正方形の断片に切り分け、それぞれの断片をフィーダー細胞を含む新しいウェルに移植します。アウトグロースの半分をそのまま残しておくことで、細胞の増幅や継代操作のバックアップとして、継続的に細胞を供給できるソースを確保できるため、それが推奨されます。最初の2〜3代の継代についてです。このように機械的に継代し、最終的に酵素的解離に適応させることで、より効率的な継代が可能になります。当研究室では、発生および分化の解明と利用を目的として、ヒト胚性幹細胞株を安定的に樹立しています。これらの細胞株は、幹細胞研究者向けに世界中に配布されています。樹立の成否に影響を与える主な要因は4つあると考えています。1つ目は胚の質に関するものであり、これは遺伝的背景、胚の凍結および融解の状態、さらに胚盤胞段階での樹立に至るまでのin vitro培養の質に依存します。2番目の要因はおそらく、単離後の内部細胞塊の品質整合性であり、これは内部細胞塊の単離に使用される手法や、経験およびスキルに依存します。3番目の要因は、単離された内部細胞塊がフィーダー層にどれだけ適切に接着するかであり、4番目の要因はこの単離されたICMの増殖です。技術的に困難なプロセスであるとは考えられません。少しの練習が必要です。実際には、各ステップは非常に単純であるため、プロトコルに従い、少々練習すれば、誰でも実施できると思います。研究室で分かったことは、完全には解明されていない理由により、細胞株ごとにわずかに異なる点があるということです。例えば、10株の分化能をテストした場合、そのうちの2～3株が目的の細胞タイプへ分化しやすい可能性があります。こうした差異は、胚性幹細胞株が樹立された胚の段階や、これらの細胞の手技的な取り扱いに関係しているのではないかと考えています。細胞の特性は時に変化し、細胞株の不均一性や分化能が生じるため、すべての幹細胞研究者がこの点に留意する必要があると思います。繰り返しになりますが、この原因については不明ですが、私の研究の例を挙げますと、最終的な目標は膵臓のインスリン産生β細胞を作製することです。この種の細胞株を作製するための第一段階は、胚性幹細胞から内胚葉を誘導することですが、10から20のラインで比較したところ、1つか2つのラインは効率的に内胚葉を誘導できる一方で、約半分は誘導効率が低く、中にはほとんど誘導できないラインがあることが分かりました。したがって、この初期スクリーニングプロセスを通じて、目的の細胞型への分化傾向が高い細胞を選別し、それらの細胞を用いて残りの分化誘導を進めます。ヒト胚性幹細胞の最初の樹立は1998年にThompsonらによって報告され、2004年には当研究室が17の新しいヒト胚性幹細胞株の樹立を報告しました。本手法では、これらの既報のプロトコルを修正しましたが、これらの修正は主に樹立プロセスをより効率化するためのものです。具体的には、培地組成、細胞の継代方法、および凍結融解方法の変更で構成されています。それ以来、あらゆる誘導において、プロトコルおよび誘導率を向上させるための新しい方法を模索しています。例えば、当研究室では、ウサギ抗体やモルモット血清補体のような異種試薬を使用せず、より機械的に内部細胞塊を切り出すという、内部細胞塊を単離するための代替的な方法を検討しています。これらの手法により、少なくとも同等、あるいはそれ以上の効率で内部細胞塊を単離できる方法が確立されることが期待されます。

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生物学

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