Name: クロマチンのループ構造の再編を CRISPR 媒介 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-14T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: 学ぶ CRISPR-dCas9を用いたCLOuD9システムによる選択的かつ可逆的なクロマチンループ再編と遺伝子発現制御の手法。この技術は転写動態と染色体構造の関係解明に貢献します。

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私たちは、h. チャン、T. オロ、s. Tavazoie、r. フリン、p. バティスタ、E. カロ、テクニカル サポートや原稿の重要な読書のための全体の王研究室に感謝します。S.L.M. は、国立癌研究所 (1F99CA222541-01)、NDSEGF (FA9550-11-C-0028)、NSFGRF (DGE-114747) この作品でサポートされています。K.C.W. はバローズ ・ ウェルカム財団から医療科学者のキャリア賞に支えられて、ドナルド E. とデリア B. バクスター財団国際学部奨学生。

1. gRNA デザイン
<ol><li>ガイド Rna10をデザインする標準的な gRNA デザイン ツールを選択します。開発済み CLOuD9 構造9の相補的なペアを使用して (すなわち、少なくとも 1黄色ブドウ球菌(CSA) および 1 s. 化膿(CSP) を構築) 各実験のため。<ol>
<li>選択したオンライン デザイン ツール内でガイド長さ 20 の Protospacer 隣接するモチーフ (PAM) シーケンス"NGG"を使用して、CSP と PAM の bp は、CSA の 21 のガイドの長さで"NNGRRT"をシーケンスします。</li>
		<li>選択ガイドの特異性に基づくスコアし、設計の作業ガイドを得ることのチャンスを最大化する両方のストランドのガイド。</li>
		<li>オリゴ メーカーからガイドあたり 2 オリゴヌクレオチドを注文: 前方の oligo の"caccg"5' 端にガイド シーケンスと逆のオリゴを追加、5' 端と 3' 端に"c"を注文する前に「aaac」を追加。</li>
	</ol>
</li>
	<li>当初は、250-1000 bp 地域に広がって、興味の地域ごとの 3-5 gRNAs をデザインします。効率を次のようにターゲット gRNA を評価します。<ol>
<li>アクティブの Cas9 プラスミドにクローン識別 gRNAs (手順 3 参照) 293 t 細胞 (手順 4. を参照) に transfect 一過性と11。</li>
		<li>2-3 d でダルベッコ変更イーグル培地 (DMEM) 10% 牛胎児血清 (FBS) と 1% ペニシリン-ストレプトマイシン (ペン連鎖球菌) のための細胞を成長し、収穫し、ゲノム DNA12を抽出します。</li>
		<li>ポリメラーゼの連鎖反応 (PCR) によって対象となる領域を増幅します。1.5% の agarose のゲルの製品を実行し、適切なバンドを浄化します。</li>
		<li>Guschin で説明したように T7 エンドヌクレアーゼ分析を実行ら。プロトコル13,14。 注: 効率的なガイドでは、ターゲット ・ サイトで DNA を切るために定めします。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 細胞培養
<ol><li>健康的で活発に分裂状態の細胞を維持します。<ol>
<li>K562s、10 %fbs と 1% ペン連鎖球菌でロズウェル パーク記念研究所 (RPMI) 1640 メディア文化。<ol>
<li>メンテナンスのため 25 cm2斜め首フラスコに K562s を成長し、毎日 1 mL あたり 400,000 セルにセル密度を調整します。</li>
			<li>K562s で導入したされている CLOuD9 を構築、保守メディアに 2 μ G/ml ピューロマイシンと 100 μ g/mL hygromycin を追加します。</li>
		</ol>
</li>
		<li>293Ts、文化でダルベッコ変更イーグル培地 (DMEM) 10 %fbs と 1% ペン連鎖球菌。<ol>
<li>10 cm2板の 293Ts を成長し、合流するときに分割します。</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. プラスミッドの準備と gRNA 挿入15
注: プラスミド マップ付録であり、例実験で利用されているプライマー、補足表 1で利用可能です。
<ol><li>BsmBI、アルカリホスファターゼ、バッファー、x 10 の 6 μ L と作りたて 100 mM DTT の 0.6 μ L の 3 μ L の 3 μ L でレンチの CRISPR プラスミドのミックス 5 μ。DdH2O 60 μ L に総量を持参し、消化し、プラスミドを dephosphorylate に 30 分間の 37 ° C で孵化させなさい。</li>
	<li>ゲルの消化のプラスミッドの浄化し、には ddH2o.</li>
	<li>T4 結紮バッファー、ddH2O、6.5 μ L、0.5 μ L x 10 の 1 μ L で 100 μ M で一対のガイドのそれぞれのミックス 1 μ L T4 PNK、10 μ L の総ボリュームに到達します。37 ° c、5 分間、95 ° C、30 分間インキュベートし、ランプを 5 ° C/分で 25 ° C まで。 注: これはガイドのペアをアニールします。</li>
	<li>希釈する ddH2O. 焼なましガイド (ステップ 3.3) から 1: 200</li>
	<li>ステップ 3.4、バッファー x、ddH2O、1 μ l のリガーゼ、0.5 μ L 5.5 μ L の全反応を作る 2 の 2.5 μ L から希薄結紮ガイドの 0.5 μ L で 3.2 から消化のプラスミッドのミックス 1 μ。これを消化 BsmBI プラスミドにガイドを縛ること 10 分間室温でインキュベートします。</li>
	<li>Stbl3 細菌にステップ 3.5 から新しく縛られたプラスミッドを変換し、増幅するプラスミッドの準備方法を使用します。</li>
</ol>4. レンチ ウイルス生産
<ol><li>6 ウェルのウェルあたりのカウント 750,000 293 t 細胞診断をプレートし、10 %fbs と 1% ペン連鎖球菌で DMEM でそれらを播きます。各構成要素の 1 つの井戸を使用します。</li>
	<li>10% の新鮮な抗生物質無料 DMEM にメディアを変更, 播種後 24 h FBS。</li>
	<li>1 つの管で 150 μ L 反応11あたりの OptiMEM 中の脂質ベースのトランスフェクション試薬の 11 μ L を希釈します。</li>
	<li>別のチューブでステップ 3.6、0.65 μ g pMD2.G の OptiMEM 中、反応11あたりの 150 μ L で、1 μ g pRSV-Rev の pMDLg/pRRE 0.35 μ g から CLOuD9 レンチウイルスベクターのプラスミッドの 2 μ g を希釈します。</li>
	<li>各反作用のため 1:1 の比率で希釈した脂質ベースのトランスフェクション試薬を希釈レンチ ウイルス プラスミドの混合物を追加し、115 分間インキュベートします。</li>
	<li>4.2 のステップから抗生物質無料 293 t 細胞のそれぞれの井戸へのステップ 4.5 から各混合複合体の全体のボリュームを追加します。</li>
	<li>48 時間後、ダウン 5 分 300 x g で新鮮なチューブとスピンにピペッティングによるウイルス製造メディアを収集します。遠心分離の後残留細胞の残骸を削除する新鮮なチューブに上清を移動します。</li>
	<li>すぐに標的細胞の伝達ウイルス製造メディアを利用または将来使用するため-80 ° C で凍結します。</li>
</ol>5. レンチ ウイルス細胞の伝達
<ol><li>CLOuD9 申請 80,000 セルを含む 15 mL の円錐管に関心 (補完 CLOuD9 プラスミドで構成) の各ウイルス構築の 250 μ L を追加します。</li>
	<li>メディアの総容量は、各抗生物質フリーのメディアと 1 mL に円錐形 1-8 μ g/mL (polybrene 使用電池の種類によって許容の最大濃度は、実験的に決定する必要があります) の間の最終的な集中に polybrene を追加。</li>
	<li>室温で 30 分間 800 x g でセルをスピンし、ウイルス上清を削除せずピペッティングによって再懸濁します。全体の細胞懸濁液を細胞培養プレートに移動します。</li>
	<li>24 h 後伝達、室温で 5 分間 300 x g でダウン スピン細胞。</li>
	<li>ウイルス上清を吸引し、通常の細胞培養媒体の細胞を再懸濁します。</li>
	<li>次の日に二重導入された細胞を選択する培ピューロマイシン (293 t 細胞を 1 μ g/mL) と hygromycin (293 t 細胞を 25 μ g/mL) を追加します。実験ピューロマイシン hygromycin 実験を開始する前に指定されたセルの種類の適切な濃度で判断します。</li>
	<li>下流実験前に少なくとも 3 d 選択メディアの細胞を維持し、すべての実験の期間の選択メディアの維持します。</li>
</ol>6. 細胞の活性化とを洗う
<ol><li>1 mM アブシジン酸 (ABA) を追加またはジメチルスルホキシド (DMSO) コントロール、CLOuD9 を dimerize に細胞培養のための同等のボリュームを選択し、セルを導入します。ABA を使用して、領収書の日付の 6 ヶ月以内、冷たい、維持、使用中の光から保護します。2 mM ABA は、必要な場合に利用できます。<ol>
<li>毎日新鮮な ABA (またはコントロールの DMSO) 実験の持続期間のためにメディアを変更します。 注: 二量体化の長さの制限はまだ観測されていません。</li>
	</ol>
</li>
	<li>逆にメディア ABA を含む十分なリン酸緩衝生理食塩水洗浄セル (PBS) 2 回、板の表面をカバーするための取り外しによって二量体化。その後、国連パイエルス状態を維持するために ABA 自由な媒体の細胞を培養します。</li>
</ol>7. 免疫沈降と Co-immunoprecipitations
注: は、新鮮なすぐに使用する前にすべてのバッファーを作る。
<ol><li>二量体化の実験が完了した後、収集し、細胞、スピンダウン、上清を吸引します。</li>
	<li>クロスリンクと細胞を凍結<ol>
<li>新鮮な素材を利用して常温で PBS で 1% のホルムアルデヒドの新鮮な在庫を作る。200 万セル全てに対して優しく再懸濁します丁度 10 分室温で 1% のホルムアルデヒドの 1 ml を回転させながら。 注: は、未満 1000 万セル架橋の 10 mL の最小量を使用します。</li>
		<li>0.125 M、回転させながら、室温で 5 分間インキュベーション後の最終的な集中にグリシンを加えると架橋を癒します。</li>
		<li>細胞をスピンし、氷冷 PBS で 1-2 x を洗ってください。細胞ペレット スナップ液体窒素で凍結し、-80 ° C で保存またはすぐに使用できます。 注: 熱ホルムアルデヒド クロスリンクが逆になります。急いで、スナップ凍結せず、セルは-80 ° C で直接格納できます。</li>
	</ol></li>
	<li>抗体/ビーズ共役を準備します。 注: 選択した抗体 (すなわち、別の換散バッファーのセル換散のためのテストと IP を実行する) ための最適化条件は価値がある可能性があります。2 つの共通バッファー、ファーナムの換散バッファー変更 RIPA バッファーは IP 効率および超音波処理効率に大きな影響を持つことができます。すべてのバッファー組成は、表の材料で見つけることができます。また、覚えておいて、クロマチン超音波処理は完了まで数時間かかる場合があります。<ol>
<li>ビーズを選ばれた抗体を必要に応じて簡単にボルテックスによって再懸濁します。</li>
		<li>実験用ビーズの適切な量を 1.5 mL チューブに転送します。開始点として抗体のすべて 1 μ g のビーズの 20 μ L を使用します。抗体はまだ追加しないでください。 注: は、抗体がこれが意味するだろうよりももっとまたはより少なく効率的な知られている限り、ビーズの 200 μ L で開始点として溶解液 1 mg の 10 μ g 抗体が使用します。低豊富な蛋白質のためこの比率は調整する必要があります。</li>
		<li>ファーナムの換散バッファーを使用して、IP 希釈バッファーで 3 x を洗います。RIPA 溶解バッファーを使用している場合は、RIPA 溶解バッファーで 3 x を洗います。</li>
		<li>(IP 希釈または RIPA バッファー) 7.3.3 のステップから同じバッファーの最終巻でのビードを再停止しなさい > 1 x と < ボリュームの初期 x 5。すなわち100 μ L 初期ビーズ ボリューム 100 と 500 μ L の最終的な再懸濁のボリュームを使用します。</li>
		<li>適切な濃度で洗浄ビーズに抗体を追加します。良い HA またはフラグ抗体を IP CLOuD9 構成、1:50 で抗体を使用 (μ g タンパク質: μ g 蛋白ライセート) 8 + h と 4 ° C で回転させながら一晩の間孵化させなさいと。また、室温で 2-4 時間インキュベートします。</li>
		<li>ビーズから上澄みを削除し、破棄します。</li>
		<li>洗浄は、洗浄バッファーで 3 x をビーズします。</li>
		<li>一晩インキュベート (IP 希釈または RIPA バッファー) 抗体の利用バッファーの最小ボリュームに再懸濁します。ライセートの蛋白質と結合するまで寒さを維持します。</li>
	</ol></li>
	<li>クロマチンを超音波照射します。<ol>
<li>最初 10 分間氷の上細胞ペレットにバッファーを腫れの細胞を溶解、沈降を防ぐためにすべてのいくつかの分を細胞にフリックします。 注: 一般に、500 μ L のバッファーを膨潤を 2500 万セルに追加され、そこから、拡大/縮小、か 500 μ L では未満使用しないバッファーの < 2500 万セル。</li>
		<li>Dounce は時計回りと反時計回りの両方手動で各 13。</li>
		<li>1,500 x g に 5 分の 4 ° C でダウン スピン核、上清を完全に吸引し残りの上清を除去するを繰り返し、mg 細胞ペレットの重量を量る。</li>
		<li>プロテアーゼ阻害剤を核の換散バッファーに追加 (ファーナム バッファーまたは RIPA バッファー上、いずれかを選択)。</li>
		<li>再懸濁しますに小球形にされた核に核換散バッファーの 10 の x 量を追加 (0.100 g ペレットを 1 mL の核溶解バッファーを追加するなど)。簡単に渦と氷で 10 分間溶解します。 注意: は超音波処理管のサイズに注意します。理想的なボリュームは多くの場合、< 1 mL のサンプルは、ペレットが非常に大きい場合に分割する必要がありますので。<ol>
<li>Co - ip は、材料を可溶化し希釈バッファーのボリュームを 2-3 で免疫沈降が許可されるレベルに SDS を消す簡単に核を超音波照射し、7.4.6 のステップへ進みます。非常に敏感な抗体は、SDS の濃度をさらに削減するより多くの希釈バッファーを追加します。 注: 超音波処理を停止は、ライセートをクリア。それは完全に透明、不透明・半透明白から変更されます。サンプル可能のように冷たいしはない以上超音波。</li>
			<li>チップは、徹底的に 150-1000 bp の DNA のフラグメントを取得する DNA を超音波、7.4.6 のステップへ進みます。</li>
		</ol>
</li>
		<li>4 ° C で 10 分間の最大速度で不溶性物質をスピンします。</li>
		<li>新鮮な管に溶ける材料を転送します。</li>
		<li>Co - ip は、タンパク質の濃度を測定し、7.5 の手順でプルダウンに進みます。</li>
		<li>チップ、削除の 10 μ 因数ライセートをクリアし、40 μ L の IP 溶出バッファーと 6 μ L 5 M 追加 56ul の合計のために塩化ナトリウム。95 ° C で 15 分間沸騰 3 M NaOAc ph 5、5-10 μ L を追加し、PCR 精製カラムのクリーンアップします。260 で吸光度を測定することによって DNA の濃度の測定 nm サンプル全体で標準化と。7.5 の手順でプルダウンに進みます。 注: 余分な新鮮なライセートから最高の結果が得られますが、スナップ-80 ° C で凍結し、使用できます後でライセート。場合は、凍結はないフリーズ/フリーズ解除ライセートより複数回。</li>
	</ol></li>
	<li>プルダウン<ol>
<li>新鮮なチューブに蛋白ライセートの適切な量を転送します。ファーナムの換散バッファーを使用している場合は、IP 希釈バッファー (上記) の 2.1 ボリュームで希釈します。</li>
		<li>脇に入力コントロールの上澄みを 100 μ l 添加し翌日まで 4 ° C で保存します。</li>
		<li>7.3.8 のステップからのビーズ/抗体の共役をサンプルを今すぐ追加します。</li>
		<li>一晩で 4 ° C のサンプルを回転させるし、1.5 mL チューブに液体の動きに十分なボリュームがあることを確認します。</li>
	</ol></li>
	<li>洗うし、溶出<ol>
<li>一晩回転後法的拘束力の一部として上清を保存します。その後、洗浄ビーズ IP 希釈バッファーで 3-5 x です。</li>
		<li>室温、阻害剤なしで IP 溶出バッファーを準備します。</li>
		<li>新しい管へ 15 分転送溶出 67 ° C で渦に動揺 50 μ L 溶出バッファーで溶出が錯体と繰り返し別 50 μ L。 それらの両方合計 100 μ L の溶出。 注: この溶出プロシージャからあまりにも多くのバック グラウンドがある場合熱することができますを削減または排除揺れ/孵化中。これは一般的に標的タンパク質の収量が減少が、バック グラウンドを大幅に削減は。</li>
	</ol></li>
	<li>67 ° C で加熱することにより逆にクロスリンク > 4 h。 注: これは共同 IPs 厳密に必要はありませんが、役立つことができます。<ol>
<li>Co-IP の興味のターゲット間におけるダイマー形成を強固にする、実行波 SDS ページのゲルとフラグの札または HA タグに対する抗体をプローブ 1: 1,000 で示されているように。手順 8 に進みます。</li>
		<li>チップ qPCR、正しいローカリゼーションおよび各 CRISPR dCas9 コンポーネントのターゲットを確実にきれいに列に溶出製品と 10 μ L。 実行リアルタイムの量的なポリメラーゼの連鎖反応 (qPCR) 精製 DNA に。補足表 1のプライマー、表示されているデータの活用があります。手順 8 に進みます。</li>
	</ol></li>
</ol>8. RNA の抽出および量的な PCR
<ol><li>CLOuD9 による遺伝子発現の変化を調べるためには、まず、分離、制御細胞ペレットとパイエルス細胞ペレットの両方からの総 RNA の浄化します。</li>
	<li>逆のトランスクリプション17によって浄化された RNA から相補的 DNA (cDNA) を作るし、qPCR 解析を実行します。プライマーは、補足表 1にあります。</li>
</ol>9 染色体構造の捕獲の試金
<ol><li>CLOuD9 によるゲノム遺伝子座接触の頻度の変化を観察してを染色体構造キャプチャ (3 C) を実行するには、8の試金します。</li>
	<li>定量的リアルタイム PCR による 3 つの生物学的複製のそれぞれの重複の 2 つのセットで 3 C 結紮製品を定量化します。チューブリンの軌跡から 3 C 信号にサンプルを正規化します。プライマーは、補足表 1にあります。</li>
</ol>

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<li>Montavon, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+regulatory+archipelago+controls+Hox+genes+transcription+in+digits%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A regulatory archipelago controls Hox genes transcription in digits.</a> Cell. 147, 1132-1145 (2011).</li>
<li>Lupianez, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruptions+of+topological+chromatin+domains+cause+pathogenic+rewiring+of+gene-enhancer+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Disruptions of topological chromatin domains cause pathogenic rewiring of gene-enhancer interactions.</a> Cell. 161, 1012-1025 (2015).</li>
</ol>

著者が明らかに何もありません。

The most CLOuD9 クロマチンのループで重要な手順は、: 1) 設計または正しい gRNAs を使用して、CLOuD9 導入細胞、ABA、DMSO などで毎日 2) 変化するメディア 3) ABA の鮮度を維持すること、4) の正確かつ慎重な評価を行うクロマチン構造。
CLOuD9 の制限は、選択の対象地域にガイドを設計する能力に主に存在します。ガイド Rna は二量体化するためにターゲット DNA の領域に dCas9 コンポーネントのローカライズの重要なタスクを実行し、ガイドの有効性が自分の特定のターゲット サイトに基づいています。適切な gRNA のコンポーネントなしでは、システムは元に戻せる状態を形成することはできません CLOuD9 はループを誘発しました。したがって、興味の地域ごとの複数のガイドを設計してガイドを広がって 250-1000 bp の領域で、少なくとも 1 つ成功ガイドが確保されます。ガイド位置も正確な結果に不可欠です。転写調節の上下など、背景の効果を防ぐために転写因子結合部位やその他の重要な地域に位置するガイドを避けるために重要です。また、CLOuD9 構成要素の正確な位置は若干ターゲット遺伝子の転写に影響を与えます。これは実験目的のための最も堅牢なペアを識別する、ターゲット地域のガイドの複数のペアをテストの重要性を強調します。さらに、対象地域の各ペアでは、黄色ブドウ球菌gRNAs と CSA コンストラクトをターゲットし、CSP 構造をターゲットとする gRNAs とs. 化膿の特異性の対象です。
正確な結果と正しいダイマー形成を強固にするには、また CLOuD9 構成要素の伝達に続く細胞環境の鮮度を維持することが重要としてます。毎日メディア変更し、新鮮な dimerizer (またはコントロール) の添加により、相補的な構造が近接で維持され、変更されたクロマチン構造を保持します。さらに、ABA は新鮮と (開いた風邪、光から保護維持、6 ヶ月以内) 製造元のプロトコルに従って適切に保存されている保証は、本格的な結果を得ることに不可欠です。
特によりよく活用 FRB と FKBP システムではなく、CLOuD9 の ABA dimerizer は ABI と PYL の二量化蛋白質で使用されました。FRB/FKBP システム、rapalog の必要性には、限られたがん細胞への毒性のため、CLOuD9 の適用がでしょう。ABI/PYL の代替システムより広く活用する CLOuD9 を効果的に有効にする、このような制限を回避しました。
総称して、CLOuD9、強制的にすることができますが、元に戻せる長距離ターゲット ゲノムにおける遺伝子座間の連絡先を作成するユニークな堅牢な技術を開発しました。クロマチンのループを誘導を介して我々 はまた CLOuD9 を適切な細胞における遺伝子発現を変更する利用できることを示します。技術の適応性無制限ループ領域やメカニズムをループの事前の知識を必要とせずの任意の 2 つの遺伝子座位間の相互作用に関することができます。さらに、CLOuD9 のユニークな実証可逆性により病気と開発におけるループ メカニズムの検討、さらに。クロマチンのループの対象の効果を明確に実証されている、あるまだターゲットのループに及ぼすターゲットをループと後続への影響の洞察を提供しているデータであること。
我々 のデータはのみこのツールのいくつかのアプリケーションを示していますが、クロマチン配置は遺伝子発現を示す主要な基になるアイデアを意味します。当社の技術は、研究し、遺伝子、遺伝子の転写に折りたたみクロマチンの役割の全体的な理解を向上におけるクロマチン構造の微妙な違いを明らかにする使用できます。研究と治療のがん、遺伝性疾患、先天性疾患、どの明確なクロマチン アセンブリを間違いなく遺伝子式20、変更の方法につながることができます転写ダイナミクスの機微の理解を深める 21,22,23。CLOuD9 技術を活用した後続作業がクロマチン ドメインとどのように彼らは折り畳み式の開発と病気の両方で安定した遺伝子発現を維持するためにドライブのダイナミクスの配置の詳細については、さらに点灯します。

クロマチン核ゲノムの特定の組織の折りたたみとの関係は、遺伝子式1,2と密接に関連することが示されていると近年、大きな関心を集めています。動的三次元クロマチン組織の結果として染色体の連絡先との相互作用を提供する一方、遺伝子活動とクロマチン構造の変調との正確な関係は不明のまま、えられています、遺伝子調節機能3。確かに、そのような効果は人間グロビン遺伝子座、軌跡制御領域 (LCR) が 2 つの領域4間クロマチンのループを作成することによって発達の特定の方法でグロビン遺伝子の活性を制御するどこでも実証されています。ただし、両方のこれとその他の地域は、それは不明原因や遺伝子発現の変化の結果がクロマチンのループかどうか。
今までは、この現象を勉強の課題未解決の。たとえば、クロマチンのループを誘発する他の試みに関与線形 DNA シーケンスまたは豊富なループ5,6、容易にするための特定の要素に関する背景知識を必要とする複雑な手続きを変更します。 7,8。さらに、前作は、クロマチンのループ ドライブ特定と制限されたコンテキスト7,遺伝子の発現が示唆された8がクロマチンのループに影響を与える転写グローバル レベルはあります。遺伝子発現に対する長期的ループの影響で関心は、近年継続的に成長している、けれども確立と遺伝子活動を変更するクロマチン連絡先を維持についての疑問が保持されます。
我々 は、設計技術をすべてのゲノムの軌跡9対象に広く適用できるようにヌクレアーゼ欠損クラスター化された空間定期的に短い回文繰り返し (CRISPR) - CRISPR - 関連付けられている蛋白質 9 (dCas9) を採用しています。この技術は線形 DNA シーケンスの変更に関連する複雑な問題を排除する、特定のコンポーネントがループの重要な事前の知識なしでアクセスできます。特に、ツールはユニバーサルとクロマチンのループが開発にさまざまながんなどの病気の認識に広く適用。CLOuD9 の力を発揮して、元に戻せる効果的に遺伝子発現を調節するループの構造を変えることによって。

<table><tbody><tr><td>RPMI 1640&nbsp; 培地</td><td>Life Technologies</td><td>11875-119</td><td>K562 細胞培養</td></tr><tr><td>用 DMEM 培地</td><td>Life Technologies</td><td>11995-065</td><td>1X, 293T 細胞培養</td></tr><tr><td>用 lentiCRISPR v2</td><td>Addgene plusid</td><td>#52961</td><td>CLOuD9 プラスミド開発用</td></tr><tr><td>pRSV-Rev</td><td>Addgene plasmid</td><td>#12253</td><td>レンチウイルス生産用</td></tr><tr><td>pMD2.G</td><td>Addgene plasmid</td><td>#12259</td><td>レンチウイルス生産用</td></tr><tr><td>pMDLg/pRRE</td><td>Addgene plasmid</td><td>#12251</td><td>レンチウイルス生産用</td></tr><tr><td>リポフェクタミン 2000</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>11668-019</td><td>レンチウイルス生産用</td></tr><tr><td>抗HA抗体</td><td>Cell Signaling</td><td>3724</td><td>免疫沈降</td></tr><tr><td>用抗フラッグ抗体</td><td>Sigma</td><td>F1804</td><td>免疫沈降</td></tr><tr><td>DNeasy 血液および組織キット</td><td>Qiagen</td><td>69504</td><td>DNA抽出用</td></tr><tr><td>TRIzol</td><td>Life Technologies</td><td>15596-018</td><td>RNA抽出用</td></tr><tr><td>RNeasyキット</td><td>Qiagen</td><td>74106</td><td>RNA抽出用</td></tr><tr><td>上付き文字VILO</td><td>Life Technologies</td><td>11754-050</td><td>cDNA用&nbsp;</td></tr><tr><td>SYBR Green I MasterMix</td><td>Roche</td><td>4707516001</td><td>qPCR解析用</td></tr><tr><td>Light Cycler 480II</td><td>Roche</td><td></td><td>qPCR解析用</td></tr><tr><td>抗H3K4me3抗体</td><td>AbCam</td><td>ab8580</td><td>ChIP-qPCR</td></tr><tr><td>用 抗RNA Pol-II抗体</td><td>Active Motif</td><td>61083</td><td>ChIP-qPCR</td></tr><tr><td>EDTAフリープロテアーゼ阻害剤</td><td>Roche</td><td>11873580001</td><td>タンパク質用抽出</td></tr><tr><td>4-12% トリスグリシンゲル</td><td>Biorad</td><td></td><td>任意のサイズ、ウェスタンブロット</td></tr><tr><td>用 抗ウサギHRP抗体</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-2030</td><td>ウェスタンブロット</td></tr><tr><td>用抗マウスHRP抗体</td><td>細胞シグナル伝達</td><td>7076S</td><td>ウェスタンブロット</td></tr><tr><td>用 K562およびH3K293 ChIP-Seqデータ</td><td>ENCSR000AKUをエンコード</td><td></td><td>ChIP-seq解析用</td></tr><tr><td>K562およびH3K293 ChIP-Seqデータ</td><td></td><td></td><td>ENCSR000APEのエンコード ChIP-seq解析用</td></tr><tr><td>K562およびH3K293 ChIP-Seqデータ</td><td>エンコード</td><td>ENCSR000FCJ</td><td>ChIP-seq解析用</td></tr><tr><td>K562およびH3K293 ChIP-Seqデータ</td><td>GEO</td><td>GSM1479215</td><td>ChIP-seq解析用</td></tr><tr><td>Dynabeads Protein A 免疫沈降用 サー</td><td>モフィッシャーサイエンティフィック</td><td>10001D</td><td>免疫沈降用</td></tr><tr><td>Dynabeads Protein G免疫沈降</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>10004D</td><td>免疫沈降</td></tr><tr><td>用 RNA Clean &Concentrator-5</td><td>Zymo Research</td><td>R1015</td><td>RNA精製用</td></tr><tr><td>Pierce 16% Formaldehyde メタノールフリー</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>28908</td><td>架橋用</td></tr><tr><td>PX458 プラスミド</td><td>Addgene</td><td>48138</td><td>gRNAクローニングのための提案された活性Cas9プラスミドですが、任意の活性Cas9プラスミドは</td></tr><tr><td>QIAquick PCR精製キット</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td>PCR精製用</td></tr><tr><td>FastDigest BsmBI</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>FD0454</td><td>クローニングガイドRNA FastAP</td></tr><tr><td></td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EF0651</td><td>クローニングガイドRNA</td></tr><tr><td>10X FastDigest Buffer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>B64</td><td>クローニングガイドRNA用</td></tr><tr><td>QIAquick Gel Extraction Kit</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td>クローニングガイドRNA</td></tr><tr><td>10X T4 Ligation</td><td>Buffer NEB</td><td>B0202S</td><td>クローニングガイドRNA</td></tr><tr><td>T4 PNK</td><td>NEB</td><td>M0201S</td><td>クローニングガイドRNA用</td></tr><tr><td>2X Quick Ligase Buffer</td><td>NEB</td><td>B2200S</td><td>クローニングガイドRNA用</td></tr><tr><td>Quick Ligase</td><td>NEB</td><td>M2200S</td><td>クローニングガイドRNA</td></tr><tr><td>用Buffers</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Farnham溶解バッファー</td><td></td><td></td><td>1% Tris-Cl pH 8.0、1% SDS、1% プロテアーゼ阻害剤水溶液 (非 EDTA)、および 1 mM EDTA 水溶液</td></tr><tr><td>中 Modified RIPA バッファー</td><td></td><td></td><td>1% NP40/Igepal、0.5% デオキシコール酸ナトリウム、0.1% SDS、1 mM EDTA、および 1% プロテアーゼ阻害剤水溶液 (非 EDTA) PBS pH 7.8 または 7.4</td></tr><tr><td>IP 希釈バッファー</td><td></td><td></td><td>0.01% SDS、1.1% Triton-X 100、1.2 mM EDTA、 16.7 mM Tris-HCl pH 8.0、167 mM NaCl、0.1x プロテアーゼ阻害剤</td></tr><tr><td>洗浄バッファー</td><td></td><td></td><td>100 mM Tris pH 9、100 mM LiCl、1% NP-40、1% デオキシコール酸ナトリウム</td></tr><tr><td>膨潤バッファー</td><td></td><td></td><td>0.1 M Tris pH 7.5、10 mM 酢酸カリウム、15 mM 酢酸マグネシウム、1% NP-40</td></tr><tr><td>希釈バッファー</td><td></td><td></td><td>0.01% SDS、1.1% Triton X-100、1.2 mM EDTA、16.7 mM Tris pH 8 および 167 mM NaCl</td></tr><tr><td>IP 溶出バッファー</td><td></td><td></td><td>1% SDS、10% NaHCO3 &nbsp;</td></tr></tbody></table>

クロマチンのループ構造の再編を crispr 媒介

CRISPR-Mediated Reorganization of Chromatin Loop Structure

最近の調査示した、長距離、三次元クロマチンのループの相互作用の再生がループが担当かどうかまたは遺伝子発現の変化の結果、遺伝子発現の調節に重要な役割はまだ明らかに不明です。最近まで、比較的あいまいなされている遺伝子活性と細胞機能の調節のしくみクロマチンのループおよびこれらの構造体を操作する既存のメソッドの制限を防ぐこれらの相互作用の詳細な調査。この不確実性を解決するには、我々 は選択的かつ可逆的なクロマチン ループ再構成法を設計 CRISPR dCas9 (CLOuD9) を使用します。CLOuD9 システムのダイナミズムは、CLOuD9 の構成要素がローカル クロマチン構造を調節する遺伝子座をターゲットのローカリゼーションの成功によって実証されています。重要なは、逆に誘導の接触および内因性クロマチン構造を復元する機能が確認されています。この方法で遺伝子発現の調節細胞の遺伝子発現を調節する能力を確立し、安定したde novo遺伝子に著しく影響するクロマチンのループの作成にこの技術の応用のための大きな可能性を強調がんと開発のコンテキストにおける式。

遺伝子発現制御に重要な役割を果たしているクロマチンのループただし、クロマチンのループの選択的かつ可逆的な変更を可能にする技術の進歩はいません。ここでクロマチンのループの再編成のための強力なシステムを記述対象遺伝子座に CRISPR dCas9 (CLOuD9) を使用して、選択的かつ可逆的に遺伝子発現を調節することが実証します。

クロマチンのループ構造の再編を CRISPR 媒介

Recent studies have clearly shown that long-range, three-dimensional chromatin looping interactions play a significant role in the regulation of gene ...

この方法は、クロマチン構造が遺伝子発現にどのような影響を与えるか、クロマチン組織が転写ダイナミクスをどのように調節するかを示す、遺伝子発現に関する重要な質問に答えるのに役立つ可能性があります。この技術を開発した理由は、染色体アーキテクチャを制御的に変化させ、長距離クロマチンループの作成を可能にしたからです。一方、クロマチンコンテキストを逆にして内因性染色体構造を復元する能力を有する。この方法は、使いやすさと広い適用性のために設計されました。私たちは、システムがより広く使用できるように、非毒性二量体とdcas9の直交種を利用しました。この方法を開発したのは、遺伝子発現が染色体アーキテクチャを受けるかどうか、染色体構造が遺伝子発現の変化につながるのかという長年の鶏と卵の問題に答えることができるようにしたからです。CRISPRガイドRNA配列の設計および細胞培養の維持は、テキストプロトコルに記載されている。プラスミドマップと利用されたプライマーがそこにリストされている。プラスミド調製を開始し、レンチウイルスCRISPRプラスミドの5マイクログラムを、3マイクロリットルのBsmB1 3マイクロリットルのアルカリホスファターゼ6マイクロリットルの10x消化バッファーと0.6マイクロリットルのDTTの新鮮な100ミリモルを混合することによって、プラスミド調製を開始する。総体積を60マイクロリットルの二重蒸留水に持ち込み、37°Cで30分間インキュベートし、プラスミドを消化して脱リン酸化します。次いで、ゲルは、ループプラスミドおよび二重蒸留水中の消化プラスミドを精製する。次に、ガイドRNAペアに対するアニーリング反応を調製する。各ガイドRNAの1マイクロリットルを100マイクロモルで、1マイクロリットルの10x T4ライゲーションバッファー6.5マイクロリットルの二重蒸留水と0.5マイクロリットルのT4 PNKを組み合わせて、合計10マイクロリットルの反応量を得ます。ガイドRNAペアを標的配列にアニールするには、30分で摂氏37度で混合物をインキュベートし、続いて摂氏95度で5分間インキュベーションし、毎分5度ずつ摂氏5度下げることで徐々に温度を25度に下げます。次に、アニールガイドRNAを二重蒸留水で1〜200で希釈します。次に、2つのライゲーション反応を調製します。消化したプラスミドの1マイクロリットルを0.5マイクロリットルの希釈されたペリバニアガイドRNAse 2.5マイクロリットルの2xライゲーションバッファー1マイクロリットルの二重蒸留水と0.5マイクロリットルのリガーゼと混合する。反応を室温で10分間インキュベートし、BsmB1消化プラスミドをガイドにリゲートします。次に、新たに合体したプラスミドを安定な3つの細菌に変換し、任意のプラスミド調製方法を使用して細菌を増幅する。6ウェルプレートでは、10%FBSと1%ペンストレップを備えたDMEMの種子750、000 2n3 Tcells。各構成物に1つの井戸を使用し、24時間細胞をインキュベートします。翌日、培地を10%FBSでフレッシュな抗生物質フリーDMEMに変更します。メッキされた細胞の各ウェルのための媒体を変更した直後にレンチウイルス産生混合物のチューブを準備する。各反応につき、11マイクロリットルの脂質基トランスフェクション試薬を、各反応に対して150マイクロリットルのOpti-MEM培地で希釈する。次に、別々のチューブでDNAを調製する。CLOud9レンチウイルスベクタープラスミドの2マイクログラムを、他のレンチウイルス包装成分の2マイクログラムと組み合わせます。この混合物をオプティ-MEM培地の150マイクロリットルで希釈します。次に、希釈された脂質ベースのトランスフェクション試薬で希釈レンチウイルスプラスミド混合物の等量を組み合わせ、室温で5分間インキュベートします。次に、細胞の各ウェルに、調製した混合物の1つのチューブを追加し、インキュベーションを継続する。48時間後、プレート井戸から円錐形にウイルス産生媒体を移し、300gで5分間回転させる。その後、ペレット化された破片を廃棄するために新鮮なチューブに上清を転送します。今、すぐにターゲット細胞を変換したり、将来の使用のために摂氏80度でそれを凍結するためにウイルス産生培地を使用しています。目的の各ウイルス構造の250マイクロリットルを追加することから始め、この場合、80,000細胞を含む50ミリリットルの円錐管に相補CLOud9プラスミドで構成される。次に、溶液中のミリリットル当たり1〜8マイクログラムの間になるように十分なポリブレンを加えます。次に、抗生物質を含まない培地を用いて、各チューブの総体積を1ミリリットルに調整します。ウイルス粒子と細胞との接触を増加させると、室温で30分間800gで細胞を回転させる。次に、ピペット処理により上清で細胞を再懸濁する。次に、細胞の懸濁液を培養プレートにロードし、24時間インキュベートします。翌日、細胞を収集します。室温で5分間300gで遠心分離し、通常の培地で再中断します。翌日、ピューロマイシンとハイグロマイシンを培地に添加し、二重に細胞を導入します。抗生物質の適切な濃度は、各細胞の種類のために事前に決定する必要があります.次いで、下流の適用を進める前に少なくとも3日間、選択培地中の細胞をインキュベートし、細胞および選択培地を維持し続ける。選択した細胞およびトランスデューチされた細胞を二量体化するために、培養皿に1ミリモルABAを加える。コントロールの場合は、DMSO を追加し、実験の間、ABA または DMSO でセルを維持します。二量体化を逆にするには、プレートの表面を2回覆うのに十分なPBSで細胞を洗います。その後、ABAフリー培地中の培養細胞は、それらを未二量化状態に維持する。CLOud9系の適切な使用は、細胞培養培地へのABAの添加または除去を通じて、相補的なCSAおよびCSP CLOud9コンストラクトの可逆的接触を誘発する。CSAおよびCSPの構成体は標準的なCRISPRガイドRNAAseを使用して適切なゲノム領域に局在する。クロマチン免疫沈降後に定量PCRを使用し、各CLOud9成分を標的化する際に正確な局在化を確実に行った。さらに、ABAの有無にかかわらず共免疫沈殿は、リガンドの存在下でCSAおよびCSP二量体化を検証し、同様にリガンドの不在時の可逆性を検証した。ABA二量体化後、β-グロビンとLCRとの間のより大きな接触を染色体確認捕捉によって測定した。しかし、これは CSA のみを含むコントロールまたは CSP コンストラクトのみで見られなかった。LCR β-グロビン相互作用を作成しても、内因性LCRグロビン接触を完全に排除したわけではない。元の連絡先にのみ追加されます。β-グロビンLCR接触における増加は、標的LCRまたはβ-グロビンプロモーター領域内の正確な領域に関係なく72時間の二量化を通じて観察された。最後に、ABAを取り外した後の染色体確認キャプチャでシステムの可逆性を確認した。これは、内因性の確認の完全な更新をもたらしました.この手順を試みる間、メディアを変更し、新鮮な二量体CLOud9トランスデューシス細胞を毎日追加することを覚えておくことが重要です。レンチウイルスの使用は非常に危険であり、BSL 2で使用されるすべての予防措置は、常にこの手順を実行するときに取られる必要があります忘れないでください。

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Research

JoVE Journal

Genetics

遺伝学

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マウスT細胞株におけるクロマチン免疫沈降（ChIP）

学ぶ CRISPR-dCas9を用いたCLOuD9システムによる選択的かつ可逆的なクロマチンループ再編と遺伝子発現制御の手法。この技術は転写動態と染色体構造の関係解明に貢献します。

クロマチンのループ構造の再編を CRISPR 媒介

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