校正と単一のヌクレオチドの拡張子と MALDI-TOF 質量分析を用いた DNA 修復アッセイ

この方法は、校正方法や分析、DNA修復、DNA修復パッチの定義など、DNAポリマーのフィデリティとDNA修復の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、非常に具体的で、シンプルで、迅速で、実行が容易であることです。一般に、この方法に不慣れな個人は、まだDNA複製に携わっているため、修復分野は質量分析装置やデータ解釈に精通していない可能性があるため、苦労します。

最も重要なのは、突然変異や代理などの臨床応用のための商業的に開発された質量分析が、DNAの校正や修復研究にどのように便利に適合できるかを示すことができるため、視覚的なデモンストレーションが非常に重要であることだと思います。その手順を実演するのは、私の研究室のRong-SyuanとKuei-Chingの大学院生です。この手順は、テキストプロトコールに記載されているプライマーとテンプレートの調製から開始します。

例として、基材P21とT28のTGミスマッチを校正に使用します。P21プライマーとT28テンプレートを水で1マイクロリットルあたり12.5ピコモルに希釈します。次に、希釈したプライマー12マイクロリットルと希釈したテンプレート12マイクロリットルを1.5ミリリットルの滅菌済みマイクロ遠心チューブに移します。

チューブをしっかりと閉じた後、蓋付きの65°Cのウォーターバスでチューブを30分間インキュベートします。その後、摂氏37度の水浴中で30分間インキュベートします。そして最後に、チューブを氷の上に置いて、適切な焼きなましを確保します。

1.5ミリリットルの滅菌済みマイクロ遠心チューブに、8マイクロリットルのプライマーとテンプレートミックス、2マイクロリットルの10倍校正反応バッファー、4マイクロリットルの4ddNTPsミックス、および最大18マイクロリットルの水を追加します。チューブをフリックして混ぜます。DNAポリメラーゼを氷冷した1xプルーフリーディング反応バッファーで目的の濃度に希釈します。

希釈した酵素は常に氷上に保管してください。マイクロ遠心チューブを基板混合物で予熱し、目的の反応温度にします。次に、希釈したDNAポリメラーゼの2マイクロリットルを予め加温した基質混合物に移し、チューブをフリックして内容物を混合します。

酵素と基質を含むチューブを、常温で重力の3200倍で数秒間遠心分離し、反応の成分をスピンダウンします。反応を直ちに、所望のインキュベーション温度で加熱ブロックまたは水浴に移します。反応を終了するには、等量の緩衝フェノールを加え、数秒間ボルテックスして反応を混合します。

次に、室温で重力の3200倍のマイクロ遠心分離機で反応を5分間遠心分離します。水相をきれいなマイクロ遠心チューブに移し、等量のクロロホルムを添加します。数秒間ボルテックスして混合した後、周囲温度で重力3200倍のマイクロ遠心分離機でサンプルを3分間遠心分離します。

水相をきれいなマイクロ遠心チューブに移します。反応を摂氏95度で5分間インキュベートした後、チューブを氷の上に置きます。次に、テキストプロトコールに詳述されているように、384ウェルプレートの塩分汚染を排除するために樹脂添加を行います。

サンプルプレートをナノリットルディスペンサーにセットします。マトリックスチップと準備した384ウェルプレートを対応するトレイに置きます。ナノディスペンサーを操作して、チップへの反応生成物を見つけます。

nano-dispenserのタッチスクリーンにある実行ボタンを押して開始します。画面上の飽和情報を含むサンプルスポットの自動キャプチャ画像をチェックして、チップ上の全体的なスポット体積が約5〜10ナノリットルであることを確認します。容量が不十分な場合は、サンプルスポッティングを繰り返します。

形式のファイルを準備します file インポート用の予想される信号情報が含まれています。アプリケーションプログラムで新しいアッセイを作成および定義するには、デザイナー形式の「Import assay group」を右クリックし、Excelファイルを選択します。画面左側にある顧客プロジェクトプレートオプションツリーでターゲットアッセイプレートを樹立するには、ツリーの上部を右クリックしてファイル名を付けます。

384ウェルプレートタイプを選択し、OKを押します。ブランクプレートが表示されます。画面の左側で適切なアッセイを選択します。選択したアッセイをチップ上の各スポットサンプル位置に割り当てるには、ウェルを強調表示し、右クリックしてプレックスの追加を選択します。

次に、チップ上のすべてのテストの作業リストをヘッダーなしのExcel形式で準備します。新しいサンプルプロジェクトの追加オプションを使用して作業リストをインポートします。P21T28アッセイの各位置にテストとワーキングリストを割り当て、右クリックして選択します。

アプリケーションプログラムを使用して、質量分析計をチップにリンクします。画面右側でデフォルト設定を選択します。アッセイ名とチップの角にあるチップIDを入力します。

設定を保存し、MS制御プログラムを起動します。イン/アウトボタンを押して、スカウトプレートを取り出します。スポッテッドチップをスカウトプレートに置き、スポッテッドチップのイン/アウトボタンを押して質量分析計に入ります。

アプリケーションプログラムの集録ボタンをクリックすると、質量分析が開始され、データが集録されます。データ分析用のプログラムを開きます。左上隅にあるデータベースのツリーを参照し、チップIDを選択します。画面の右側にあるデータファイルを開きます。

スペクトルアイコンをクリックすると、マススペクトルが表示されます。特定の範囲の質量を過充電で切り抜くには、右クリックしてカスタマイズダイアログを選択します。新しいウィンドウで、x軸をクリックして目的の上限と下限を設定し、[OK]を押してスペクトルの指定された範囲を表示します。

レコード保持のためにスペクトルをエクスポートするには、エクスポートを右クリックします。JPEGファイルの種類を選択し、[宛先]をクリックし、[ディスクの参照]を選択し、ファイル名を入力して、[エクスポート]をクリックします。データ定量を行うには、カーソルを使用してピークをクリックすると、左上隅にピークの高さが表示されます。

MALDI-TOF MSでは、オリゴヌクレオチド質量のピーク強度の間には反比例の関係があります。17 ヌクレオチドから 24 ヌクレオチドまでのオリゴヌクレオチドを MS 分析にかけました。相対シグナル強度を計算し、プルーフリーディングまたはリペアアッセイの定量化に使用できました。

テンプレートシグナルとプライマーシグナルの両方が質量スペクトルに見出されました。サイズの違いにより、テンプレートからのシグナルとその非特異的な部分分解生成物は、不一致のプライマーおよび校正生成物から十分に分離されました。ここに示されているのは、5分間 TG.At 3つのプライム端末の校正であり、修正された製品は23%であったのに対し、切除された製品は17%でした。

この差は、20分後には69%に対して14%に拡大し続けました。MS の高分解能により、サブストレート信号と製品信号が明確に分離され、質量過充電差はわずか 32 であることに注意してください。また、簡単に解決できたのは、ペンの究極のTG校正用の2つの形式の切除製品でした。

1つのヌクレオチド除去中間体と2つのヌクレオチド除去製品。内部ミスマッチの校正では、校正効率の傾向がはっきりと示されました。大規模な校正製品の話で証明されているように、サブストレートでは、3つのプライムエンドから最後、最後から2番目、3番目、および4番目のヌクレオチドにミスマッチがある場合、他の位置でのミスマッチと比較して、効率の向上が観察されました。

このテクニックは、一度マスターすれば、適切に実行すれば4時間で完了します。この手順に続いて、ポリマー状プルーフリーディング・ヒープイッター・スクリーニングなどの他のアプリケーションを実施して、医薬品研究用の新薬を発見し、発明することができます。また、この技術は、DNAの複製と修復の分野の研究者が、ノームの医学と、すべての生物に対するその忠実な複製について、より深い洞察を得るための道を開くものです。

このビデオを見れば、MADI-TOF質量分析を用いたDNAプルーフリーディングと修復アッセイの方法について十分に理解できるはずです。スフェノクロロホルムの取り扱いは危険な場合があり、手順を実行するときは常に個人用保護具を着用するなどの予防措置を講じる必要があることを忘れないでください。本文中の代替プロトコルは、より安全な代替プロトコルと見なすことができます。