Name: 同所性同種人間神経膠腫異種移植片のマウスモデルの細胞傷害性免疫細胞の定位の養子転送 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 15 s
Description: 学ぶ ヒトリンパ球のステレオタクシック投与による膠芽腫治療法。免疫不全マウスを用いた細胞傷害性免疫細胞の定位養子転送プロトコルと抗腫瘍効果の評価方法を解説。

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著者は、ナントから大学病院動物施設 (UTE) ナントの畜産とケア、細胞と組織イメージング、イメージング ナント大学 (MicroPICell) の中核施設とフローサイトメトリー施設 (Cytocell) のスタッフに感謝します。彼らの専門家のテクニカル サポート。この仕事 INSERM、CNRS、ユニヴェルシテ ・ ド ・ ナント、Institut 国立デュがん (インカ #PLBio2014-155)、リーグのナシオナル contre le がん (AO 地域間 2017 年)、欧州コンソーシアム時代ネット Transcan2 によって資金が供給された (Immunoglio)。チームは財団注ぐラ凝った Medicale (DEQ20170839118) によって資金を供給します。LabEX 囲碁のコンテキストでこの作品を実現し、IHU セスタス プログラムでサポートされている、国家研究機関 Investissements d'Avenirを介してプログラム ANR-11-LABX-0016-01 と ANR-10-IBHU-005、それぞれ。IHU セスタス プロジェクトはナント メトロポールとペイ ・ ド ・ ラ ・ ロワール地域でもサポートされます。著者は、Chirine ラフィア ・が原稿を修正ヘルプを提供することをありがちましょう。

次プロシージャを含む動物科目制度ガイドライン (契約 #00186.02; ペイ ド ラ ロワール [フランス] の地域倫理委員会) によるとを行った。人間の PBMCs は情報に基づいた健康なドナー (エタブリセモン Français デュ歌ったナント, フランス) から集められた血から分離しました。すべての手順は、無菌条件の下で実行されます。
1. 非特異的細胞エフェクター T 細胞の拡張
<ol><li>準備し、フィーダー細胞 35 Gy を照射します。2 x 105 - 4 x 105エフェクター細胞の刺激の 3 つの明確な健康なドナーから 10 x 106 PBMCs と 1 x 10 の6 BLCLs を準備します。</li>
	<li>フィーダー細胞と 15 ml の 10% の熱不活化 FCS、2 ミリメートル L グルタミン、ペニシリン (100 IU/mL) とストレプトマイシン (0.1 μ g/mL) と 300 IU/mL 組換え IL-2 添加 RPMI のエフェクター細胞を再懸濁します。</li>
	<li>最終濃度 1 μ G/ml に PHA L を追加、慎重にミックス、および 150 μ L/ウェルの 96 穴 U 底プレート細胞懸濁液を配布します。</li>
	<li>37 ° C で、加湿雰囲気で 5% CO2で孵化させなさい。</li>
	<li>大細胞塊文化井戸のフォームまでプレートの日常点検 (~ 7 日)。</li>
	<li>1 x 106セル/mL の新鮮な培養液中で培養用フラスコにセルを転送します。</li>
	<li>(2 倍の週) を数えることで細胞数を決定し、新鮮な培地の 1 x 106セル/mL でそれらを維持します。 注: エフェクター免疫細胞は静止状態 (初期増幅刺激後通常 3 週間) で治療的投与の準備ができてする必要があります。純度とこれらのエフェクター細胞の反応性は、生体内注入 (例えば、生体外の試金と) 前にチェックしなければなりません。</li>
</ol>2. 術前のエフェクター細胞の準備
<ol><li>エフェクター細胞数を確認した後遠心分離 (300 x gで 5 分) で 50 mL のチューブでエフェクター細胞を収集します。 注: 任意の損失を補うために細胞 (例えば50 × 106) の超過分を準備します。</li>
	<li>慎重に上澄みを除去し、15 mL の滅菌 PBS と 300 × gで 5 分間遠心洗浄を実行するのに細胞を再懸濁します。</li>
	<li>慎重にそして完全に上澄みを除去し、1 mL の滅菌 PBS で細胞ペレットを再懸濁します。</li>
	<li>5 分間 300 × gで遠心分離を 1.5 mL マイクロ チューブの再懸濁のセルを転送します。</li>
	<li>慎重にそして完全にゆっくりとピペッティング上澄みを削除します。</li>
	<li>マウスごと滅菌 PBS の 8 μ L で細胞ペレットを再懸濁します。 注: これは重要なステップです。</li>
	<li>マイクロ ピペットを用いて細胞懸濁液の量を測定します。必要に応じて、滅菌 PBS (20 × 106線量あたり 15 μ L の PBS セル) を追加し、慎重に混ぜます。</li>
	<li>15 と 20 μ L (強制的 < 20 μ L) 間マウスあたり最終巻にあるマイクロ ピペットを使用して確認してください。</li>
	<li>定位注射まで氷の上細胞を保ちます。 注: 3 時間以上縦長はテストしませんでした。</li>
</ol>3. 定位注射
<ol><li>
機器のセットアップ
	<ol>
<li>組み立てるし、頭蓋内注射 (例えば、シリンジ サイズ、音量、注入の速度) の精度を確保するための製造元の指示に従って小動物定位脳手術フレームをキャリブレーションします。 注: 低速注入率は (すなわち2 〜 3 μ L/分) 推奨します。</li>
		<li>感染症から微生物安全キャビネット (MSC) 楽器の無菌性を維持し、マウスを保護するための下で材料をインストールします。 注: 場所"等温ブロック」の 37 ° C の水浴中このシステムは、手術中にマウスの体温を制限します。手続き後のケアのために必要であるパッドを加熱は、連続温度監視中に使用する必要があります。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
動物の術前準備
	<ol>
<li>ケタミン (10 mg/mL) とマウスの体重の 10 μ L/g でキシラジン (0.1 mg/mL) の腹腔内注入マウスを麻酔します。</li>
		<li>完全な麻酔と動物の鎮痛を確保するつま先ピンチ テストを実行します。 注: 任意の動きが非深い鎮痛の表示、操作を繰り返す前に、数分以上が必要な場合は。</li>
		<li>マウスは麻酔は正しく、(間に 2 つの耳、鼻まで) 手術部位から毛皮を削除するのにはさみを使用します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
術前セル準備
	<ol>
<li>任意のセルの凝集を防ぐために各注入前にピペットで細胞の (複数回) を慎重に再懸濁します。</li>
		<li>慎重に泡の吸引を避けるために 22 G 変らずに必要な細胞懸濁液容積 (15-20 μ L) を描画します。 注: 変らずにこのセルの読み込み手順は注入されたボリュームでの差異を最小化することが重要です。各コホートのエフェクター細胞学も数を確保するための手続任意のセルの凝集を防ぐために個別注射用セルを再読み込みします。</li>
		<li>その後、適応シリンジ ポンプに注射器を配置します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
手続きの注意
	<ol>
<li>ポビドン ヨードの 5% 溶液を少なくとも 3 に浸した綿棒で手術部位を消毒 x。</li>
		<li>マウスの目の角膜の乾燥防止のために潤滑の眼軟膏を配置します。</li>
		<li>暖かい等温ブロック上の定位脳手術フレームに麻酔下のマウスの位置は、手術中にマウスの温度を維持し、死亡率を制限する滅菌ラップで覆われて。 マウスの鼻と歯注: はプロシージャの間に十分な呼吸流量を確保するため、歯のバーの上適切に配置する必要があります。</li>
		<li>歯のバーの上にマウスが、一度頭を固定するマウスの耳の下でしっかりとイヤバーを締めます。 注: するまたは呼吸の妥協に鼓膜を損傷しないように注意してください。</li>
		<li>頭蓋骨を公開する後方前方から頭蓋の上部に沿って滅菌ハサミで 1-2 cm 正中矢状皮膚切開を確認します。</li>
		<li>矢状面と冠状縫合糸 (図 1に示すように) 注入前に定位のローカリゼーションのためのランドマークとして機能する (前) 交差点を識別します。</li>
		<li>このポイントより上, マイクロシリンジを配置します。</li>
		<li>変らず右横 2 mm と 0.5 mm 前の前方に移動します。</li>
		<li>あらかじめ定義された座標で滅菌ドリルで頭蓋骨に小さな穴を作り、ドリルを使用する。脳の任意の外傷性の損傷を避けるために表在性のままに注意してください。 注: このプロトコルでは、免疫細胞が確立された腫瘍 (腫瘍細胞の注入後 1 週間) 内で注入されました。皮膚がリニューアル オープン (瘢痕)、注射をする必要があります (穴は注入後 2 週間までまだ存在一般に) 腫瘍細胞移植に使用される同じ座標で行われます。座標は、脳実質13,14の腫瘍とエフェクター細胞を注入するために選ばれました。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
免疫エフェクター細胞の注入
	<ol>
<li>慎重に穴に、変らずを挿入し、ゆっくり動いて、硬膜下 3 mm とエフェクター細胞を注入する前に 2.5 mm の最終的な深さにして後方 0.5 mm の針を転送します。</li>
		<li>2-3 μ L/分でエフェクター細胞の注入を実行し、射出時間に沿ってマウスを監視します。</li>
		<li>注入が完了すると、わずか 1 mm の針を撤回し、変らずを注入サイトから漏洩を防ぐため、変らず撤退完全にゆっくりと前に 1 つの追加分の場所に保管します。 注: 次の定位脳手術装置から動物の除去、今後実験用噴射装置がすぐにきれい。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
手術後のケアとマウスのフォロー アップ
	<ol>
<li>定位脳手術フレームから動物を削除してすぐに切開部位のポビドン ヨード溶液の 5% を適用し、適切な外科的縫合糸で皮膚を閉じます。</li>
		<li>傷口に直接 2% リドカイン ゲルを適用し、手続き後の鎮痛のため皮下注射ブプレノルフィンの 0.15 μ g/g を管理します。</li>
		<li>場所戻ってマウスの適切な体温を維持し、低体温症を避けるために、加熱パッドの上のケージに麻酔下のマウスは 37 ° C に設定。 注: 別のハウジングは必要ではありません。</li>
		<li>それは完全に麻酔から回復するまでマウスを監視し、ハウジング ルームにそれを転送します。 注: までに、このプロトコルもサポートいくつかの予期せぬ合併症が発生したとして (注入されたマウスの < 5%)。</li>
		<li>毎日、マウスを監視し、(例えば、背を丸めて姿勢、減らされた移動性、虚脱、または重要な体重減少 [≥ 15%])、健康の減少兆候が観察されるときそれらを安楽死させます。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

著者が明らかに何もありません。

養子伝選択ネイティブまたは設計された免疫エフェクター細胞腫瘍浸潤の脳腫瘍、非変形細胞15、に対して反応性を制限することの世話などを効率的に治療するために有望なアプローチを表す 16,17,18。ただし、脳を含む中枢神経系は、血液脳関門の存在と古典的なリンパ排液システム19,20の不足のために特に特定の免疫状態です。これらの生理学的機能は人身売買組織に影響を与えるし、免疫細胞の全身性注射を危険にさらす可能性があります。これらの障害を克服するためには薬理学的化合物21,を含む微小球に関しては、腫瘍部位に密接に抗腫瘍細胞は配信ではなくローカルの原則に野末注射を検討しています<sup class="xref...

糸球体基底膜 (WHO グレード IV 星状細胞腫) は、成人では最も頻繁に、積極的な脳腫瘍の症例です。積極的な治療法は手術とラジオ化学療法を組み合わせた、GBM 変わりません非常に予後不良 (14.6 カ月と 2 年死亡 > 73% の生存期間中央値)1に関連付けられています。これは、いくつかの効率的な治療の進歩が2の最後の 10 年を検証されている証拠します。効果的な治療戦略3,4、5のデザイン候補の中で免疫療法6現在検討するいると高度侵襲とラジオ/化学療法抵抗性の腫瘍を削除セルは、迅速かつ致命的な腫瘍再発7への重要な貢献の疑いがあります。様々 な潜在的な免疫学的ターゲットが識別されたとの提案された免疫療法や自然を含むまたは変更した αβ GBM の腫瘍抗原など応力誘起分子8,9、ϒδ T リンパ球 10。選択した糸球体基底膜反応免疫細胞エフェクターを管理する可能性は、残存腫瘍のサイトに直接エフェクター リンパ球の上昇量を提供するユニークな機会を表します。この戦略をサポートするため、我々 は最近脳腫瘍 GBM 患者9,11の開発を忠実に同所性同種ヒト糸球体基底膜移植を運ぶ免疫不全マウスに基づくモデルに要約を示しています。さらに、これらのモデルに対して転送された同種の人間 Vϒ9Vδ2T のリンパ球の強い抗腫瘍活性効率を示すため使用されました。
このプロトコルでは、糸球体基底膜、同種リンパ球の養子の転送に基づくなどの脳腫瘍の定位放射線免疫療法を達成するため重要な実験手順について説明します。記事ショー: (i) 治療同種免疫エフェクター T リンパ球, リンパ球 Vϒ9Vδ2T 人間; などの増幅(ii) これらのエフェクター T のリンパ球の注射用の準備(iii) 内腫瘍近傍の脳定位放射線管理のための手順。この記事は、定位注射後これらの細胞のエフェクターの行動に洞察力を提供します。
ここで紹介する治療法は、それぞれの脳腫瘍免疫不全マウスの線量あたり20 x 106エフェクター細胞の注入に基づいています。初期の in vitro拡張ステップは、免疫細胞の大量生産に必要です。したがって、非特異的細胞拡張フィトヘマグルチニン (PHA L) を使用して実行され、同種フィーダー細胞を照射: 健常者とエプスタイン バール ウイルス EBV 変換 B リンパ芽球細胞から末梢血単核球 (PBMCs)EBV を含む培養 1 μ G/ml シクロスポリン A の存在下で、マーモセット B95 8 細胞ラインから上清中の体外感染による PBMCs 由来株 (BLCLs)
抗糸球体基底膜の免疫細胞が比較され、生体外の試金9から選択。これらのエフェクター細胞がアクティブになります、標準プロトコルを使用して (例えば、人間 Vγ9Vδ2 T リンパ球9またはヒト抗ヘルペス ウイルス T リンパ球12) 性質に従って最低純度として日常的に、> 80% で増幅フローサイトメトリー解析をチェックします。下記のとおりセル拡張プロシージャは、様々 な人間のリンパ球のサブセットに適用されます。

<table><tbody><tr><td>3つの異なる健康なドナーからの</td><td>PBMC</td><td></td><td></td></tr><tr>3<td>つの異なるドナーからの</td><td>BLCLロ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ズウェルパークメモリアルインスティテュートミディアム(RPMI)</td><td>Gibco</td><td>31870-025</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>Dutscher</td><td>S1810-500</td><td></td></tr><tr><td>L-グルタミン</td><td>Gibco</td><td>25030-024</td><td></td></tr>ペ<tr><td>ニシリン/ストレプトマイシン</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>IL-2</td><td>ノバルティス</td><td>プロリューキン</td><td></td></tr><tr><td>PHA-L</td><td>シグマ</td><td>L4144</td><td></td></tr><tr><td>脳定位固定装置フレーム</td><td>Stoelting Co.</td><td>51600</td><td></td></tr><tr><td>マウスアダプタッカー (脳定位固定装置用) &nbsp;&nbsp;</td><td>ストールティング株式会社</td><td>51624</td><td></td></tr><tr><td>マイクロシリンジポンプインジェクター&nbsp;</td><td>WPI</td><td>UMP3-4</td><td></td></tr><tr><td>NanoFilシリンジ</td><td>WPI</td><td>NF34BV-2</td><td></td></tr><tr><td>NSGマウス</td><td>Charles River</td><td>NSGSSFE07S</td><td></td></tr><tr><td>Ketamine</td><td>Merial</td><td>Imalg&egrave;ne 1000</td><td></td></tr><tr><td>キシラジン</td><td>バイエル</td><td>ロンプール 2%</td><td></td></tr><tr><td>はさみ</td><td>WPI</td><td>201758</td><td></td></tr><tr><td>鉗子</td><td>WPI</td><td>501215</td><td></td></tr><tr><td>OmniDrill 115/230V</td><td>WPI</td><td>503598</td><td></td></tr><tr><td>Vicryl 4-0</td><td>Ethicon</td><td>VCP397H</td><td></td></tr><tr><td>キシロカイン</td><td>アストラゼネカ</td><td>3634461</td><td></td></tr></tbody></table>

同所性同種人間神経膠腫異種移植片のマウスモデルの細胞傷害性免疫細胞の定位の養子転送

Stereotactic Adoptive Transfer of Cytotoxic Immune Cells in Murine Models of Orthotopic Human Glioblastoma Multiforme Xenografts

膠 (GBM)、成人では、最も頻繁に、積極的な脳腫瘍の症例は、予後不良な一般的に関連付けられている、最後の 10 年間で不足している効率的な治療法が提案されています。新しい治療戦略を設計するための有望な候補者、間細胞免疫療法は高度侵襲を排除する対象となっているし、化学療法放射線腫瘍細胞、可能性がありますこの癌の迅速かつ致命的な再発に関与します。したがって、腫瘍近傍の人間の Vϒ9Vδ2 の T リンパ球など、同種の糸球体基底膜反応免疫細胞エフェクター administration(s) 効率を提供するユニークな機会を表しますが、非常に直接の治療薬に集中して、脳の悪性腫瘍のサイト。同所性同種人間原発性脳腫瘍を運ぶ免疫不全マウスにおける準備と同種の人間のリンパ球の脳定位固定装置の管理のためのプロトコルを紹介します。本研究は、可能性と intrabrain 腫瘍ベッド内で同種の人間のリンパ球の定位注射に依存するこれらの細胞免疫療法の抗腫瘍効果の前臨床証拠の概念を提供します。

本研究では、脳内定位注射腫瘍ベッド内で直接実行に基づく腫瘍を持つマウスの細胞免疫エフェクター細胞の養子の転送の戦略について説明します。
大規模な注入量に関連付けられている脳損傷のすべてのリスクを最小限に抑える、エフェクター細胞懸濁液 (20 x 106 15 20 μ L の PBS セル) を集中する必要があります。この細胞濃度ステップがエフェクター細胞の生存率に影響を与える可能性があるかどうかを確認するには、これらの細胞は説明プロトコルに従って準備され、変らずに読み込まれます。エフェクター細胞は、変らずにそれらをロードした後すぐに、または 10 分を収集しました。セルは、propidium ヨウ化 (PI)、細胞側の透過物と異なる縦長 (0、24、72 時間) でフローサイトメトリーによる解析ではない蛍光 DNA のデュアルインターカレーション剤で染色しました。準備と読み込み、変らずに有意に影響しないことエフェクター細胞の生存...

同所性同種人間原発性脳腫瘍を運ぶ免疫不全マウスにおける準備と同種の人間のリンパ球の脳定位固定装置の管理のためのプロトコルを紹介します。本研究は、実現可能性と intrabrain 配信細胞免疫療法の抗腫瘍効果の概念実証を提供します。

Glioblastoma multiforme (GBM), the most frequent and aggressive primary brain cancer in adults, is generally associated with a poor prognosis, and scarce ...

多形性膠芽腫は、成人において最も頻度が高く、侵攻性の原発性脳腫瘍であり続けています。手術とそれに続く放射線療法、化学療法に基づく積極的な治療にもかかわらず、GBMは予後が非常に不良で、生存期間の中央値は15か月未満です。過去10年間で治療の進歩がほとんど見られなかったため、細胞免疫療法は現在、急速な腫瘍再発に関与する可能性のある高侵襲で耐性のあるGBM細胞を排除するために研究されています。腫瘍の近傍で選択されたGBM反応性細胞傷害性免疫因子の投与は、残存悪性腫瘍の部位に直接濃縮細胞免疫療法を送達するユニークな機会を表す可能性があります。私たちのグループは最近、同所性初代ヒトGBM異種移植片を持つ免疫不全NSGマウスがGBMを患者のより多くの発達に再現することを示しました。これらのGBMモデルは、腫瘍内注射に対する細胞傷害性免疫エフェクターの有効性を評価するために使用されました。このプロトコルは、最初にGBM反応性免疫エフェクター細胞の単離と増幅に基づく治療プロセスを説明しています。第二に、頭蓋間注射のためのこれらのエフェクター細胞の増殖。そして第三に、マウスの脳内の腫瘍部位への定位注射です。同所性注射後の免疫エフェクターの挙動についても調査しました。PHA胎児刺激の3週間後、フラスコの底に細胞の塊を形成するエフェクター細胞は静止状態に戻り、使用する準備ができているはずです。エフェクター細胞数を確認した後、115ミリリットルのチューブに細胞を再懸濁して回収し、遠心分離します。上清を慎重かつ完全に取り除きます。そして、細胞を滅菌PBSに再懸濁し、遠心分離して洗浄します。上澄みを丁寧に完全に取り除きます。次に、1ミリリットルの滅菌PBSに細胞を再懸濁します。細胞をマイクロチューブに移し、遠心分離します。再度、ゆっくりとピペッティングして上澄みを慎重に完全に取り除きます。次のステップは重要で、無菌PBSの最終容量の半分に細胞を再懸濁し、柔らかく慎重に均質化します。マイクロピペットで最終容量を確認すると、マウスあたりの最終容量は2,000万個の細胞に対して15〜20マイクロリットルである必要があります。マウスあたり20マイクロリットルを超えないようにしてください。注射まで細胞を氷上に保ちます。動物がつま先をつまんで適切に麻酔されていることを確認し、手術部位、2つの耳の間、鼻までの毛皮を取り除きます。細胞の凝集を防ぐために細胞をゆっくりと再懸濁し、気泡の存在を避けるために細心の注意を払って細胞懸濁液をシリンジにロードします。次に、シリンジを適合したシリンジポンプに入れます。手術部位を塩とポビドンヨード5%溶液で消毒し、角膜の乾燥を防ぐためにマウスの眼に潤滑性眼軟膏を置きます。次に、麻酔をかけたマウスを暖かいブロックの定位フレームに配置します。マウスの鼻と歯を歯のバーの上に適切に配置します。マウスの耳にイヤーバーをしっかりと締めて、頭を固定します。鼓膜を傷つけたり、呼吸を損なったり、頭がしっかりと固定されていることを確認したりしないように注意してください。頭蓋骨の上部に沿って滅菌ハサミで正中線矢状皮膚切開を行い、頭蓋骨を露出させます。立位局在化の目印となる矢状構造と冠状構造の交点を特定し、この点の上にシリンジを置きます。シリンジを所定の座標で動かします。右横2ミリ、前方0.5ミリのマイクロドリルを使用して、滅菌ドリルビットで頭蓋骨に小さな穴を開けます。脳損傷を避けるために、表面的なままでいるように注意してください。ドリルで開けた穴にシリンジを慎重に挿入します。硬膜内で針をゆっくりと前方に3mm下に動かし、次に0.5mm後方に動かして、最終的な深さである2.5mmの細胞注入を行います。細胞注入を毎分2〜3マイクロリットルで実行し、注入時間全体にわたってマウスを監視します。注射が完了したら、針を1mmだけ引き抜き、シリンジをさらに1分間所定の位置に保持してから、注入部位からの漏れを防ぐためにシリンジをゆっくりと完全に引き抜きます。定位フレームから動物を慎重に取り外します。適切な外科的縫合糸で皮膚を閉じ、2%リドカインゲルを傷口に直接塗布します。.麻酔をかけたマウスを、37°Cに設定された温熱パッドの上のケージに移し、麻酔から完全に回復するまでマウスの体温を適切な状態に保ちます。懸濁液は非常に濃縮されているため、細胞の生存率と反応性を確認しました。エフェクター細胞を注射器にロードして、in vivo注射を模倣しました。細胞を直ちに、または10分後に採取し、ヨウ化プロピジウム染色のためにフローサイトメトリーで分析しました。ご覧のとおり、調製とローディングは、24時間でのエフェクター細胞の生存率に影響を与えませんでした。膠芽腫腫瘍細胞に対する反応性も、未調製の細胞または調製したエフェクターを使用して確認し、眼に3時間滞在しました。反応性は、活性化マーカーCD107Aの陽性染色によってモニターされます。これらの結果は、エフェクター細胞の反応性が調製によって影響を受けなかったことを示しています。エフェクター細胞の注射から7日後、マウスの脳を採取し、切片化し、腫瘍構造を同定するために血液着色のために染色しました。その後、抗ヒトCD3染色により、エフェクター細胞の局在化が可能になりました。興味深いことに、エフェクター細胞は腫瘍の周囲と腫瘍のコアだけでなく、反対側の半球にも見られました。マウス脳から単離されたヒトエフェクターT細胞は、注射後48時間で脳細胞の2%に相当します。彼らは、PHA、フィーダー、およびIL2刺激の存在下でも増殖することができ、増幅後の純度は99%でした。このプロトコルのおかげで、休息中のヒトエフェクター細胞は、定位固定剤注射後数日間、マウスの脳実質で生存し、パトロールすることができます。結論として、定位注射によるヒトエフェクター細胞の養子導入は、健康な細胞への有害な影響が限られている浸潤性悪性脳腫瘍を効率的に治療するための有望なアプローチを表しています。この投与経路は、ヒト細胞が腫瘍部位に近接して送達され、組織および生物内での希釈を制限するという利点を利用しています。ここでは、エフェクター細胞に有害な影響を与えることなく、また重要なことに、マウスに目に見える有害な影響を与えることなく、脳腫瘍内に大量の免疫細胞を送達した後の手順について説明しました。さらに、マウスの脳に局所注射された免疫細胞は、生体外で活性化および増幅される能力を維持して生存できるだけでなく、周囲の脳組織に播種した腫瘍細胞を排除します。全体として、これらの特徴は、GBM腫瘍を特徴付ける強力な浸潤性腫瘍細胞の排除を可能にするために不可欠です。このプロトコルは、脳腫瘍のマウスモデルにおける養子移植手順の確立のための新たな機会を開きます。臨床用CDを検討する前の重要なステップ。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

私たちは、ヌードマウスとその後シリアルの脳に人間の多形性膠芽腫細胞の正確な、定位注入のための統合方法を説​​明...

定位頭蓋内注入と<emインビボ&gt;</em多形性膠芽腫のマウスモデル系における腫瘍異種移植片の&gt;生物発光イメージング

このビデオは、ヒトの脳腫瘍を持つマウスモデルにヒトのエフェクターTリンパ球を投与するための定位固定剤注射技術を示しています。腫瘍担重麻酔マウスを定位フレーム上に配置して、頭蓋骨の注入位置にバリ穴を開けると、腫瘍部位にエフェクターTリンパ球を注入します。...

エフェクターTリンパ球をヒト脳腫瘍を持つマウスに導入

悪性神経膠腫は、臨床的および分子的特徴が異なる非常に浸透性の高いグリア新生物の不均一なグループを構成する。原発性異形移植片は、前臨床動物モデルにおける悪性神経膠腫サブタイプの組織病理学的および分子的特徴を再現する。...

原発性異形性神経膠腫は浸潤性の増殖とイソクエンテインゲナーゼI突然変異

表現型の野生型アストロサイトと神経幹細胞は、floxed、条件付き発癌性対立遺伝子で操作され、ウイルスCre媒介組換えを介して形質転換されたマウスから採取され、同系で免疫能力のある同腹仔の脳に形質転換細胞を同所性注射することにより、in vitroおよびin...

モデル星細胞腫発症機序体外とインビボ皮質アストロサイトまたは条件付き、遺伝子改変マウスから神経幹細胞を使用した

脳はよくインビトロまたは異所性の分析によって示されていない資質を持つユニークなサイトです。再現性のある場所および成長特性を有する同所性マウスモデルを確実に定位固定装置及び低圧シリンジポンプを用いて頭蓋内の注射を使用して作成することができる。...

解剖学的に正確な作成と人間の脳の腫瘍の再現性頭蓋内異種移植片

化学療法と放射線標準治療のリンパ球除去および免疫調節効果は、T細胞免疫療法の抗腫瘍効果を高めるために活用することができます。EGFRvIII特異的キメラ抗原受容体(CAR)T細胞を作製し、膠芽腫の標準治療の文脈でそれらを投与する方法を概説します。...

ケアの膠芽腫の標準のコンテキストにおける養子療法のためのCAR T細胞の生成

腫瘍を求めて治療間葉系幹細胞 (MSCs) 侵襲神経膠芽腫のための処置として約束を示します。最適な移植には、足場に腫瘍切除キャビティへの MSCs の配信が含まれます。ここでは、神経膠芽腫の MSC 治療を研究する臨床技術を含んで提供される: 画像ガイド下腫瘍切除;MSC シード足場;...

膠芽腫の治療の幹細胞シード足場の頭蓋内注入画像誘導切除

ここでは、遺伝子操作されたモデルマウス腫瘍に由来する細胞の頭蓋内注射によって樹立されたGBMの前臨床同所性マウスモデルについて述べる。このモデルは、ヒトGBMの疾患の特徴を示しています。トランスレーショナル研究のために、マウス脳腫瘍は in vivoMRI および組織病理学によって追跡される。...

多形性膠芽腫の並進同所性モデル

同所性小児脳腫瘍モデルの開発には、がん細胞を正確に移植するための定位固定装置を使用するという、細心の注意を払った精度が必要です。ここで紹介する方法論は、脳腫瘍細胞の調製、頭蓋内注射の実施、および脳腫瘍の生着を評価するための術後モニタリングシステムの実装に関連するステップを概説しています。...

脳腫瘍に対する同所性患者由来異種移植モデルの確立

膠芽腫は壊滅的な原発性脳腫瘍であり、レーザー間質温熱療法は、手術不能な膠芽腫に対する従来の外科的切除に代わる有望な治療法として浮上しています。このプロトコルは、治療効果またはアジュバントおよび組み合わせ治療の研究に使用できる最適化された前臨床マウスモデルについて説明しています。...

神経膠芽腫のレーザー間質性温熱療法のための免疫適格マウスモデル

このプロトコルの目的は、研究者に頭蓋内移植のための再現性の高い技術を提供することです。...

マウスにおける膠芽腫患者由来異種移植細胞株の立体定位頭蓋内移植

学ぶ ヒトリンパ球のステレオタクシック投与による膠芽腫治療法。免疫不全マウスを用いた細胞傷害性免疫細胞の定位養子転送プロトコルと抗腫瘍効果の評価方法を解説。

同所性同種人間神経膠腫異種移植片のマウスモデルの細胞傷害性免疫細胞の定位の養子転送

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