Name: マウス モデルにおける静脈内投与と胎嚢内子宮内移植 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 43 s
Description: 学ぶマウス胎内移植の静脈内および胎嚢内投与法。免疫寛容な胎児環境への細胞導入技術で、発生生物学と遺伝子治療の研究に応用できます。

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実験プロトコルは、機関動物ケアおよびフィラデルヒィアの小児病院で使用委員会によって承認されました。
1. インジェクション ピペットの創造
<ol><li>垂直マイクロ ピペット引き手を使って 100 μ L マイクロキャピ ラリー ピペット (図 1 a ・ 1 C) を引き出します。> 1 cm 長いテーパー エンドがあるのでマイクロ ピペットの引き手を調整します。 注: 当初、引き手の設定を最適な長さに調整する必要があります。高い熱設定は長く、先端になるし、プルを高く設定、先端の直径を幅を狭くします。</li>
	<li>それは ≥ 1 cm 長いテーパー エンドをカットします。保障、針の先端の内径が 70 μ m ~ 100 μ m、テーパー エンドの長さに反比例します。 注: 内部の直径は、ピペットの引き手の校正によっても異なります。垂直マイクロ ピペットの引き手や最寄りのピペットの引き手タイプの製造元からの指示を参照してください。</li>
	<li>針が正しい内部直径を有することを確認した後に、ピペット beveller を用いたシャープ ホイール (図 2 a ・ 2 C) ダイヤモンド チップを研ぐことにより 15-20 度の傾斜面を作成します。速報や先端の割れの可能性を減らすため、あまりにも多くの圧力なしホイールの上に優しくヒントを休ませることを確認します。 注: ペイント ブラシを使用針の先端にたまるごみを拭き取りますとできます。</li>
	<li>顕微鏡下で先端を評価し、先端がチップやクラックなしでのラウンドであることを確認します。70 μ m、100 μ m (図 2 D - 2 時間) の間にあるかどうかを確認する内部の直径を再評価します。</li>
	<li>それらの間の体積の 5 μ L を指定する針の残りの部分に線を描画 (例えば、内径 1.3 mm の針は 3.77 mm 刻みで描画される線とはず)。</li>
	<li>オートクレーブ針前に手術で使用し、滅菌手袋で処理します。</li>
</ol>2子宮内注射。
<ol><li>準備必要は事前にそれらをオートクレーブに入れることによって楽器します。マイクロインジェクター針ホルダー、手術針ドライバー、アドソン鑷子、湾曲した正規の組織用のハサミ、1 mL インスリン注射器、綿の先端アプリケータのカップル、転送ピペット、50 mL の円錐管のペアのペアなど必須の楽器を含めると4-0 polyglactin 910 縫合糸のパック。</li>
	<li>生殖不能の技術を使用して、持針器に針を添付、ガラスシリンジに差し込みます。 注: 圧縮された窒素の使用の設定が続いて、: 4-6 psi を注入、0 psi のバランスをとる。何が注入される、具体的には、注入液は、粘度だけでなく、マイクロ ピペットのサイズに応じて噴射時間によって異なります 0.3 - 1.5 s。</li>
	<li>滅菌 1 リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) x の 5-10 μ L を描画し、それを消去可能な破片の針の先端をきれいに。この 2 〜 3 倍を繰り返します。</li>
	<li>手術のため、クリッパーで腹部を削って妊娠 2-6 ヶ月齢の雌マウスを準備します。乳首を傷つけないように注意します。経口鎮痛薬 (例えば、マウスあたり 1.5 mg/mL メロキシカム経口懸濁液を 100 μ l 添加) を管理します。</li>
	<li>希望の音量で必要な材料 (セル/ベクトル/薬) と針を充填を開始します。針を充填しながら針先を壊さないように注意してください。 注: 胎児あたりの注入量は、特定の実験的なデザインによって異なります。20 μ L に適して注入多数のセル (つまり、卵黄の静脈に 10 の7セルまで。例えば、納品は 1 x 107全骨髄細胞由来の C57BL/6TgN(act-EGFP) OsbY01 ["B6 緑色蛍光タンパク質 (GFP)"] マウスを介して妊娠 14 日 Balb/c 胎児に卵黄の静脈。ウイルスのベクトル注射用 10 μ L の PBS で 1:1 希釈ベクトルの単一の注入に適しています。</li>
	<li>射出時間を調整するには、以下の手順を実行します。<ol>
<li>プッシュモードボタン注入調整画面を取得するマイクロインジェクターの 3 倍です。100 ms とプッシュモードボタンを 2 倍または 10 の間隔を追加することで射出時間を調整します。</li>
		<li>バランスボタンを押して、一度足のペダルをプッシュします。今もう一度ペダルをプッシュし、プッシュあたり針から空にどのくらいの量を評価します。ペダル プッシュあたり 5-20 μ L の音量に、校正されていない場合は、手順 2.6.1 と 2.6.2 を繰り返します。 注: 一般に、一度に半分の合計ターゲット ・ ボリュームに配信する各プッシュを調整する良いです。以上 30 μ L または合計台数も 40 μ L 注入することが可能ですが、我々 一般的に行っていない静脈または内羊水、胎児ごと 20 μ L 以上。</li>
	</ol></li>
	<li>目的のレベルまで針をご記入ください。</li>
	<li>1 L/分に酸素流量計と 3% にイソフルラン気化器を調整することによってマウスに麻酔を提供することを開始します。</li>
	<li>ペダルの反射の有無をチェックしてマウスを麻酔するかどうかを確認します。仰臥位で加熱パッドにマウスを転送します。</li>
	<li>角膜の乾燥を避けるために潤滑ゲルを適用します。場所でマウスを固定するには、パッドに上肢および下肢のテーピングします。</li>
	<li>アルコールによって従ったクロルヘキシジン スクラブで腹部を準備し、(例えば0.25% ブピバカインの 100 μ L) 局所麻酔薬を皮下注入 (図 3A)。</li>
	<li>ハサミでは、1-2 cm の皮膚切開を作るし、下の境界線が; 腟口は 1 cm よりも近い下にある筋膜が非常に薄く、半透明です。</li>
	<li>周囲よりもより透明な筋膜の正中線を識別します。正中線の両側にある腹部の血管を傷つけないように注意してください。必要があります腹部血管が傷つけられて得る、出血を止めるための綿の先端アプリケータで圧力を保持します。</li>
	<li>アドソン鑷子を使用すると、腸、膀胱、胎児など基になる臓器のいずれかをつかむことがなく筋をつまみます。器官の損傷を与えないように注意しながら、ハサミで筋膜を開きます。一度安全に腹部の筋膜切開を延長します。皮膚切開よりも、それはもはやを作る。</li>
	<li>綿の先端アプリケータを使用すると、妊娠子宮を公開するので、腹部の上部に腸内を移動します。切開、慎重に識別するすべての胎児が (図 3B) を数えられるように右と左の卵巣から子宮を提供します。</li>
	<li>腹部に戻って左の子宮を置き、右の子宮だけが公開されています。これは子宮の乾燥を防止し、非注入胎児を暖かく保ちます。</li>
	<li>親指と人差し指の演算子の非支配的な手 (図 3C) 最も外側の胎児/羊膜嚢を保持します。胎児に損害を引き起こさないため穏やかな、常に。</li>
	<li>解剖顕微鏡 (10 倍が理想的です) を置き、胎児がビューでフォーカスを調整します。良い視覚化のための照明を調整します。</li>
	<li>注入する部分を識別 (卵黄静脈、羊膜)。静脈注射は、まず卵黄の静脈との吻合を視覚化します。胎嚢内注射方向右側に胎児を表示します。</li>
	<li>下記のとおり、針でターゲット領域に到達します。<ol>
<li>静脈注射をした手順に従います。<ol>
<li>挿入される卵黄静脈が; 針の先端に平行になるので、子宮を回転します。2 つの静脈の吻合部へ注射を行う必要があります覚えておいてください。</li>
			<li>5 ° の角度で子宮に針を置き、子宮の壁に穴を開けます。先端が子宮の壁から羊膜嚢、卵黄の静脈の上に直接先端を配置します。</li>
			<li>ほぼ接線の角度で傾斜面を貫き、船の進出まで静脈に針を滑空します。これは、針の先端 (図 3D) に見られる血液のフラッシュによって明らかです。 メモ: 針が静脈に最初のグライドと静脈を貫通可能性がありますないと数回の試行をかけて静脈にアクセスします。</li>
		</ol>
</li>
		<li>胎嚢内注射、手順に従います。<ol>
<li>羊膜の嚢を回転させ、貫通する血管に欠けている場所を見つけます。</li>
			<li>子宮の壁に垂直の針をポイントし、子宮、卵黄嚢し羊膜の嚢を貫通します。任意の胎児組織を貫通しないように注意します。としてこれは羊膜の嚢に針がある確認する手足間で針が渡されることを確認します。注射に進みます。</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>足のペダルを押すことによって必要な材料 (通常 10-20 μ L) の適切なボリュームを挿入します。 注: インジェクターを針先の可視化を維持しなければならないので、顕微鏡を用いたすべての回、2 番目の人では注入量を定量化し、どのくらいの量を注入する残っているインジェクターを知らせる針のマーキングを読む必要があります。インジェクターとアシスタントの間注入する前に議論は、混乱と遅延を避けるために重要です。これは、遅延抜針は針と不正確な投与の結果に静脈血が逆流することを許可するために静脈注射に特に重要です。</li>
	<li>適切なボリュームを配信したら、注射部位から針を撤回します。いくつかの出血することがある容器は静脈内注射でサイトを穿刺、出血を止めるための 10-15 秒の針の側に圧力を保持します。</li>
	<li>次の胎児に進みます。右子宮角のすべての胎児が注入されているまで続行します。</li>
	<li>腹部から左子宮角を削除し、腹膜腔の内部に戻って右子宮角を置き換えます。 注: 時折、針、注射液と補充される必要です。</li>
	<li>すべての胎児が注入されている一度腹部 (図 3E) に子宮を交換してください。子宮や腸軸捻転症を避けるためにことを確認します。</li>
	<li>使い捨て可能な移動のピペットと無意識の損害を交換する腹部に約 2 mL の 1x PBS を配置します。</li>
	<li>筋膜および閉鎖 (図 3F - 3 G) の中に基になる器官が負傷を避けるために 4-0 polyglactin 910 縫合糸を使用して 1 つの連続的な層で腹部を閉じます。</li>
	<li>テープを取り外し、熱ランプの下にケージにマウス。マウスに余りに近く熱のランプを配置しないように注意してください。ケージには、寝具、食糧および水を確認します。 メモ: サーモスタットに制御された暖かい部屋を使っても可能性があります。マウスは、それは直立歩行し、目を覚ましです。</li>
	<li>マウスを毎日観察し、必要に応じて鎮痛薬を与えます。 注: 我々 日常的に与えるメロキシカム術後日 1、2 と 3 日目の時にマウスの痛みの兆候を示している場合。</li>
	<li>同じ注入材料とバッチの手術を行う場合は、滅菌 PBS で注射針を一掃します。異なる材料を注射、シャープス コンテナー内の針の処分、新しい針を使用してください。 注: ダムが母乳を介して子犬へと転送抗体に対する免疫応答をマウントの場合、出生後すぐにサロゲート ダムと子犬を育成をお勧めします。</li>
</ol>

<ol><li>Loukogeorgakis, S., Flake, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+utero+stem+cell+and+gene+therapy%3A+current+status+and+future+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pediatric+Surgery%22%5BJournal%5D)">In utero stem cell and gene therapy: current status and future perspectives.</a> European Journal of Pediatric Surgery. 24, 237-245 (2014).</li>
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<li>Peranteau, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correction+of+murine+hemoglobinopathies+by+prenatal+tolerance+induction+and+postnatal+nonmyeloablative+allogeneic+BM+transplants%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Correction of murine hemoglobinopathies by prenatal tolerance induction and postnatal nonmyeloablative allogeneic BM transplants.</a> Blood. 126 (10), 1245-1254 (2015).</li>
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<li>Peranteau, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD26+Inhibition+Enhances+Allogeneic+Donor-Cell+Homing+and+Engraftment+after+in+utero+Hematopoietic-Cell+Transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">CD26 Inhibition Enhances Allogeneic Donor-Cell Homing and Engraftment after in utero Hematopoietic-Cell Transplantation.</a> Blood. 108 (13), 4268-4274 (2006).</li>
<li>Waddington, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+utero+gene+transfer+of+human+factor+IX+to+fetal+mice+can+induce+postnatal+tolerance+of+the+exogenous+clotting+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">In utero gene transfer of human factor IX to fetal mice can induce postnatal tolerance of the exogenous clotting factor.</a> Blood. 101 (4), 1359-1366 (2003).</li>
<li>Stitelman, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+Stage+Determines+Efficiency+of+Gene+Transfer+to+Muscle+Satellite+Cells+by+in+utero+Delivery+of+Adeno-Associated+Virus+Vector+Serotype+2%2F9%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy+-+Methods+%26+Clinical+Development%22%5BJournal%5D)">Developmental Stage Determines Efficiency of Gene Transfer to Muscle Satellite Cells by in utero Delivery of Adeno-Associated Virus Vector Serotype 2/9.</a> Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 1, 14040(2014).</li>
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<li>Boelig, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Intravenous+Route+of+Injection+Optimizes+Engraftment+and+Survival+in+the+Murine+Model+of+In+utero+Hematopoietic+Cell+Transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Blood+and+Marrow+Transplantation%22%5BJournal%5D)">The Intravenous Route of Injection Optimizes Engraftment and Survival in the Murine Model of In utero Hematopoietic Cell Transplantation.</a> Biology of Blood and Marrow Transplantation. 22 (6), 991-999 (2016).</li>
<li>Wu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intra-amniotic+Transient+Transduction+of+the+Periderm+with+a+Viral+Vector+Encoding+TGF%CE%B23+Prevents+Cleft+Palate+in+Tgf%CE%B23-%2F-.+Mouse+Embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Intra-amniotic Transient Transduction of the Periderm with a Viral Vector Encoding TGFβ3 Prevents Cleft Palate in Tgfβ3-/-. Mouse Embryos.</a> Molecular Therapy. 1, 8-17 (2013).</li>
<li>Roybal, J., Endo, M., Radu, A., Zoltick, P., Flake, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+gestational+gene+transfer+of+IL-10+by+systemic+administration+of+lentiviral+vector+can+prevent+arthritis+in+a+murine+model%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Early gestational gene transfer of IL-10 by systemic administration of lentiviral vector can prevent arthritis in a murine model.</a> Gene Therapy. 18 (7), 719-726 (2011).</li>
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<li>Ahmed, S., Waddington, S., Boza-Morán, M., Yáñez-Muñoz, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Efficiency+Transduction+of+Spinal+Cord+Motor+Neurons+by+Intrauterine+Delivery+of+Integration-Deficient+Lentiviral+Vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">High-Efficiency Transduction of Spinal Cord Motor Neurons by Intrauterine Delivery of Integration-Deficient Lentiviral Vectors.</a> Journal of Controlled Release. 273, 99-107 (2018).</li>
<li>Haddad, M., Donsante, A., Zerfas, P., Kaler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fetal+Brain-Directed+AAV+Gene+Therapy+Results+in+Rapid%2C+Robust%2C+and+Persistent+Transduction+of+Mouse+Choroid+Plexus+Epithelia%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy+-+Nucleic+Acids%22%5BJournal%5D)">Fetal Brain-Directed AAV Gene Therapy Results in Rapid, Robust, and Persistent Transduction of Mouse Choroid Plexus Epithelia.</a> Molecular Therapy - Nucleic Acids. 2, 101(2013).</li>
<li>Nijagal, A., Le, T., Wegorzewska, M., MacKenzie, T. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21307829">A mouse model of in utero transplantation.</a> Journal of Visualized Experiments. (47), e2303(2011).</li>
<li>Davey, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Jaagsiekte+Sheep+Retrovirus+Pseudotyped+Lentiviral+Vector-Mediated+Gene+Transfer+to+Fetal+Ovine+Lung%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Jaagsiekte Sheep Retrovirus Pseudotyped Lentiviral Vector-Mediated Gene Transfer to Fetal Ovine Lung.</a> Gene Therapy. 19 (2), 201-209 (2011).</li>
</ol>

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子宮内移植は、妊娠の早い段階で診断することができます多くの先天性疾患に対する潜在的な療法です。IUT のマウスモデルでは、研究者胎児環境を探索するか、別の治療法を実験することができます。挿入されると何が目標とされている、に応じて静脈または内羊膜の子宮内移植は望ましい領域に、乳液の信頼できる配信を提供できます。
特定の臓器をターゲットにする場合は、注入の技術と同様、胎児の適切な発生学的年齢を選択することが重要です。E14 で細胞の静脈注射は血液のニッチをターゲットに最適、E16 で胎嚢内注入は肺をターゲットに最適です、これらのオプションだけではありません。たとえば、胎嚢内注射が行えます胎児 E8 早くも超音波ガイダンス8。全身配信も E9 - E1011で超音波ガイド下心臓内注射で E14 まで可能です。胎児の開発のさまざまな段階で注射を実行する可能性を提供しています安全性と遺伝子の転送の効率を調査実験の大きな可能性と発達の基本的な質問の調査だけでなく、...

出生前スクリーニングと診断の最近の進歩は、光の十分な出生後の治療法の選択肢を持っていないと重大な罹患率と死亡率は、先天性疾患の数の胎児の治療の可能性に持ち込んでいます。具体的には、子宮内で造血幹細胞移植 (IUHCT) と遺伝子治療・ ゲノム編集血液疾患、免疫、および遺伝的、先天性の治療に胎児の正常発達特性を活用する可能性があります。産後の HSC 移植と遺伝子治療・ ゲノム編集1,2を行うことができますよりもより効率的に障害します。具体的には、胎児のサイズが小さいため、ドナー細胞またはウイルスのベクトル量を最大化できる受信者の重量あたり。さらに、胎児の免疫学的未熟さは、生後移植プロトコルでドナー造血骨髄破壊的と免疫調節せずに注入することが必要なことができます。同様に、遺伝子プロダクトまたはウイルスのベクトルに対する制限免疫応答せず治療遺伝子やゲノム編集技術を運ぶウイルスベクターに注入することができます。最後に、アクセシビリティと胎児幹細胞/前駆細胞の増殖の性質余裕サイクリングを必要とするゲノム編集 (ホモロジー監督修理) モードと同様、ターゲットの前駆細胞のより効率的な情報伝達の可能性効率的に発生する細胞。マウスのモデルは前臨床試験の大規模な動物モデルでみる前に免疫・幹細胞生物学の重要な問題に対処するための洞察力と手頃な手段として提供していますなど、IUHCT と子宮内で主要なモデルを務めて遺伝子治療の検討1,2,3をされています。
多くの変数は、IUHCT と子宮内遺伝子治療・ ゲノムの編集のマウスと大型の動物モデルで成功に重要な役割を果たす、重要な変数は HSCs またはウイルスのベクトルの配信方法。マウスおよび大動物モデル4 の生着の macrochimeric レベルの達成に尽力する胎児の肝臓、IUHCT の時に造血臓器で発生する初回通過効果を持つドナー造血の大量投与の配信が示されています。 ,5。これは達成を介してのドナー細胞を介してマウス モデルにおける卵黄の静脈を介して心臓内注射犬のモデルでインジェクションだった。注射経路開発中に別の臓器の前駆細胞をターゲットの基本的な役割を果たします。たとえば、静脈注射を介して効率的にヘッジホッグ心筋細胞と肝細胞の遅い妊娠注入6、7の後卵黄の静脈を示されています。また、ウイルスベクターの胎嚢内注射により注入8時胚折りたたみ/開発に基づいて物理的にさらされている臓器のターゲットします。これは羊水のウイルスのベクトルする気道を公開する通常の胎児""呼吸動きの活用に妊娠後期の胎嚢内注射を介して呼吸上皮のターゲットによって例証される最高流体9。静脈を介して膜の静脈の IUT のこれらの 2 つのモードとイントラ羊水、私たちの研究室で複数の過去および継続的な実験のための基礎をされています。このプロトコル マウス モデルにおける静脈内投与と胎嚢内の IUT の実行方法について詳細に述べる.

<table><tbody><tr><td>手袋</td><td>Cardinal Health</td><td>2D73DP65</td><td></td></tr><tr><td>Adson Forceps w /歯</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>11027-12</td><td></td></tr><tr><td>Adson Forceps w / o teeth</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>11006-12</td><td></td></tr><tr><td>湾曲したハサミ</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>14075-11</td><td></td></tr><tr><td>重いハサミ</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>14002-13</td><td></td></tr><tr><td>ニードルドライバー</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>12005-15</td><td></td></tr><tr><td>Vicryl 2.0</td><td>Ethicon</td><td>JB945</td><td></td></tr><tr><td>トランスファーピペット</td><td>メドライン</td><td>GSI135010</td><td></td></tr><tr><td>コットンチップ アプリケーター</td><td>メドライン</td><td>MDS202000</td><td></td></tr><tr><td>50 mL コニカルチューブ</td><td>フィッシャー サイエンティフィック</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>テープ</td><td>3M</td><td>1527-1</td><td></td></tr><tr><td>アイ潤滑剤</td><td>メジャールブリフレッシュ</td><td>0904-6488暖房</td><td></td></tr><tr><td>パッド</td><td>K&H</td><td>3060</td><td></td></tr><tr><td>実体顕微鏡</td><td>ライカ</td><td>MZ16</td><td></td></tr><tr><td>インジェクター</td><td>成重</td><td>HI01PK01</td><td></td></tr><tr><td>ガラス毛細管</td><td>キンブル</td><td>71900-100</td><td></td></tr><tr><td>縦型マイクロピペット プーラー</td><td>サッター装置</td><td>P-30</td><td></td></tr><tr><td>マイクロ電極ベベラー</td><td>サッター装置</td><td>BV-10</td><td></td></tr><tr><td>IM-300空気圧マイクロインジェクター</td><td>成茂</td><td>IM-300</td><td></td></tr><tr><td>インスリン注射器&nbsp;</td><td>BD&nbsp;</td><td></td><td></td>305935</tr><tr><td>フィルター</td><td>ジェネシーサイエンティフィック</td><td>25-244</td><td></td></tr><tr><td>Compac5麻酔器</td><td>VetEquip Compac5</td><td>901812&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>イソフルラン</td><td>Piramal Critical Care</td><td>NDC 66794-017-25</td><td></td></tr><tr><td>N2ガス</td><td>エアガス</td><td>NI 125</td><td></td></tr><tr><td>O2ガス</td><td>エアガス</td><td>OX 125</td><td></td></tr><tr><td>Ad-GFPウイルスベクター</td><td>ペンベクターコア</td><td>H5'.040.CMV.eGFP</td><td></td></tr></tbody></table>

マウス モデルにおける静脈内投与と胎嚢内子宮内移植

Intravenous and Intra-amniotic In Utero Transplantation in the Murine Model

子宮内移植 (IUT) は、妊娠の早い段階で他の物質やウイルスベクター、幹細胞を導入するための療法のユニークで多彩なモードです。治療目的のための IUT の背後にある理論的根拠は胎児、胎児の免疫学的未熟さ、アクセシビリティおよび増殖性胎児の幹または前駆細胞、病気を治療するために潜在的なまたは症状の発症の小さなサイズに基づいています前に誕生。必要ななく、鎌状赤血球症など先天性の血液疾患を治療するために可能性を秘めて、IUT 胎児、造血幹細胞 (HSC)経由での配信のこれらの通常発達特性の活用破壊的または生後 HSC の移植に必要な免疫抑制をご利用いただけます。同様に、開発中に複数の臓器における前駆細胞のアクセシビリティ潜在的またはゲノム編集する遺伝子治療用ウイルスベクターの IUT 幹/前駆細胞の効率的ターゲティングできます。また、IUT を含む、通常の発達過程を研究するために使用できますが、免疫学的寛容の開発に限定されません。マウスのモデルは、可能性と前臨床試験の大規模な動物実験および最終的な臨床応用の前に IUT の限界を理解するための貴重なかつ手頃な手段を提供します。ここでは、静脈内投与と胎嚢内のルートをマウスの胎児で、IUT を実行するためのプロトコルについて述べる。このプロトコルは、必要な条件と造血幹細胞移植子宮内、寛容誘導、遺伝子治療への子宮内の背後にあるメカニズムを解明する正常に使用されています。

生存率と生着 IUHCT 実験の成功の重要な措置であります。帝王切開または後天的実験の特定のエンドポイントによって、IUHCT を受けた胎児出生前分析があります。平均では、静脈内注射後の生存率は 75-100% から及ぶ。胎嚢内注射後の生存率は、約 85-100% での静脈注射をより公正な傾向があります。
当研究室では、これらの技術の能力を達成するためにトレーニング プロセスは、約 8-12 ヶ月をかかります。再現性のある方法でこれらの注射を実行するために必要な技能の習得を評価するために研修生は胎児の生存とドナー生セル着、IUT、次短時間の点で監視されます。これは、次の品質管理実験により示しています。具体的には、1 × 107全骨髄細胞は C57BL/6TgN(act-EGFP) OsbY01 から分離されます (「B6 GFP」) マウスは前述5の説明し、妊娠 14 日 Balb/...

マウス モデルにおける注射の静脈内投与と胎嚢内のルートを通して子宮内移植 (IUT) を実行するためのプロトコルについて述べる。このプロトコルを使用するユニークな免疫トレラント胎児環境に細胞、ウイルスのベクトル、およびその他の物質を導入することができます。

In utero transplantation (IUT) is a unique and versatile mode of therapy that can be used to introduce stem cells, viral vectors, or any other substances ...

この方法は、発生学、遺伝子治療および幹細胞移植における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の利点は、それがマウスの胎児に異なる実験療法の効果の分析を可能にすることです.この手順を実証することは、医師ニコラス・アーンとバーバラ・クーンズ、私たちの研究室の医師と研究員になります。処置を開始する前に、手術針の先端に5〜10マイクロリットルの無菌PBSを入れ、2〜3回滴下して、可能な破片を取り除きます。次に、適切な実験量および濃度で目的の試薬を針に充填する。マイクロインジェクタのモードボタンを3回押して、射出キャリブレーション画面に進みます。射出時間を調整するために10または100ミリ秒の間隔を追加し、モードボタンをさらに2回押します。バランスボタンを押して、足のペダルを一度押します。その後、もう一度ペダルを押して、溶液の量が1プッシュごとに針から空にされているのかを評価します。マイクロインジェクタが適切な実験量に較正されたら、注射のために正しいレベルに針を充填する。すべての針が洗浄されたら、妊娠した2〜6ヶ月の雌マウスのつまみつまみへの応答の欠如を確認する。腹部を剃り、乳首を傷めないように気をつけて、動物をぴりかきの位置の加熱パッドに移します。動物の目に軟膏を塗布し、テープで加熱パッドに手足を固定します。そして、露出した皮膚を消毒する。次に、100マイクロリットルの0.25%ブピバカインなどの局所麻酔薬を皮下に注入する。次に、下側の境界が内膜に1センチメートル以下になるように1〜2センチの皮膚切開を行い、鼻隠しの正中線を特定し、周囲の上皮を傷めないように注意する。Adson鉗子を使用して、基礎となる臓器や胎児をつかまずに筋膜をつまみ、はさみで組織を開きます。腹腔内で安全に、皮膚切開の長さに筋切開を拡張し、綿先端アプリケーターを使用して腹部の上部に腸を移動させ、グラビッド子宮を露出させる。すべての胎児が数えられるように、右および左卵巣を慎重に識別する切開を通して子宮を抽出する。右の子宮だけが露出するように左の子宮を腹部に戻し、注射されていない胎児を暖かく保つ。そして、非支配的な手の親指と人差し指の間の最も外側の羊膜嚢を静かにつかむ。動物の上に解剖顕微鏡を配置し、必要に応じて胎児のより良い視覚化のために焦点と照明を調整します。静脈注射のために子宮を回転させてビテリンが無駄になるように、注射することは針先に平行である。そして、子宮壁を突き刺すために5度の角度で子宮の上に針を置きます。子宮壁と羊膜嚢の間の先端で、先端をビテリンの上に直接置き、ほぼ接線の角度で、ベベルが容器に進むまで無駄に針を滑空します。針が血管の後壁に浸透しないように角度が低いままにすることが不可欠です。針先で血液のスポットが観察されるとき、足のペダルを押して、対象物質の全容を血管に注入する。羊水注

intravenous-intra-amniotic-utero-transplantation-murine

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

E16ラット胚の子宮内での脳室内注入とエレクトロポレーションで

E15マウス胚の子宮内での脳室内注入とエレクトロポレーションで

マウスの子宮内生存の手術では...

超音波ガイド下のマウスの前脳へのマイクロインジェクション子宮内で E9.5で

のマウスモデル子宮内で移植

体性幹細胞の増殖を制御することは、彼らの研​​究と治療における使用を妨げる大きな要因となっている。ここでは、一時的にマウス脳で生成されたニューロンの数を増やすために使用することができます開発と成人期における神経幹細胞の膨張を制御するためのシステムを説明します。...

によって胚および成体神経幹細胞の拡大<em&gt;子宮内</em&gt;エレクトロポレーションまたはウイルス定位注射

子宮卵管胚移植は、子宮の転送を実行するときに発生する可能性があり、胚の流出を防止するためのバリアとして子宮卵接合を使用しています。精管切除雄は、胚移植のための偽妊娠レシピエントを得るために必要とされる。両方の技術が議論されている。...

マウスモデルにおける子宮卵管胚移植と精管切除

小児疾患の動物モデルは、早期発症と積極的な疾患の進行を体験することができます。臨床的に若いマウスモデルに関連する治療送達は技術的に困難であることができる。このプロトコルは、人生の最初の2日以内に出生後の新生児マウスのための非侵襲的静脈内注入法を説明しています。...

新生児マウスにおける静脈注射

生きた生物の合併症を伴わない胎児の母体炎症(FEMI)をシミュレートする絨毛膜炎のモデルを開発し、子孫の腸管の発達に及ぼすFEMIの影響を調べた。これは、絨毛膜炎後の腸の損傷の発症のための機械化原因の研究を可能にする。...

新生児腸管の発達に及ぼす急性絨毛膜炎の影響を研究する母体炎症への胎児暴露のマウスモデル

このプロトコルでは、E7.5のマウス羊膜腔にレンチウイルスを注入し、生存や胚発生への有害な影響を最小限に抑えながら、神経板全体の均一な形質導入をもたらす方法について説明します。...

胎内ナノ注射(NEPTUNE)によるマウス神経板ターゲティング(胎内7.5日目)

この研究では、ゼブラフィッシュの幼生に対してEvans Blue Dye(EBD)分析を行う簡単な方法について説明します。...

エバンスブルー色素でゼブラフィッシュ幼生骨格筋の整合性の分析

学ぶマウス胎内移植の静脈内および胎嚢内投与法。免疫寛容な胎児環境への細胞導入技術で、発生生物学と遺伝子治療の研究に応用できます。

マウスモデルにおける静脈内投与と胎嚢内子宮内移植

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マウス モデルにおける静脈内投与と胎嚢内子宮内移植

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