セノ治療薬同定のためのSA-β-ガラクトーシダーゼベーススクリーニングアッセイ

我々は、老化関連疾患において有益であることが示されたセノ治療薬化合物に対するハイスループット薬物スクリーニングを可能にする方法をここで初めて説明する。実際, この本質でテストされた薬でいくつかの臨床試験は現在進行中.この技術の主な利点は、セノリノティクスとセノモルフィクスの2種類のセノマテ治療薬を区別し、老化細胞におけるSA-β-ガラクトシダーゼの十分に確立された検出を使用することです。

この技術は、新しいセノ治療薬化合物の重要なスクリーニングツールである。実際には、この画面の助けを借りて識別されているいくつかの化合物は、様々な注目の出版物で紹介され、現在臨床試験中です。この手法は非常に汎用性が高く、複数のハイスループットスクリーンに適合する可能性があります。

実際には、多重スクリーン、およびいくつかの経路の1つの活性化または阻害を介して老化を抑制する化合物のスクリーンを可能にする。各胚を1ミリメートルにミンチし、数回上下にパイプします。次に、各胚の組織に10ミリリットルの成長培地を加える。

10センチメートルの培養皿に入れ、3%の酸素で摂氏37度、2〜3日間5%の二酸化炭素でインキュベートします。そして、各胚の残りの部分を0.25%トリプシンEDTA混合物で10分間インキュベートする。細胞をトリプシン化するには、まず、増殖培地を慎重に除去し、10ミリリットルの1X PBSで細胞を2回洗浄する。

その後、025トリプシンEDTA溶液を2ミリリットル加え、摂氏37度で2~3分間インキュベートします。次に、顕微鏡下で細胞を検査し、細胞が表面から切り離されていることを確認します。同じ量の増殖培地を加えてトリプシン消化を終了し、細胞を円錐管に移す。

その後、細胞をGの200倍で3分間遠心する。上清を捨て、新たな増殖培地を加え、細胞を再中断する。次に、セルを数え、予測されたセル密度で新しいプレートにシードします。

非老化サブ栽培の場合、まず、コンフルエント細胞を1対4の比率で分割する。その後、3%の酸素と5%の二酸化炭素で37°Cの細胞をインキュベートし、別の通路のために拡張します。次に、細胞老化を誘導するために、1〜4の割合で1〜4の割合で1つの通路からコンフルエント細胞を播種し、20%の酸素で摂氏37度、5%の二酸化炭素環境で3日間インキュベートする。

高度なコールターセルカウンターシステムで細胞の老化を監視するには、各トリプシン化工程中の細胞径と細胞体積の漸進的な増加を測定する。β-Galスクリーニングアッセイを開始するために、種子5,000老化細胞または3,000個の非老化細胞を96ウェルプレートで1ウェルあたり。その後、各ウェルに100マイクロリットルの成長培地を加え、摂氏37度で細胞をインキュベートし、20%の酸素と5%の二酸化炭素を6時間インキュベートします。

次に、MEF細胞に薬物希釈液を加え、20%の酸素で摂氏37度、24〜48時間の二酸化炭素を5%で培養します。インキュベーション後、薬物溶液を取り除き、100マイクロリットルの1X PBSで細胞を洗浄します。リソソームアルカリ化を誘導するために、90マイクロリットルのバフィロマイシンA1溶液を用いて細胞を前処理し、100ナノモルの最終濃度で新鮮な細胞培養培地に希釈した。

その後、20%の酸素と5%の二酸化炭素環境で37°Cの細胞を1時間インキュベートします。SA-β-Gal活性の蛍光分析のために、成長培地で希釈したC12FDGの新しい働き溶液を、100マイクロモルの最終濃度で作る。次に、10マイクロモルの最終濃度で培養液に10マイクロリットルの作業溶液を加え、20%酸素で37°C、2時間の二酸化炭素を5%で細胞をインキュベートする。

1X PBSの100マイクロリットルで細胞を洗浄します。次に、1ミリリットル当たり100マイクログラムのHoechst 33342染料の2マイクロリットルを、1ミリリットル当たり2マイクログラムの最終濃度で添加します。20分間、摂氏37度、酸素20%、炭酸ガス5%で細胞をインキュベートします。

インキュベーション後、培地を取り出し、100マイクロリットルの新鮮な成長培地を加え、イメージングに進む。本研究では、17-DMAGなどのセノリノクティック薬の同定を可能にした高含有蛍光画像取得および分析プラットフォームにより、老化細胞を含むマウス胚性線維芽細胞培養におけるSA-β-Galの全体的な活動を5回の経過で減少させた。老化細胞と非老化細胞の混合物のソフトウェア生成定量分析は、老化細胞特異的効果の明確なデモンストレーションを可能にし、バフィロマイシンA.A.A.陽性対照で処理されたすべての必要な細胞制御が含まれていることを確認してください。

このエッセイには、酸化ストレス下の原発細胞の操作が含まれており、監視する必要がある変動につながる可能性があります。この手順は、セノ治療薬の検出の第一歩です。スクリーニング結果を確認するために、追加の細胞生存率および細胞老化エッセイを行う必要があります。

このエッセイを使用していくつかの新しいセノリノリゼドラッグ薬が検出されました, 最初のセノリノリューコ薬の組み合わせダサチニブケルセチンを含みます, ヒートショックタンパク質 90阻害剤, Bcl-2ファミリー阻害剤, ポリフェノールフィセチン.