Name: 人間のサブタイプに固有の光の活動電位記録誘導多能性幹細胞由来の心室心筋細胞 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-27T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 59 s
Description: 学ぶ光学イメージング法により、iPS細胞由来心室心筋細胞の活動電位を高スループットで記録する手法。遺伝子組み込み型電圧センサーを用いて、心臓電生理学の研究に応用可能です。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

この作品は、ドイツ研究振興協会 (Si 1747/1-1)、他の Kröner フレゼニウス財団、ドイツ財団 für Herzforschung からの補助金によって支えられました。

1. iPSC 由来心筋細胞のイメージングのための準備
注: iPSC の文化および心臓の分化法12,13,14前に公開されている、ここで詳しく説明されません。使用する分化プロトコルによって手動レーザーマイクロダイ セクション、磁気細胞分離、または乳酸選択によって iPSC CMs の浄化をお勧めします。次のプロトコルの生成された領域を破ってから microdissected を外植体単分子膜分化プロトコル13を使用して心臓分化の 15 日に撮影された, 前述のフィブロネクチン コート プレート 30 日目まで培養前に10。
<ol><li>インキュベーター外培養皿の細胞を取るし、手動で 200 μ L ピペットを用いた遠心管に心臓植を収集します。沈降後、細胞培養上清を吸引し、ハンクと 2 x のバランスのとれた植は水洗いして塩ソリューション (HBSS)。</li>
	<li>コラゲナーゼ タイプ II を追加して iPSC CMs を切り離す (HBSS で 430 U/mL) と 37 ° C, 30 分でそれらを孵化させなさい。</li>
	<li>残りの大細胞の沈降の塊と解離単一の iPSC CMs を含む上清は収集高いウシ胎児血清 (FBS) 濃度 20 %fbs、2 mM (DMEM F12、新鮮な CM メンテナンス中にこれを追加L-glutamine、1: 100 の MEM 非本質的なアミノ酸、100 U/mL ペニシリン-ストレプトマイシン、0.1 mM β-メルカプトエタノール)。</li>
	<li>大細胞塊が残っている場合は、解離を繰り返します。収集遠心分離によって単一の iPSC CMs と CM 培低 FBS 濃度でそれらを再懸濁します (2 %fbs)。</li>
	<li>フィブロネクチン (2 μ g/cm2) でコーティングしており、3.5 cm ガラス下部セルの文化 microdish の単一セルの後続の画像を許可する密度の単一 iPSC CMs を再シードします。高スループット実験を行う前に播種密度を最適化します。通常、3.5 cm 皿あたり 5-10 心臓植、十分です。ただし、これは重く植サイズと純度に依存します。</li>
	<li>2% を含む CM メンテナンス中で解離後単一の iPSC CMs を文化、少なくとも 48 時間の十分な回復を確実に政府短期証券。 注: 次の手順で iPSC CMs は GEVI VSFP-CR MLC2vエンハンサー10の制御の下で心室固有 GEVI 式を達成するためにエンコード レンチ ウイルスを導入が。使用10または、レンチ ウイルス構造結節や心房と同様の細胞で特に GEVI を表現することができますまたは PGK の普遍的発現プロモーターをかくまっている不特定の構築などができます。レンチ ウイルスのプラスミドのリクエストも承ります。 注意: レンチ ウイルス粒子を操作するときは、作業環境が適切なバイオ セーフティ レベル、可能性のある感染性病原体を扱うための安全指示に従うし、必要な安全対策を講じることを確認します。</li>
	<li>レンチ ウイルス10を混合することによって感染メディアの準備-15CMs 用培地で前に説明したように HEK293 細胞で生産されている細胞培養上清を含む (手順 1.3 参照) 1:1 の比率で。</li>
	<li>8 μ g/mL の感染効率を高めるための最終的な集中に hexadimethrine ブロマイドを追加します。 注: 高い感染による遠心をレンチの iPSC CMs 前濃度の効率通常必要はありません。</li>
	<li>単一の iPSC CMs から CM 維持培地を吸引し、1.7 と 1.8 の手順で調製した感染培地にそれを置き換えます。37 ° C で 12 h の感染媒体に感染した単一 iPSC CMs の文化します。培地を吸引し、再び CM メンテナンス中に置き換えます。 注: GEVI から蛍光信号感染後 48 時間が表示されます。膜の潜在的な録音のイメージング、勧め、早ければ感染後 72 時間適切な信号強度を確保します。単一感染 iPSC CMs は、少なくとも 3 週間培養し、順番にイメージを作成できます。広範な退色がイメージング セッション中に発生した場合蛍光信号を時間の経過とともに回復します。</li>
	<li>画像、前に Ca2 +を添加したタイロード液で細胞培養液を交換 (135 mM NaCl、5.4 mM KCl、1 mM MgCl2、10 mM グルコース、1.8 mM CaCl2、および 10 mM HEPES; pH 7.35)。</li>
</ol>2. 光学的膜電位記録
<ol><li>画像分割、適切なフィルター セット、および可能高高速撮像カメラ (例えば、sCMOS カメラ) を搭載した倒立落射蛍光顕微鏡のステージ上 iPSC CMs を含むイメージング室の場所感度。 メモ: たとえば、480/40 nm バンドパス励起フィルターの使用は、顕微鏡で 500 nm ロングパス ・ ダイクロイック ミラーと組み合わせて、568 nm ロングパス ・ ダイクロイック ミラーを併用 520/28 nm と 630/75 nm バンドパス排出フィルター イメージ分割。単一細胞のイメージング、高倍率、高開口油浸対物レンズは、最高の信号対雑音比を提供しています。</li>
	<li>電気的ペーシングが必要な場合、イメージングの商工会議所でペーシング電極をインストールし、刺激発生器に接続します。 注意: 3.5 cm ガラス底細胞培養皿にペーシング挿入 2 つの白金電極を含まれている、装備を使用しています。電極の間にある細胞をイメージしました。典型的なペーシング パラメーターは、10 V/cm の電極距離の振幅と時間 5 ms の矩形波です。</li>
	<li>必要に応じて、長期的な画像である場合、イメージング、または顕微鏡インキュベーション室セットアップも中に iPSC CMs の安定した温度を確保するため加熱顕微鏡ステージを使用します。</li>
	<li>フォーカスをセルをもたらすし、視野の中心に GEVI を表現するセルを配置します。 注: 緑色蛍光タンパク質 (GFP) または赤の蛍光タンパク質 (RFP) フィルター セット GEVI を発現する細胞を識別するために、顕微鏡の接眼レンズを使用して、これは最も便利な場所です。</li>
	<li>放出される光が画像スプリッターを経由するように光パスを設定します。フィルター キューブを顕微鏡で画像スプリッターのフィルターと組み合わせることの 1 つに切り替える (テーブルの材料を参照してください)。</li>
	<li>カメラを制御するソフトウェア、(例えば、100 フレーム/秒、1 フレームあたり 10 ms の露光時間で) 高速撮像が可能取得設定を設定します。 注: 通常、これはカメラのピクセルのビニング含まれます (例えば8 × 8 ピクセル カメラ チップのコマ撮りムービーで 1 ピクセルを生成するビニング、)。</li>
	<li>製造元の指示に従ってイメージの分割を設定します。それぞれ 1 つを占めて、2 つの異なる発光波長バンドを表す 2 つの画像は、互いに隣接するべき画像の半分。 注: するこの手順は、各撮像セッションの初めにだけ 1 つの x を実行します。</li>
	<li>確認し、必要に応じて、カメラによって生成されたイメージのフォーカスを調整します。</li>
	<li>照明光の明るさを調整、ピクセルの任意の飽和状態を避けなさい。これは、飽和のピクセルは独特の色で表されるカラー パレットを使用して、最も簡単に実行できます。 注: これらイメージ作成前準備時に必要な量 (すなわち、長時間の点灯にしないで) を光励起するサンプルの露出を制限 GEVI の変質を避けるために。</li>
	<li>タイム シリーズのデータ集録設定 (例えば、100 フレーム/秒 50 のシリーズの持続期間のために 5,000 枚 s)。測定に影響を及ぼす迷光を避けるために (コンピューターのモニターを含む) 部屋の明かりを暗きます。励起光シャッターがイメージング ソフトウェアによって制御されていない場合は、データ収集の開始の直前に開きます。</li>
	<li>一連のイメージの取り込みを開始します。電気的ペーシングが必要な場合は、イメージング ソフトウェアによって自動的に開始しない限り、適切な時点でペーシングのシーケンスを開始します。薬理学的エージェントのアプリケーションが場合は、このいずれかを手動で行う (例えばバッファーの 900 μ L を含むと優しく混ぜるピペット記録室に 10 倍終わり濃度エージェントの 100 μ L 分注によって) またはを使用して、定流量灌流システム。</li>
	<li>買収が完了したら、必要に応じて、励起光シャッターを閉じます。記録をハード ディスク ドライブに保存します。</li>
	<li>そのまま録画の設定 (すなわち、露出時間、フレーム レート、および光強度) を残して、実行 (ステップ 2.11) と同様に背景の蛍光性の記録を別の coverslip 以上セルを含まない coverslip の領域にないです。セルがシードされています。 注: 取得の設定を変更することがなく連続測定を実行すると、1 つだけのバック グラウンド蛍光記録すべてのこれらの測定のため必要です。</li>
	<li>必要な場合、同じ上にある別の iPSC CMs に追加実験 (ステップ 2.4-2.13) を実行します。薬を適用した場合に、上のすべての CMs を受けることを注意してください。</li>
</ol>3. 分析
> 注: イメージング ソフトウェアに応じて使用されます (これは通常カメラまたは蛍光イメージング システムの全体の製造元によって提供される独自のソフトウェア パッケージ)、あるいは部分的に取得した画像の分析を実行することがあります完全にこのソフトウェア パッケージです。ただし、ここで実行できる画像解析のワークフロー オープン ソース ソフトウェア (すなわち、イメージ解析プラットフォーム ImageJ)16、フィジー17などのための R パッケージの配布を使用して便利なインストールが可能な統計計算18のとおりです。簡単に、セルや背景を表す (ROIs) の関心の領域、ImageJ で描画され、時間をかけてこれらの Roi の平均蛍光はさらに R または、代わりに、表計算ソフトで分析される、その後、ファイルにエクスポートします。
<ol><li>イメージング ソフトウェアの保存または取得した画像時系列 (セルを含む記録と対応するバック グラウンド録画の両方) を (例えばTIF) ImageJ で読み取ることができる形式にエクスポートします。また、イメージング システム メーカーのさまざまなブランドから独自のファイル形式を読む、ImageJ を有効にするルーチンを提供します BioFormats プラグイン (https://imagej.net/Bio-Formats) を使用します。 注: 次の手順は、イメージングの間隔が記録全体で同じであると仮定します。そうでない場合は、イメージング ソフトウェアのタイミング情報をエクスポートしてさらに分析に含める必要があります。</li>
	<li>ImageJ のセルを含む TIF スタックを開きます。</li>
	<li>フリーハンド選択ツールを使用して、赤のチャンネルに蛍光心筋細胞上の投資収益率を描きます。投資収益率が十分な大きさになるため、セルが契約中の投資収益率を移動しませんを確認します。</li>
	<li>ROI マネージャーのプラグインを開く ('分析 |ツール |ROI マネージャー ') ROI1 としてこの ROI を追加する追加] [t]ボタンを押します。</li>
	<li>緑のチャンネルで同じセルに ROI をドラッグし、ROI2 としてこの ROI を追加します。</li>
	<li>の ' 分析 |測定の設定メニュー、 '平均グレー値'を除くすべてのオプションの選択を解除します。 注: これは、ImageJ セッションでのみ 1 x を行う必要があります。</li>
	<li>ROI マネージャーで、を押して ' より |マルチ メジャー 'ボタン。'すべてのスライスを測定'と'スライスごとに 1 行'オプションを選択し、 「OK」を押します。3 つの行 (スライス数とそれぞれ赤と緑のチャネルでは、セルを表す 2 つの Roi の平均蛍光) とスプレッドシートを含むウィンドウが開きます。</li>
	<li>使用' ファイル |名前を付けて保存 'コンマ区切り値 (CSV) ファイルにスプレッドシートを保存します。</li>
	<li>ROI マネージャー ウィンドウを閉じずに、画像のスタックとウィンドウやスプレッドシート ウィンドウを閉じます。バック グラウンド測定を含む TIF スタックを開きます。</li>
	<li>ROI マネージャーで、を押して ' より |マルチ メジャー'ボタン。'すべてのスライスを測定'と'スライスごとに 1 行'オプションを選択し、 「OK」を押します。</li>
	<li>使用' ファイル |保存としての別の CSV ファイルに背景データとスプレッドシートを保存します。 注: 次の計算は表計算ソフトで行うことができます。R ソフトウェア18を使いました。ファイル"cell.csv"から"background.csv"のセルと背景データ、計算を実行して膜の潜在的な信号の時間的経過をプロットを読む簡単な例スクリプトは、補足コード ファイル 1として提供されます。</li>
	<li>背景の記録から、赤と緑のチャネルの平均強度を計算します。この RFP のバック グラウンド補正を計算するために赤と緑のチャネル内のセルを表す信号からバック グラウンド信号と GFP の信号をそれぞれ引きます。</li>
	<li>膜電位の代理として RFP/GFP の比率を計算します。 注: この比は無次元です。また、初期値 (すなわちΔR/R0) に正規化することができます。重要なは、この比率の絶対値ではなく変化で、有用な情報が含まれています。GFP と RFP の不均一な退色のため、この比率のベースラインのドリフトが発生します。必要に応じて、基準曲線を構成する RFP/GFP 比10からそれを減算することによってそのようなベースラインのドリフトを修正する可能性があります。</li>
</ol>

<ol><li>Sinnecker, D., Laugwitz, K. L., Moretti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+for+drug+development+and+toxicity+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacology+%26+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for drug development and toxicity testing.</a> Pharmacology & Therapeutics. 143 (2), 246-252 (2014).</li>
<li>Goedel, A., My, I., Sinnecker, D., Moretti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perspectives+and+Challenges+of+Pluripotent+Stem+Cells+in+Cardiac+Arrhythmia+Research%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Cardiology+Reports%22%5BJournal%5D)">Perspectives and Challenges of Pluripotent Stem Cells in Cardiac Arrhythmia Research.</a> Current Cardiology Reports. 19 (3), 23(2017).</li>
<li>Rocchetti, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elucidating+arrhythmogenic+mechanisms+of+long-QT+syndrome+CALM1-F142L+mutation+in+patient-specific+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Elucidating arrhythmogenic mechanisms of long-QT syndrome CALM1-F142L mutation in patient-specific induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Cardiovascular Research. 113 (5), 531-541 (2017).</li>
<li>Sinnecker, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+long-QT+syndromes+with+iPS+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cardiovascular+Translational+Research%22%5BJournal%5D)">Modeling long-QT syndromes with iPS cells.</a> Journal of Cardiovascular Translational Research. 6 (1), 31-36 (2013).</li>
<li>Talkhabi, M., Aghdami, N., Baharvand, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+cardiomyocyte+generation+from+pluripotent+stem+cells%3A+A+state-of-art%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Human cardiomyocyte generation from pluripotent stem cells: A state-of-art.</a> Life Sciences. , 98-113 (2016).</li>
<li>Ben-Ari, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+changes+in+electrophysiological+characteristics+of+human-induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Heart+Rhythm%22%5BJournal%5D)">Developmental changes in electrophysiological characteristics of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Heart Rhythm. 13 (12), 2379-2387 (2016).</li>
<li>Den Hartogh, S. C., Passier, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concise+Review%3A+Fluorescent+Reporters+in+Human+Pluripotent+Stem+Cells%3A+Contributions+to+Cardiac+Differentiation+and+Their+Applications+in+Cardiac+Disease+and+Toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Concise Review: Fluorescent Reporters in Human Pluripotent Stem Cells: Contributions to Cardiac Differentiation and Their Applications in Cardiac Disease and Toxicity.</a> Stem Cells. 34 (1), 13-26 (2016).</li>
<li>Schweizer, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subtype-specific+differentiation+of+cardiac+pacemaker+cell+clusters+from+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Subtype-specific differentiation of cardiac pacemaker cell clusters from human induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 229(2017).</li>
<li>Moretti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-specific+induced+pluripotent+stem-cell+models+for+long-QT+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Patient-specific induced pluripotent stem-cell models for long-QT syndrome.</a> The New England Journal of Medicine. 363 (15), 1397-1409 (2010).</li>
<li>Chen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subtype-specific+promoter-driven+action+potential+imaging+for+precise+disease+modelling+and+drug+testing+in+hiPSC-derived+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22European+Heart+Journal%22%5BJournal%5D)">Subtype-specific promoter-driven action potential imaging for precise disease modelling and drug testing in hiPSC-derived cardiomyocytes.</a> European Heart Journal. 38 (4), 292-301 (2017).</li>
<li>Lam, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+FRET+dynamic+range+with+bright+green+and+red+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Improving FRET dynamic range with bright green and red fluorescent proteins.</a> Nature Methods. 9 (10), 1005-1012 (2012).</li>
<li>Chen, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemically+defined+conditions+for+human+iPSC+derivation+and+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture.</a> Nature Methods. 8 (5), 424-429 (2011).</li>
<li>Burridge, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemically+defined+generation+of+human+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Chemically defined generation of human cardiomyocytes.</a> Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).</li>
<li>Bhattacharya, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+efficiency+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+cardiomyocytes+and+characterization+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">High efficiency differentiation of human pluripotent stem cells to cardiomyocytes and characterization by flow cytometry.</a> Journal of Visualized Experiments. (91), e52010(2014).</li>
<li>Wang, X., McManus, M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2865973/">Lentivirus production.</a> Journal of Visualized Experiments. (32), e1499(2009).</li>
<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>R Development Core Team. R: A language and environment for statistical computing. , R Foundation for Statistical Computing. Vienna, Austria. Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.R-project.org">http://www.R-project.org</a> (2008).</li>
<li>Jung, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dantrolene+rescues+arrhythmogenic+RYR2+defect+in+a+patient-specific+stem+cell+model+of+catecholaminergic+polymorphic+ventricular+tachycardia%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Dantrolene rescues arrhythmogenic RYR2 defect in a patient-specific stem cell model of catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia.</a> EMBO Molecular Medicine. 4 (3), 180-191 (2012).</li>
<li>Lemoine, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+iPSC-derived+cardiomyocytes+cultured+in+3D+engineered+heart+tissue+show+physiological+upstroke+velocity+and+sodium+current+density%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Human iPSC-derived cardiomyocytes cultured in 3D engineered heart tissue show physiological upstroke velocity and sodium current density.</a> Scientific Reports. 7, 5464(2017).</li>
<li>Dorn, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+nkx2-5+transcriptional+repression+of+isl1+controls+cardiomyocyte+subtype+identity%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Direct nkx2-5 transcriptional repression of isl1 controls cardiomyocyte subtype identity.</a> Stem Cells. 33 (4), 1113-1129 (2015).</li>
<li>Kaestner, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+Encoded+Voltage+Indicators+in+Circulation+Research%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Genetically Encoded Voltage Indicators in Circulation Research.</a> International Journal of Molecular Sciences. 16 (9), 21626-21642 (2015).</li>
</ol>

著者が明らかに何もありません。

ここで説明したメソッドは、ヒトの Ips から生成された CMs の特定のサブタイプ (すなわちのような心室細胞) から APs の光学的記録をできます。人間 iPSC CMs は、巨大な様々 な生物や医療の問題に対処するための新たなツールと CM サブタイプごとに分化実験的変動の重要な源であります。特異的プロモーターの要素を使用して、GEVI の式は特に光学的イメージがその後の関心のサブタイプを表す CMs で行われます。
単一の iPSC CMs から APs の買収に成功、解離後 reseeding の密度に依存します。セルは余りに密で再シードされ、隔離された単一 iPSC-CMs は電気シンシチウムの一部ではないを見つけるに時間がかかるです。しかし、あまりにも低播種密度、細胞の生存に悪影響します。したがって、特に高速イメージングに依存する実験を行う前に、異なる播種密度の体系的なテストすることをお勧めします。
画像集録中に、VSFP は退色は、信号対雑音比の長い実験中に特に悪影響を受けます。急速な退色が...

心筋 (CMs) 由来の誘導多能性幹細胞 (Ips) が解剖心臓副作用効果1,2 の分子機構新規治療法を調査するため、心臓病や画面にする新たなツール、3。スタートから右 channelopathies などの不整脈疾患はこの研究領域4の重要な焦点をされています。その結果、不整脈や活動電位 (AP) 形態の変化など、CMs の電気の表現型を調べる方法は、この技術の中心。
IPSC CMs のアプリケーションの重要な考察は現在心筋分化誘導方法が同種の細胞の人口で起因しません。洞結節、心房に似た細胞と成熟5,6,7,8のさまざまなレベルでの心室の CMs の混合物ではなくされます。この不均一性は、関連するソースをすることができます実験的変動の AP 持続時間 (APD) などのパラメーターを検討した場合に特に本質的に異なる CM サブタイプ間 (例えばAPD は短いよりも心室の CMs で心房)。この問題に対処するための従来のアプローチはパッチ クランプ法を用いた単一 iPSC CMs を調査し、節として各セルを分類する-心房、-、または心室のように、その AP 形態9に基づいて。任意の後続の分析は興味の CM のサブタイプを表すセルにし、制限できます。この方法の主な欠点は、その限られたスループットとスケーラビリティの欠如です。また、パッチ クランプ電気生理学の侵襲的な性質は、長期にわたる連続同じ細胞のイメージングを許可しません。
ここでは、光学的 iPSC CMs の特定のサブタイプの APs をイメージする開発方法10実験の詳細を提供します。これはサブタイプの不均一性の問題を克服し、iPSC CMs の遺伝的変異を運ぶまたは薬理学的にさらされるエージェントの急速な表現をできるように、従来の方法と比較してスループットが大幅に増加します。
サブタイプに固有の光イメージング手法の概要
その蛍光特性を脱分極および細胞膜の再分極時に変更、遺伝子にコードされた電圧インジケーター (GEVI) を使用して、CMs の膜電位の変化を光学的にイメージします。ここに適用 GEVI は電圧検出蛍光タンパク質 VSFP CR11緑 (クローバー) と赤 (mRuby2) 蛍光タンパク質 (図 1 a) のペアに融合した電圧感知の膜貫通ドメインから成っています。2 つの同時の近くのため緑色蛍光タンパクの励起は、赤の蛍光タンパク質を介して蛍光共鳴エネルギー移動 (FRET) に転送されている励起エネルギーの一部の結果します。したがって、緑色蛍光タンパクの励起は、緑、赤の蛍光タンパク質 (図 1 a、上部のパネル) からの排出量の結果します。細胞は脱分極、FRET 効率を高める 2 つの蛍光タンパク質の向きかえに変換する電圧センサーの構造転位が発生します。したがって、励起エネルギーのさらに転送されます、緑から赤色けい光たんぱく質 (図 1 a、下部のパネル)。その結果、脱分極のセルに緑の蛍光性の放出は、調光器と赤い蛍光性の放出は、安静時の膜電位 (図 1 b) セルよりも明るい。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58134/58134fig1.jpg"> 図 1: 膜電位 VSFP 単位での光イメージング(A) A の回路図 VSFP CR を示す電位感受性蛍光タンパク質のアクションを描いたします。細胞膜の脱分極時に電圧センサーの膜貫通ドメインの構造転位変換緑 (GFP) と赤 (RFP) 蛍光蛋白質、分子の蛍光を効率の向きかえ共鳴エネルギー移動 (FRET)。(B) 排出量の静止膜電位 (上部パネル) 細胞および脱分極細胞 (下段) GFP 励起による VSFP のスペクトルが描かれています。脱分極時にスペクトルの変化がわかりやすくするために誇張されています。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58134/58134fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
膜電位の変動をミラーリング FRET 効率の変化、赤と緑の蛍光放出を分離し、2 つの隣接する領域に投影する画像分割を搭載した蛍光顕微鏡を使ってイメージ化します。sCMOS カメラ (図 2) のチップ。このセットアップで、2 つの異なる波長の蛍光性の放出を記録できます同時に、膜電位コマ撮りシリーズのすべてのイメージを反映するように赤と緑の蛍光性の比率の計算が可能します。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58134/58134fig2.jpg"> 図 2: イメージング システムの構成します。イメージング システムの主要なコンポーネントは、高時間分解能で膜電位変化をミラーリング電位感受性蛍光タンパク質のスペクトルの変化が描かれている画像に使用されます。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58134/58134fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
CMs の VSFP CR の式は、レンチ ウイルス伝達によって実現されます。CM のサブタイプに興味の表現を直接に、レンチ ウイルスには特に心室のような iPSC CMs10で転写をドライブ プロモーター要素 ( MLC2vエンハンサー) が含まれています。心房のような節のようなおよび心室のような細胞の混合物を表す iPSC CMs はこのレンチ ウイルスで導入した、VSFP CR が心室のような細胞のみで表現されます。この蛍光センサーに依存する光の活動電位イメージング、記録された活動電位は排他的関心 (図 3) の CM のサブタイプを表します。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58134/58134fig3.jpg"> 図 3: サブタイプに固有の膜電位イメージングのための VSFP のプロモーターに駆動される式。(、) この回路図は、心筋細胞サブタイプに固有の光の活動電位記録を実現する方法を示しています。(b) iPSC-CMs 心室固有 MLC2v エンハンサーの制御の下で VSFP に感染しているが表示されます。電圧センサーの表現は、GFP チャネル (左側のパネル) の心室のような CMs でだけ観察されます。位相コントラスト (中央のパネル) とオーバーレイ イメージ (右側のパネル) が備わっています。白の点線は、セルの境界をマークします。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58134/58134fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

<table><tbody><tr><td>&szlig;-メルカプトエタノール</td><td>Invitrogen</td><td>21985023</td><td></td></tr><tr><td>DMEM-F12 Medium</td><td>Invitrogen</td><td>21331046</td><td></td></tr><tr><td>FBS(ウシ胎児血清)</td><td>Invitrogen</td><td>16141079</td><td></td></tr><tr><td>MEM 非必須アミノ酸</td><td>Invitrogen</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMax-I Supplement</td><td>Invitrogen</td><td>35050061</td><td>alternative L-Glutamine</td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン</td><td>Invitrogen</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>フィブロネクチンウシ血漿</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1141&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>コラゲナーゼII型</td><td>Worthington Biochem</td><td>LS004174</td><td></td></tr><tr><td>Hexadimethrine Bromide (Polybrene)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9268</td><td>Enhancing lentiviral infection</td></tr><tr><td>3.5 cm glass-bottom microdishes</td><td>MatTek corporation, Ashland, MA, USA</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Microscope stand</td><td>Leica Microsystems, Wetzlar, Germany</td><td>DMI6000B</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡対物レンズ</td><td>Leica Microsystems, Wetzlar, Germany</td><td>HCX PL APO 63X/1.4-0.6 Oil</td><td></td></tr><tr><td>sCMOS camera</td><td>Andor Technology, Belfast, UK</td><td>Zyla V</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡フィルターキューブ: 励起フィルター</td><td>Chroma Technology Corp, Bellows Falls, VT, USA</td><td>ET480/40X</td><td>bandpass 480/40</td></tr><tr><td>顕微鏡フィルターキューブ: ダイクロイックミラー</td><td>Chroma Technology Corp, Bellows Falls, VT, USA</td><td>T505lpxr</td><td>ロングパス 505 nm</td></tr><tr><td>イメージスプリッター</td><td>&nbsp;Cairn Research, Faversham, UK</td><td>OptoSplit II</td><td></td></tr><tr><td>イメージスプリッターフィルターキューブ: ダイクロイックミラー</td><td>AHF Analysentechnik GmbH, T&uuml;bigen, Germany</td><td>568LPXR</td><td>longpass 568 nm</td></tr><tr><td>Image splitter filter cube: emission filter 1 (GFP emission)</td><td>AHF Analysentechnik GmbH, T&uuml;bigen, Germany</td><td>520/28 BrightLine HC</td><td>bandpass 520/28 nm</td></tr><tr><td>Image splitter filter cube: emission filter 2 (RFP emission)</td><td>AHF Analysentechnik GmbH, T&uuml;ビゲン、ドイツ</td><td>630/75 ET バンドパス</td><td>バンドパス 630/75 nm</td></tr><tr><td>ペーシング インセット</td><td>ワーナー インセット ワーナー インスツルメンツ、ハムデン、コネチカット</td>州、米国 <td>RC-37FS</td><td></td></tr></tbody></table>

人間のサブタイプに固有の光の活動電位記録誘導多能性幹細胞由来の心室心筋細胞

Subtype-specific Optical Action Potential Recordings in Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Ventricular Cardiomyocytes

ひと誘導多能性幹細胞 (iPSC CMs) から生成された心筋細胞、循環器病研究に新たなツールです。均一な細胞集団ではなく、現在の差別化プロトコルによって生成された iPSC CMs 心室細胞の混合物を表す-心房、-、およびリンパ節のような表現型表現型解析を複雑にします。ここでは、心室のような iPSC CMs から具体的に活動電位の光学的記録の方法が表示されます。これは、遺伝子にコードされた電圧インジケーターが心室固有プロモーター要素の制御の下で、構成要素にレンチ ウイルス伝達によって達成されます。IPSC CMs は、この構造体の導入は、電圧センサー、心室のような細胞でのみ表されます、タイムラプス蛍光顕微鏡を用いたサブタイプ特異光学膜潜在的な録音を有効にします。

図 4 a、代表的な単一 iPSC CM は RFP (左側) と GFP (右側) チャネルのイメージング分析中に描かれた ROI をマーキング白点線で描かれています。RFP チャネルからの信号は、それぞれの活動電位 (図 4 b、上部のパネル) の中に蛍光強度の周期的な増加を示しています。前述の導入で、これは膜電位 (図 1) の変化による増加フレット原因です。的外れ、gfp 蛍光強度 (図 4 b、中央のパネル) の定期的な減少を示しています。RFP/GFP 比 (図 4 b、下のパネル) は、APD50や90の APD 測定などの下流解析で使用される生物学的信号です。このメソッドは、30 日齢のような心室 iPSC CMs 4...

ここで具体的には心室のような誘導多能性幹細胞由来心筋細胞イメージ活動電位光学的方法を提案する.メソッドは、電位感受性蛍光タンパク質のプロモーターに駆動される式に基づいています。

Cardiomyocytes generated from human induced pluripotent stem cells (iPSC-CMs) are an emerging tool in cardiovascular research. Rather than being a ...

人工多能性幹細胞またはIPS細胞から生成された心筋細胞は、心臓電気生理学の分野における様々な生物学的問題に答えるためにますます使用されています。この技術の主な利点は、心室特異的プロモーター要素を使用して、筋細胞のような心室におけるスループットの劇的な増加とサブタイプ特異的なアクションポテンシャル記録を可能にすることです。レンチウイルス伝達を通じて遺伝的にコード化された電圧センサーの導入により、ヒト由来の多能性幹細胞由来心筋細胞の作用電位の光学イメージングが可能になる。レンチウイルス含有細胞培養上清と心筋細胞維持培地を1対1の割合で混合することから始める。ヘキサジメテリン臭化物を1ミリリットル当たり8マイクログラムの最終濃度で添加し、感染効率を高める。IPS細胞由来心筋細胞培養皿中の心筋細胞維持培地を、感染培地と交換する。感染した心筋細胞を摂氏37度で12時間培養し、感染培地を新鮮な心筋細胞維持培地に置き換える。イメージングの前に、細胞培養培地をチローデの溶液と交換し、カルシウムを補う。次に、画像スプリッターを搭載した反転性蛍光顕微鏡のステージ上の画像チャンバーに心筋細胞を配置します。電気ペーシングが必要な場合は、撮像チャンバーにペーシング電極を取り付け、電極を刺激発電機に接続します。細胞に焦点を合わせ、視野の中央に遺伝的にコードされた電圧インジケータを表すセルを見つけます。光が放射された光がイメージスプリッターにルーティングされるように光路を設定し、顕微鏡内のフィルターキューブを画像スプリッタ内のフィルターと組み合わせるものに切り替えます。カメラを制御するソフトウェアでは、高速イメージングが可能になるように取得設定を行い、メーカーの指示に従って画像スプリッタを設定します。2 つの異なる発光波長バンドを表す 2 つの画像は、それぞれ画像の半分を占める互いに隣接している必要があります。カメラで生成された画像の焦点を確認し、必要に応じて調整します。また、ピクセルの彩度が避けないように、照明ライトの明るさを調整します。時系列の取得を設定し、測定に影響を与える迷い光を避けるために室内の光を暗くします。次に励起光シャッターを開き、画像シリーズの取得を開始し、適当な時点で電気ペーシングを開始し、実験的に適宜行う。取得が終了したら、必要に応じて励起ライトシャッターを閉じ、記録をハードドライブに保存します。次に、記録設定を変更せずに、セルを含まないカバースリップの領域の背景を記録します。光学膜電位記録の解析のために、ImageJ内の細胞を含むティフスタックを開き、自由手選択ツールを使用して蛍光心筋細胞の上に関心領域を描き、赤色チャネルで、収縮中に細胞が領域外に移動しないように領域が十分に大きいことに注意する。次に、[分析]、[ツール]、[関心のある地域マネージャー] を選択し、[T の追加] を選択して、リージョンを [対象地域 1] として追加します。緑色のチャネル内の同じセル上に対象領域をドラッグし、この領域を [対象地域 2] として追加します。[分析]メニューと[計測値を設定]メニューで、[平均]グレーの値を除くすべてのオプションの選択を解除します。[対象のリージョン マネージャー] で、[その他のメジャーとマルチ メジャー] をクリックして[すべてのスライスを測定] オプションと [スライスごとに 1 行] オプションを選択し、[OK] をクリックします。3 行のスプレッドシートを含むウィンドウが開きます。[ファイル] と [名前を付けて保存] を使用して、スプレッドシートをカンマ区切り値ファイルに保存します。[対象の領域] マネージャ ウィンドウを閉じずに、イメージ スタックとスプレッドシート ウィンドウのあるウィンドウを閉じ、背景の計測値を含む tiff スタックを開きます。[対象のリージョン マネージャー] で、[その他のメジャーとマルチ メジャー] をクリックして[すべてのスライスを測定] オプションと [スライスごとに 1 行] オプションを選択し、[OK] をクリックします。次に、バックグラウンド データを別の csv ファイルに保存します。ここで、代表的な単一IPS細胞由来心筋細胞細胞は、対象領域を示す白い点線で描かれ、RFPおよびGFPチャネルにおける画像解析中に描かれた図が示されている。RFPチャネルからの信号は、膜電位の変化によって生じる強制または共鳴エネルギー伝達の増加による各作用電位の間の蛍光強度の周期的増加を示す。一致して、GFPシグナルは、蛍光強度の周期的な減少を示す。RFP/GFP比は、アクション電位期間50、90測定など、下流解析で使用される生物学的信号です。例えば、この方法を用いて、0.5ヘルツに配置されたIPS細胞由来心筋細胞のような30日齢の心室は、平均作用電位持続時間50の439ミリ秒、および平均作用電位持続時間520ミリ秒の平均作用電位持続時間90を示した。IPS細胞由来心筋細胞の電気刺激は、5拍ごとに刺激速度を増加させると、拍動速度が増加するにつれて作用電位の進行的な短縮を示した。さらに、イソプロテルノールを用いた自発的に打ち負かすIPS細胞由来心筋細胞の治療は、非選択的βアドレナリン受容体アゴニストであり、鼓動速度の迅速な増加につながり、アゴニストの用量の増加に伴ってさらに増加することができる。この方法は、古典的な電気生理学的測定と比較して優れたスループットを提供するが、蛍光電圧センサの固有の運動特性によって制限される時間分解能を含む、その限界を認識する必要があります。

subtype-specific-optical-action-potential-recordings-human-induced

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

心疾患の細胞に基づく現在の知識は、ほとんどの動物モデルの研究に依存しています。ここでは、説明し、人間の心室心筋の小さな外科的サンプルから単実行可能な心筋細胞を得るための新しい方法を検証する。ヒト心室筋細胞は、電気生理学的研究および薬物試験のために使用することができる。...

離と新鮮な外科的試料からのヒト心室の心筋細胞の機能解析

ヒト多能性幹細胞（hPSC-CM）に由来する心筋細胞の電気生理学的特徴付けは、心臓疾患のモデル化および薬物応答の決定に重要である。このプロトコールは、多電極アレイ上のhPSC-CMを分離してプレートし、それらの電場電位を測定し、QTおよびRR間隔を分析するための方法を提供するのに必要な情報を提供する。...

多電極アレイ（MEA）を用いたヒト多能性幹細胞由来心筋細胞（hPSC-CM）の電気生理学的解析

ここでは、成体マウスからの生存心室スライスの調製および鋭い電極活動電位記録のためのそれらの使用を記載する。これらの多細胞調製物は、 インビボでの電気生理学的および薬理学的研究のための貴重なモデルとなる組織構造のような保存されたインビボを提供する。...

電気生理学的研究のためのマウス短軸心室スライス

本稿では、マルチウェルMEAプレート上で培養されたヒト誘導多能性幹細胞由来心筋細胞(hiPSC-CM)ネットワークの開発のためのプロトコルのセットを含み、作用電位測定のために細胞膜を可逆的に電気ポレートする。ハイスループットの記録は、同じセルサイトから何日も繰り返し取得されます。...

再発作用ポテンシャル記録のためのマルチウェルマイクロ電極アレイ上のヒトiPSC由来心筋細胞ネットワーク

マウス筋細胞の単離の方法論と、同時デジタル細胞幾何学的測定と蛍光光光測定を用いたサルコメア短縮トレースと同時に電圧またはカルシウムの痕跡を得る方法を提示する。...

単離マウス心室筋細胞の光学イメージング

ここでは、高速モジュラーフォトメトリーシステムを用いた誘導多能性幹細胞由来心筋細胞からの作用電位の光学的獲得および特性評価について述べている。...

ヒト人工多能性幹細胞由来心筋細胞における単細胞光学作用電位測定

ヒト人工多能性幹細胞由来心筋細胞(hiPSC-CM)は、薬物誘発性心毒性スクリーニングおよび疾患モデリングのための有望な in vitro...

ヒト人工多能性幹細胞由来心筋細胞における微小電極アレイおよびパッチクランプ記録の技術的応用

レーザーポレーションと微小電極アレイ(MEA)の組み合わせにより、培養された初代および幹細胞由来の心筋細胞の活動電位のような記録が可能になります。波形形状は、標準的な記録よりもテスト化合物の作用モードに関する優れた洞察を提供します。パッチクランプとMEA読み出しをリンクして、将来の心臓安全性研究をさらに最適化します。...

安全性薬理学の予測性を高めるための微小電極アレイ上の心筋細胞のレーザー誘起活動電位様測定

ヒト人工多能性幹細胞由来心筋細胞(hiPSC-CM)は、前臨床心毒性スクリーニングに動物を使用する代替手段を提供します。前臨床毒性スクリーニングにおけるhiPSC-CMの広範な採用に対する制限は、細胞の未熟な胎児様表現型です。ここでは、hiPSC-CMを堅牢かつ迅速に成熟させるためのプロトコルを紹介します。...

成熟ヒト人工多能性幹細胞由来心筋細胞単分子膜を用いたハイスループット心毒性スクリーニング

ここでは、光学系プラットフォームを用いてヒト人工多能性幹細胞由来心筋細胞において収縮性およびカルシウム測定を行う確立された方法について説明する。このプラットフォームにより、研究者は突然変異の影響とさまざまな刺激に対する応答を迅速かつ再現性のある方法で研究できます。...

ヒト人工多能性幹細胞由来心筋細胞におけるカルシウムおよび収縮性パラメータのリアルタイム測定

光を使って心臓の細胞や組織を制御することで、非接触で刺激を受けることができるため、細胞の自然な状態や機能を保つことができるため、基礎研究や治療への応用に有用なアプローチとなっています。...

非遺伝的光刺激によるCa2+ 伝播を研究するための心臓微小生理学的システム

学ぶ光学イメージング法により、iPS細胞由来心室心筋細胞の活動電位を高スループットで記録する手法。遺伝子組み込み型電圧センサーを用いて、心臓電生理学の研究に応用可能です。

人間のサブタイプに固有の光の活動電位記録誘導多能性幹細胞由来の心室心筋細胞

さらに動画を探す