Name: 相関光電子顕微鏡 (クレム) 追跡のウイルス蛋白質のイメージング関連するクライオ固定化細胞の構造 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: 学ぶ相関光電子顕微鏡法でウイルス誘発細胞内構造を可視化する方法。高圧凍結とライブ細胞イメージングを組み合わせ、ウイルス・宿主相互作用の理解に貢献します。

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EMBL (ハイデルベルク)、ハイデルベルク大学の電子顕微鏡によるコア設備 (後頭) スタッフに大変感謝しております。我々 も感謝したいウルリケ ・ Herian ・ ステファニー カリス ・ アンドレア ・ ヘルウィッグ (ハイデルベルク大学)、および Eberhardt シュミット、専門家の技術援助のレナーテ ・ クンツ (ウルム大学)。R. b. によって仕事と彼のチームは、(U.H. と先住民保留地 B) は、ドイツ研究振興協会、SFB1129、TP11、TRR83、TP13 によって支えられました。

著者が明らかに何もありません。

C 型肝炎ウイルス複製関連を明らかにする構造、主に二重膜小胞 (Dmv)21日前に、と同様に、細胞膜上のウイルス蛋白質の表現の影響を研究するここで紹介するクレム方法は、正常に使用されていますこれらの HCV 誘起構造23を形成するために必要な重要なビルディング ブロックを決定します。クレムを使用して c 型肝炎ウイルス複製21を研究する私たちの最初の仕事で、ここで説明したプロトコルのわずかに変更されたバージョンが適用されたことに注意してください。参照パターンが炭素上のファインダーのグリッドでコーティングすることによって作成された、研究、英数字のパターンがない従来の 0.05 mm 厚サファイアディスクで使用されていた (材料の表を参照してください)。現在のプロトコルのこのバージョン最終的に適用できます、利点は HPF の"A"のキャリアが図 3Aのように伐採を必要とせず、直接に使用できます。また、前述のプロトコルでは、"A"キャリアより厚い利用できる (材料の表を参照してください)"B"キャリアを必要とせず、パターン化されたサファイア ディスクと。
興味深いことに、このプロトコルは細胞トランスフェクションとして記述されていたウイルス蛋白質とここと他19、23の BSL 1 サンプルを学習するのみならず、ウイルス感染細胞を研究にも適用できます。人間の病原体の操作が BSL-2 および BSL 3 の所に通常制限されている一部の国でがこれらのバイオ セーフティの条件の下で低温固定化を実行することも可能。それらの BSL 2 および BSL 3 研究所ガラスが HPF マシンのローカル規制有無のために、可能ではない、ウイルス感染細胞まだアルデヒド化学固定は、事前に行われている場合、このメソッドを使用して準備することができます。すなわち BSL 2 または BSL 3 施設前に残しています。また、アルデヒドは、プロトコルの残りの部分はここで説明したものと同じ、蛍光性を保つために固定後すぐに急冷する必要があります。この手法は冗長と 2 回、化学、ガラスを介してセルが固定されているため。しかし、この二重固定プロトコルは細胞化学固定だけで21を受ける Dmv と比較して c 型肝炎ウイルスによる Dmv の多くより良い保全に確かに します。
さらなる変更と読者をトラブルシューティングのためノートこの原稿のプロトコルの部分全体をいいます。これらのノートには、このメソッドを実行するときに発生する可能性が推定上の困難を克服する選択肢と同様、落とし穴を避けるため、について説明します。
この手法を適用するための主な前提条件は、HPF マシンです。とき HPF を介して細胞 (HPF マシンの不在) のために現実的ではないか (とき膜保全を最適化する必要はありません) が不要、低温固定化細胞化学的に固定、その後準備および分析できる EM8、 9,10、11,12,13,14,15,16,17,18 ,19。このオプションには、セルまたはセルのクラスターを再配置するためのグリッド パターンで細胞培養皿が、サファイアのディスクの使用は不要です。これらの料理の使用の主な利点は、大きい表面領域のスクリーニングを許可するサファイアのディスクと比較してより大きな直径です。したがって、このクレム プロトコルのアプリケーションが正常に適用されて15 HCV に対する抗ウイルス化合物の影響を研究するかをノロウイルス19の非構造タンパク質による膜の再編成を視覚化します。このメソッドの性能を制限することができます別の問題商業 FS デバイスの不在であります。この場合、基本的な自家製 FS システムは代わりに利用できます。FS 自動処理事故を低減できますが、自家製のデバイスに使用されます正常に例えばケント マクドナルド30とポール ヴァルターのラボ。
化学固定法に関しては、ここで説明されているプロトコルは、細胞内構造を20の最適な保全を保証します。したがって、上記の HPF と FS デバイスが利用可能な興味のセルを vitrifying 好ましいででしょう。
このクレム アプローチに将来の選択肢には、超微細構造レベルで 2 D の情報を取得するだけでなくウイルスによって引き起こされる膜と細胞小器官の変化のアーキテクチャについては 3 D を得るためにこのメソッドを使用する可能性が含まれます。電子線トモグラフィー (ET) と集束イオンビーム ビーム走査電子顕微鏡 (SEM FIB) (広範囲に記載されている29) などを含む、3 D 電子顕微鏡法は、次のこの現在プロトコル21、用意されているセルにも適用できます。 31。さらに、z スタックの取得を可能にする共焦点の顕微鏡を使用する場合は、LM レベルで 3 D 情報をまた取得でした。実際には、LM と EM のデータセット間の相互関係が目的 (たとえば17を参照) の場合、このオプションはお勧め高い。3D z スタックに含まれる情報は 2D の TEM 像との相関関係を改善するために役立ちます。したがって、このようなシナリオでは、最高のフィッティング LM と EM の画像選択でき相関ソフトウェアの利用、氷 (http://icy.bioimageanalysis.org/)32の ec クレム プラグインなどのランドマーク対応プラグインの 1 つにさらされてイメージ J (http://imagej.net/Landmark_Correspondences) LM EM 画像を重複の生成に終って。
時系列情報は特定のイベントの動態を理解する必要があるときは、EM との組み合わせで生きている細胞の動態を監視するタイムラプス イメージングを使用できます。興味のイベント中に、細胞は EM を介してその後分析することができます「凍結スナップショット」を生成する、固定の時にその特定の瞬間についての詳細な微細構造を提供する、すぐに固定されています。リアルタイムで観察した後、その「凍結スナップショット」を得るために細胞は化学的固定33またはクライオ固定6をすることができます。以来、多くの細胞プロセスが化学固定の拡散プロセスより速く発生する「超急速凍結可能であれば、実行していますください。しかし、その効果的な時間解像度34で HPF マシンは異なることを考慮する重要です。
さらに、このプロトコルはエポキシ樹脂でセルの埋め込みをしていますが低粘度樹脂、Lowicryls、白 LR や LR 金などで、細胞をまた埋め込むことが。これらの埋め込みメディアの使用抗原性35,36, として蛍光37,38を保つことができるし、したがって、セクションに反応39を埋め込み後の大抵使用されます。,40とセクションにクレム41,42,43,44LM は、埋め込み後に行われます。(免疫 EM、セクションにクレム) 両方のアプローチは、非特性構造見つけることができます簡単に TEM 経由もしくは LM と EM の miscorrelation に対する制御信号それらの実験のために重要である必要があります。同様に、両方なイメージ投射様相 (LM および EM) で目視できる抗体を標識することができます実施される45たとえば、LM (ステージを埋め込み済み) で transfected セルを識別しのより正確な局在化を達成するため、GFP 信号を介して免疫 EM (ポスト埋め込みステージ) によってその特定のラベリングします。それを考慮して計算する必要があります、LM EM レベルで細胞アーキテクチャの最適保全があります細胞内領域に対する抗体のアクセスを許可する前に、透過を実施するただし、します。興味深いことに、このプロトコルは、また適してマルチカラー実験では, (下図) GFP 以外、他の蛍光タグを使って実現できます。結論としては、このプロトコルでは、LM や取り上げられる質問によって、EM 側の両方の適応の多くの推定される可能性があります。他の代わりとなる議定書の包括的な説明、リーダーと5,46が呼ばれます。顕微鏡様式を結合する方法に関係なく一緒に結果は良いウイルス、そのタンパク質が実生活で彼らのホストと対話する方法を理解すること、情報のゲインです。
このメソッド内で最も重要なステップは、興味のセルからシリアルのセクションのコレクションです。代表の結果セクションで強調表示されている専門スタッフとして多くの忍耐力が必要です。重要なは、この手順は、2 つの理由のための EM のレベルで細胞を見つけるために不可欠です。まず、あらかじめ LM を埋め込みを用いたクレム プロトコルのこの種の座標は、のみ表示 LM レベル、樹脂ブロックの顔に埋め込み後。しかし、彼らが見えません TEM による断面に。したがって、興味 (ROIs) の領域にダウン ブロックの顔にターゲットを絞ったトリミングはその後得られたセクションが指定された FP を発現している細胞を含むようにかみそりの刃で慎重に達成されなければなりません。第二に、いくつかのセクションを「スキャン」は LM と EM 買収の間最高のオーバーレイを見つけるために必要。この場合、LM を埋め込み後の段階で実行するメソッドとは対照的は LM EM オーバーレイは非常に正確なないです。低オーバーレイ精度は LM と EM、EM のサンプル処理中に収縮と42を断面中に圧縮の軸方向の解像度の違いによるものです。それにもかかわらず、ランドマークの使用などの効率的な管理方法は、戻ってセルを見つけるのに役立ちます。これには、別の 1 つのセルの位置と同様、彼らの核と細胞の形状が含まれます。この点で、プロトコルで説明したように、DIC 画像は相関関係を改善するために重要な細胞の「解剖学的」情報を提供します。また、核または他のよく認識細胞小器官 (ミトコンドリアや脂質など水滴) LM 前にステンド グラスし、目印として使用することができます。
最後に、この原稿はウイルス学研究のためこのテクニックの使用に焦点を当ててより一般的な生物学的質問に対処するこの実験的なデザインのスコープを拡張できます特筆です。

特定の生物学的プロセスのより良い画像を取得する 2 つの顕微鏡のモダリティを組み合わせることの考えはかなり古いです。したがって、「相関顕微鏡」を使用してウイルスの非常に最初の研究は、2 つのパブリケーション1,2として 1960 年に出版されました。その研究では、2 つの顕微鏡技術を用いたアデノ ウイルスによる核の形態の変化を分析しました。最初の出版物でアデノ ウイルス感染症に関連付けられている形態学的詳細を説明する電子顕微鏡検査 (EM) 観測報告1通でした。2 番目の文書の EM で観測された異なる構造は以前 EM2によって観測された構造の性質を定義するための組織化学的染色パターンの光学顕微鏡観察 (LM) 画像と相関しました。
ただし、これらの初期の研究は、彼らの観察は、独立した実験として別の感染細胞を使用して行われました。「相互関係」、確かに、意味した 2 つの画像診断装置からの情報の組み合わせとして異なるアッセイは、与えられた生物を理解するために得られているすべての調査結果を比較する特定の現象を理解するにはプロセス。
用語の相関顕微鏡相関光学および電子顕微鏡 (クレム) として知られているに共通性 (参照3,4、5の見直し)、メソッド数の増加に適用この頃は、その両方のイメージング技術 (LM および EM) は非常に同じサンプルで遂行されます。両方の方法を組み合わせて結果、それにより、そのサンプル3のマルチ モーダル、マルチ スケール ・多次元分析。利点は、LM 時にタンパク質または異種細胞集団内の興味の蛋白質を表現する細胞の亜集団の同定を有効にする多くの異なった細胞の広範な概要を提供できることです。EM の LM は、特定の細胞内イベントのより高い解像度の画像を提供する解像度の制限を克服します。さらに、EM はそれによってバインド膜小器官、大きな高分子複合体(例えばリボソーム、由来等)、細胞骨格の要素を含む非蛍光性の細胞内局在コンテキストの可視化を実現にします。いわゆる「リファレンスの空間」6、追加空間情報の提供および LM によって検出された蛍光スポットにコンテキストを与えること。
最後の数年間クレム細胞生物学者5、のみならずウイルス学者 (文献7に見直し) の強力なツールとなっている成功したウイルスの伝搬につながる複雑なウイルス-細胞の相互作用を理解していく所存です。したがって、ウイルスが細胞膜と自分の利益に細胞小器官を変更する方法を理解することは、病原性ウイルスを根絶するために抗ウイルス薬の開発が不可欠です。
検出を可能にするここでは、クレム法、蛍光タンパク質 (FP) に溶けるウイルス蛋白質を発現する細胞の LM で説明します。これらの細胞は、その後低温固定し、さらにこれらの蛋白質の表現が (図 1) の細胞膜に再配置に新たな洞察を得るために透過型電子顕微鏡 (TEM) による微細構造の解析のために準備。クレムの日付8,9,10、11,12,13,14 に公開ウイルス研究のほとんどに化学的に固定細胞を行った ,,1516,17,18,19。これは主にバイオ セーフティ レベル 2 の可能ない細胞の固定化の低温は通常、-3 (BSL-2 および BSL 3) 研究所バイオ セーフティ上の理由から感染物質を不活化の必要性。細胞膜の最適な保全を必要とするものについての質問、ガラス化凍結 (HPF) 高圧を介して、しかし、強くお勧め20。この場合、ここで説明したクレム プロトコルを適用できます。興味深いことに、感染試料を扱う場合に特に、HPF はされている化学的に活性では以前、たとえば BSL-2 および BSL 3 研究所のサンプルで実行できます。HPF 続いて化学固定法の組み合わせは、少なくとも部分的に低温保存方法21,22の利点から利益を得る可能性が。
<img alt="光学顕微鏡から透過型電子顕微鏡へのプロセス図。細胞の調製とセクショニング。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58154/58154fig1.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> 図 1: を介して細胞の分析用のワークフローの略図クレム。パターン化されたサファイア ディスクに育つセル最初、EM についての処理の前に FPs を発現する細胞をローカライズする LM によって分析されます。見つかったら、細胞はすぐに HPF と FS 後から樹脂に埋め込むことによって固定されています。細胞が成長していたサポート樹脂の重合によって (= サファイアディスク) 樹脂ブロックから削除する必要があります。組み込みのセルを含むブロックは、そこから残りのセルは、FPs を表現するダイヤモンド ナイフで区分である小さな台形にトリミングされます。超薄切片はスロット グリッド上で収集された、さらにこれらの細胞の微細構造の情報を取得する TEM によって調べられました。この図は、適応され、参照29から許可を得て変更します。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58154/58154fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

<table><tbody><tr><td>UVクロスリンカー</td><td>Stratagene</td><td>400072</td><td>Stratalinker 1800、230 Vac、254 nm UV電球を装備、各8ワット/。</td></tr><tr><td>パターン化されたサファイアディスクエンジニアリング</td><td>オフィスM.Wohlwend、ゼンヴァルト、スイス</td><td>627</td><td>彼らは直径0.3ミリメートル、厚さ0.16ミリメートルだけでなく、セルの再配置を可能にするエッチングされた英数字パターンを持っています。martin-wohlwend@bluewin.ch の電子メールでのみ注文できます。</td></tr><tr><td>スリムで長いピンセット</td>電子<td>顕微鏡科学、ハットフィールド、ペンシルバニア州、米国</td><td>72919-SS</td><td>「スタイルSS」、サファイアディスクを取り扱うためのもの。</td></tr><tr><td>細胞培養培地</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td><td>41965-062</td><td>2 mM L-グルタミン、非必須アミノ酸、100単位ペニシリン/ml、100 μ;gストレプトマイシン/mLおよび10%ウシ胎児血清(DMEM完全、下記参照)。.10本入りのパッケージ、各500mL。</td></tr><tr><td>L-グルタミン</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック、ウォルサム、マサチューセッツ州、米国</td><td>25030-123</td><td>100mL のボトルが20本入ったパッケージです。</td></tr><tr><td>非必須アミノ酸</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td><td>11140-068</td><td>100 mL/各20本入りパッケージ。</td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック、ウォルサム、マサチューセッツ州、米国</td><td>15140-163</td><td>100 mL/各20本入りパッケージ。</td></tr><tr><td>子牛胎児血清</td><td>シグマ・アルドリッチ、セントルイス、ミシガン</td>州、米国 <td>F7524</td><td>50mLのボトル</td></tr><tr><td>倒立顕微鏡</td><td>オリンパス・ドイッチュランド、ハンブルク、ドイツ</td><td>CKX41</td><td>三眼ヘッドオプションと蛍光アップグレード機能を備えた倒立顕微鏡です。</td></tr><tr><td>Huh7-Lunet細胞は、T7 RNAポリメラーゼを安定して発現</td>しています <td>ラルフ・バーテンシュラーガー教授研究室で利用可能</td><td>利用できません</td><td>Bartenschlager教授の連絡先:ralf.bartenschlager@med.uni-heidelberg.de.</td></tr><tr><td>Mirus TransIT-LT1 トランスフェクション試薬</td><td>Mirus Bio LLC, Madison, USA</td><td>MIR 2304</td><td>広域スペクトル、低毒性、DNAトランスフェクション試薬。0.4mLのバイアル</td></tr><tr><td>倒立広視野蛍光顕微鏡</td><td>Carl Zeiss Microscopy GmbH, Germany</td><td>Zeiss Observer.Z1</td><td>生細胞培養を含む実験用の倒立蛍光顕微鏡。</td></tr><tr><td>1-hexadecene</td><td>Merck, Darmstadt, Germany</td><td>8220640100</td><td></td></tr> <tr><td>高圧フレージング(HPF)用100mLのボトル「A」アルミニウムホルダーEngineering</td> <td>Office M. Wohlwend, Sennwald, Switzerland</td><td>241</td><td>これは、このプロトコルに使用されているホルダーで、0.1mmと0.2mmの2つの異なる深さがあります。電子メールでのみ注文できます:martin-wohlwend@bluewin.ch。</td></tr><tr><td>HPFエンジニアリングオフィス用「B」アルミニウムホルダー</td><td>M. Wohlwend, Sennwald, Switzerland</td><td>242</td><td>このプロトコルに使用されているホルダーです。厚さは0.3mmです。martin-wohlwend@bluewin.ch の電子メールでのみ注文できます。</td></tr><tr><td>HPFのための「A」アルミニウムホールダー(パターン化されたサファイア ディスクと働くための特別)</td><td>工学オフィスM. Wohlwend、ゼンヴァルト、スイス</td><td>737</td><td>これはパターン化されたサファイア ディスクと単独で使用することができるよりホールダーである(現在の議定書の代わりとして)、必要なく「B」のホールダーか「A」のホールダーの版。厚さは0.84mmです。電子メールでのみ注文できます:martin-wohlwend@bluewin.ch。</td></tr><tr><td>サファイアディスク</td><td>エンジニアリングオフィス M. Wohlwend, Sennwald, Switzerland</td><td>405</td><td>これらのサファイアディスクは、直径0.3mm、厚さ0.05mmの「従来の」ものです。また、パターン化されたサファイアディスクの代わりにCLEMにも使用できます。</td></tr><tr><td>ファインダーグリッド</td><td>Electron Microscopy Sciences, Hatfield, Philadelphia, USA</td><td>LF135-Cu</td><td>これらの135メッシュグリッドは、カーボンコーティングを介して「従来の」サファイアディスク(上記)に英数字パターンを作成するために使用され、CLEM.100グリッド/バイアルに使用できます。</td></tr><tr><td>HPFマシン</td><td>ABRA Fluid AG, Widnau, Switzerland</td><td>HPM 010</td><td>このHPFマシンは、このプロトコルに使用されています。</td></tr><tr><td>HPFマシン</td><td>Leica Microsystems、ウィーン、オーストリア</td><td>EMPACT 2</td> <td>"EMPACT 2"、それがこのプロトコル(上記の)で使用されてきたHPMマシンの使用に代わるものとして。</td></tr><tr><td>クライオチューブ</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック、ウォルサム、マサチューセッツ州、米国</td><td>Z763667-500EA</td><td>液体窒素中のクライオ固定化サンプルの長期保存用。500個のクライオバイアルが入ったパッケージ。</td></tr><tr><td>液体窒素デュワー</td><td>Cole-Parmer GmbH, Wertheim, Germany</td><td>GZ-05094-60</td><td>液体窒素中の凍結固定化サンプルの長期保存用で、1600本のクライオチューブの容量を持つクライオラックを装備しています。</td></tr><tr><td>自動凍結置換(AFS)装置</td><td>ライカ・マイクロシステムズ(オーストリア・ウィーン</td>) <td>EM AFS2</td><td>この機械は、凍結置換と漸進的な温度低下(PLT)技術を行い、樹脂の低温埋め込みと重合を可能にします。</td></tr><tr><td>四酸化オスミウム(OsO4)</td><td>Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA</td><td>19150</td><td>4%水溶液、10 x 2 mLアンプルが入った1箱。</td></tr><tr><td>ウラニル-アセテート(UA)</td><td>Serva、ハイデルベルク、ドイツ</td><td>77879.01</td>(<td>UA)-2 H2Oの25グラムを含むボトル。</td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Bandelin Electronic、ベルリン、ドイツ</td><td>329</td><td>「Sonorex Super RK 31」は、FS培地を調製する際にOsO4とUaを混合するためにこのプロトコルで使用される水系洗浄液用の高出力超音波洗浄槽です。</td></tr><tr><td>ガラス蒸留アセトン</td><td>電子顕微鏡科学、ハットフィールド、ペンシルベニア州、米国</td><td>10015</td><td>100mLのボトル</td></tr><tr><td></td><td>ライカマイクロシステムズ、ウィーン、オーストリア</td><td>ライカM80</td><td>日常点検用のルーチン実体顕微鏡で、画像を取得するためのカメラを装備しています。</td></tr><tr><td>エポキシ樹脂</td><td>電子顕微鏡科学、ハットフィールド、ペンシルバニア州、米国</td><td>14120</td><td>埋め込み812は、メーカーが指定した比率で一緒に混合する必要があるいくつかのコンポーネントを含むキットです。</td></tr><tr><td>フロースルーリング</td><td>ライカマイクロシステムズ、ウィーン、オーストリア</td><td>16707157</td><td>100個入りパッケージ。</td></tr><tr><td>試薬浴</td><td>ライカマイクロシステムズ、ウィーン、オーストリア</td><td>16707154</td><td>100個入りパッケージ。</td></tr><tr><td>ウルトラミクロトーム</td><td>ライカマイクロシステムズ、ウィーン、オーストリア</td><td>ライカEM UC7</td><td>室温で半薄切片を調製するためのウルトラミクロトーム。</td></tr><tr><td>ウルトラ 35 > ダイヤモンド ナイフ</td><td>Diatome Ltd., Nidau Switzerland</td><td>AGG339-735</td><td>このナイフの刃の長さは 3 mm です。</td></tr><tr><td>超微細ピンセット</td>電子<td>顕微鏡科学、ハットフィールド、ペンシルバニア州、米国</td><td>E78318</td><td>「スタイル3X」、EMグリッドを取り扱うため。</td></tr><tr><td>EMスロットグリッド</td><td>Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA</td><td>G2010-Cu</td><td>100 grids/vial.</td></tr><tr><td>EMグリッド収納ボックス</td><td>Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA</td><td>71155</td><td>100グリッドの容量があります。</td></tr></tbody></table>

相関光電子顕微鏡 (クレム) 追跡のウイルス蛋白質のイメージング関連するクライオ固定化細胞の構造

Correlative Light Electron Microscopy (CLEM) for Tracking and Imaging Viral Protein Associated Structures in Cryo-immobilized Cells

その高解像度のため電子顕微鏡検査 (EM)、ウイルス学者の不可欠なツールです。ただし、EM を介してウイルスに感染したか transfected セルを分析する際の主な困難の 1 つは、感染症や遺伝子、これらの細胞の検査を妨げる低効率です。この困難を克服するために、感染したまたは transfected セルの亜種を割り当てる最初の光顕 (LM) を実行できます。したがって、ウイルス蛋白質に溶ける蛍光タンパク質 (FPs) の使用の利点を取って、LM は「肯定的な導入」のセルの位置を記録するここで使用される、FP を表現し、英数字パターンのサポートで成長しています。続いて、細胞、em 処理されますさらに高圧 (HPF) を凍結、凍結置換 (FS) と樹脂を埋め込みます。超急速凍結のステップは、優れた膜透過電子顕微鏡 (TEM) による微細構造レベルで分析することができますは、選択したセルの保全を保証します。ここでは、サンプル準備、イメージングおよび相関関係の詳細を記述する段階的な相関光電子顕微鏡 (クレム) ワークフローは提供されます。実験的なデザインは、多くの細胞生物学の質問に対処にも適用できます。

Lunet Huh7 細胞 T7 RNA ポリメラーゼを安定に発現するパターン化されたサファイア ディスクでシードされ、その後 C 型肝炎ウイルス (HCV) の 2 つのドメインの発現プラスミドをトランスフェクトした (図 1)、ここに示す手順を使用してください。非構造タンパク質 GFP (pTM_AH-D1-GFP) (図 4) が付いた NS5A。次の日どこのセルが増加している模様サファイアディスクに細胞培養皿から撮影され LM (図 4図 2) によるイメージします。AH D1 GFP を発現するそれらの細胞は細胞質の蛍光グリーンの存在によって識別され、サファイアディスク (図 5 a、 5 b) の座標パターン内の彼らの位置を保存する記録。2 つのアルミ キャリア (図 3) の組み立て、HPF による低温固定を受ける LM 審査、興味のセルを含むサファイアディスクの直後します。細胞は置換とその後エポキシ系樹脂に埋め込まれた、凍結されました。
重合樹脂ブロックからサファイアディスクの除去は、英数字のパターンの出版社は興味のセルが置かれたエリアを取得する許可されるブロックの顔に目に見える。樹脂ブロックの残りの部分は興味のセルをかくまっている小さな台形を生成する離れてトリミングでした。連続超薄切片がこの台形から得られる、EM スロット グリッド上で収集された、さらに、TEM (図 5C) によって分析します。注可能な28は手動で連続切片を得る労働集約的なよく訓練され熟練した人材が求められます。また、セルが以前 LM によって識別される同じセルの迅速な認識を保証するためにこのクレム プロトコル (図 5A) に服従するとき低密度を持つことが重要です。そうでなければ、高い細胞密度が劇的に遅くなる EM レベルで細胞の正常な検索します。
TEM 分析から区切られた変数の形態の小胞の蓄積の細胞内空間に存在を明らかに AH D1 GFP を発現した関心 (図 5、 5 e) の細胞の超薄切片をいくつかの単一の脂質 (図 5E) によって細胞質を囲みます。
<img alt="HCV RNA複製実験図 細胞トランスフェクションと蛍光顕微鏡による結果" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58154/58154fig4.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 4"> 図 4: ワークフローの模式図に描かれているクレムの例を実行する後図 5.エンコード両親媒性ヘリックス (AH) とドメイン 1 (D1) HCV NS5A タンパク質の DNA プラスミドをトランスフェクトしたされた T7 RNA ポリメラーゼを安定に発現する Lunet Huh7 細胞が GFP (pTM_AH-D1-GFP) とその C 末端タグ付き。NS5A タンパク質の発現は T7 プロモーター (T7 Pm)、並進二次構造によって示された、脳心筋炎ウイルス (EMCV) IRES (内部リボゾームのエントリ サイト) 要素転写制御されます。24 h 後トランスフェクション (24 hpt) 細胞成長パターン サファイアディスクと AH D1 GFP を表現する LM によって検出されすぐに HPF FS を受けます。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58154/58154fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="細胞構造解析;核切片;顕微鏡図;3D細胞イメージング;超微細構造研究。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58154/58154fig5.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 5"> 図 5: クレム プロシージャの例です。(A) Lunet Huh7 細胞成長パターン サファイアディスク、プラスミッドのトランスフェクション後 24 h pTM_AH D1 GFP GFP 陽性細胞を割り当てる蛍光顕微鏡による分析 T7 ポリメラーゼを安定に発現します。(B)クレムによって分析される白の破線の四角形内で選択した単一細胞の高倍率画像。(C) HPF、FS と樹脂埋め込み後同じ細胞の超薄切片の TEM 画像。目的のセルを含むスロット EM グリッド上シリアル 70 nm の超薄切片の模式図(D) 。左側の(E) : 興味のセルの 2 つのセクションの TEM の概要。右上: 単一膜を介して細胞質から区切られた小胞の高い数字を明らかに左側の黄色い四角形で選択した細胞内領域の高倍率 TEM 画像。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58154/58154fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

相関光電子顕微鏡 (クレム) メソッドは、以前、光顕 (LM) で選択されているセルの電子顕微鏡検査 (EM) による画像ウイルスによる細胞内構造に適用されます。LM および EM は、ウイルス-宿主間相互作用の統合ビューを達成するためにハイブリッド イメージング手法として結合されます。

Due to its high resolution, electron microscopy (EM) is an indispensable tool for virologists. However, one of the main difficulties when analyzing ...

この方法は、細胞膜に存在するバイオタンパク質がバイオレプリケーションとアセンブリに有利な環境をどのように作り出すかについての生物学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。ここで組み合わされた2つの技術的基礎は、1つ目は生細胞イメージングと電子顕微鏡法の相関関係、2つ目は高圧凍結です。この方法は、ウイルス源の相互作用に取り組むために設計され、成功裏に利用されていますが、細胞生物学のさまざまなアプリケーションに容易に一般化できます。この方法の視覚的なデモンストレーションは、成功するための実践的な経験を必要とする多くのステップ、特に高圧凍結による凍結固定化とその後のステップがあるため、非常に重要です。まず、表面の1つに英数字のパターンがエッチングされたパターン化されたサファイアディスクを15ミリリットルの円錐形遠心分離チューブに入れ、ディスクをエタノールで完全に洗浄します。洗浄したサファイアディスクを濾紙で裏打ちしたシャーレにセットして乾燥させ、細長いピンセットで乾燥させたサファイアディスクをスライドガラスに移します。4倍の倍率で倒立顕微鏡を使用し、すべてのサファイアディスクの座標パターンが読み取り可能であることを確認します。次に、紫外線架橋剤でディスクを5分間滅菌します。バイオセーフティキャビネットで、細胞培養培地の半分を細胞培養皿に加え、長いピンセットを使用してサファイアディスクを皿に慎重に移します。次に、1x10 をシードします

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Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

我々は、最も反射光顕微鏡に合うように設計された低コストの低温ステージの製造を実証する。このラボに構築された極低温ステージには、低温光と低温電子顕微鏡との間の効率的かつ信頼性の相関イメージングを可能にします。...

相関ライト/電子顕微鏡のための低コストクライオ光学顕微鏡のステージの作製

CLEMの技術はマイクロインジェクション分子の影響を受け、膜、細胞小器官、および細胞内構造の超微形態を分析するように適合されています。このメソッドでは、複数ナノメートルの分解能にミリメートルできるようにマイクロマニピュレーション/マイクロインジェクションの強力な技術、共焦点蛍光顕微鏡、電子顕微鏡を組み合わせたものです。この技術は、多種多様なアプリケーションに適している。...

マイクロインジェクション分子およびそれらの真核生物の細胞内ターゲットを視覚化するツールに相関光学および電子顕微鏡（クレム）

我々は高速3D生細胞の蛍光顕微鏡および高分解能低温電子断層撮影法を組み合わせた相関顕微鏡法を記載している。我々はダイナミックイメージング、宿主HeLa細胞との相互作用小HIV-1粒子による相関法の能力を実証する。...

ダイナミックな相互作用の3次元構造解析のための相関顕微鏡

この論文は、高分子のほぼネイティブな状態の高品質な顕微鏡画像を取得するために使用されるクライオ電子顕微鏡法について説明しています。この方法は、高分子の3D再構成を生成するために考案された単一粒子アプローチを使用したさらなるコンピュータ化された処理に適した画像を生成します。...

高分子の3次元再構成のための試料調製のプライマーおよび高品質データ収集：クライオ電子顕微鏡ののいいことといけないことをやる

量子ドット(QD)ナノ粒子をエポキシ包埋ヒト病理組織の相関免疫細胞化学的研究に使用できる方法が説明されています。私たちは、広視野蛍光光学顕微鏡および透過型電子顕微鏡で可視化される市販の抗体フラグメント標識量子ドットを採用しています。...

量子ドットナノ粒子を用いた相関光 - 及び電子顕微鏡

私たちは、ミリ秒の時間分解能を有する膜ダイナミクスの可視化を可能にし、電子顕微鏡、「フラッシュおよび凍結、」における新規技術を開発しました。この技術は、高圧凍結とニューロンの光遺伝学的刺激を兼ね備えています。ここでは、手順を示し、詳細なプロトコルを記述します。...

フラッシュとフリーズ：電子顕微鏡でメンブレンダイナミクスをキャプチャするために新しい技術

ここでは、細胞の超微細構造に関連する希少タンパク質の局在を調査するためのツールとして、内因性蛍光標識に基づく最適化されたオンセクション相関光電子顕微鏡法のプロトコルを紹介します。このアプローチの威力は、バフィロマイシン処理を行わない飢餓細胞における内因性LC3の超微細構造局在によって実証されています。...

オンセクション相関光電子顕微鏡による内因性LC3の超微細構造局在

mScarletと呼ばれる蛍光タンパク質を使用したEponの埋め込み後相関光および電子顕微鏡の詳細なプロトコルを紹介します。この方法では、蛍光と超微細構造を同時に維持できます。この技術は、さまざまな生物学的用途に適しています。...

Epon Post Embedding 相関光電子顕微鏡

このプロトコルは、相関光顕微鏡と電子顕微鏡を使用して、それぞれmEosEMとAPEX2で標識されたミトコンドリアとリソソームの相互作用を視覚化するメカニズムを説明しています。...

ミトコンドリアとリソソーム間の相互作用を可視化するための2色相関光顕微鏡と電子顕微鏡法

このワークフローは、極低温トライコンシブイメージングプラットフォームを使用して、小さく(軸方向&lt;1μm)希少な(細胞あたり1コピー)蛍光標識された生物学的構造を標的としたラメラ生成を可能にします。このプラットフォームは、蛍光顕微鏡、集束イオンビームミリング、走査型電子顕微鏡を単一の焦点位置に統合し、ミリング中の同時蛍光顕微鏡を可能にします。...

極低温同時蛍光、電子、イオンビーム顕微鏡を用いた細胞のターゲットミリングのためのワークフロー

学ぶ相関光電子顕微鏡法でウイルス誘発細胞内構造を可視化する方法。高圧凍結とライブ細胞イメージングを組み合わせ、ウイルス・宿主相互作用の理解に貢献します。

相関光電子顕微鏡 (クレム) 追跡のウイルス蛋白質のイメージング関連するクライオ固定化細胞の構造

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