多量ホモ測定器と無料、フリー、オープン ソースの明るさ解析ソフトウェアを使用しての体外校正無料定量化

このプロトコルでは、蛋白質ホモ重合体外に基づく商業光走査顕微鏡を用いた蛍光揺らぎを定量化するための校正無料のアプローチについて説明します。正しい取得の設定と解析方法が表示されます。

この方法は、タンパク質間相互作用の非常に低濃度に対する低分子阻害剤の影響を解明するなど、薬物スクリーニング分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、キャリブレーションが不要で、任意の共焦点顕微鏡に実装でき、非常に少量の標識タンパク質を利用できることです。この手法は、タンパク質間相互作用に関する定量的な情報を提供するため、抗がん剤、低分子阻害剤、およびさまざまな融合阻害剤の開発にまで及びます。

この方法は、in vitroでタンパク質の相互作用と凝集に関する洞察を得ることができますが、生細胞タンパク質のダイナミクスや細胞間相互作用など、他のシステムにも適用できます。まず、モノマー化されたヒトFKBP12およびN末端のHis6およびmVenusタグを含むpET-22bベクターでpLysS細胞を形質転換します。細胞がインキュベートおよび熱ショックから回復した後、抗生物質を添加したLB寒天上に細胞をプレートします。

形質転換したコロニーを100ミリリットルのLBスターター培養に移し、振とうしながら摂氏37度で16〜20時間増殖させます。インキュベーション後、緻密なスターター培養物をLB培地で100〜100に希釈し、500ミリリットルのバッチを2回に分けます。その後、2〜3時間かけて600ナノメートルの光学濃度0.6〜0.8まで成長させます。

氷上で培養物を冷却した後、250マイクロモルのIPTGでタンパク質産生を誘導します。21°C、200rpmで16〜20時間培養します。次に、2, 000 gで20分間遠心分離することにより細胞を回収します。

上清を取り除き、EDTAフリープロテアーゼ阻害剤を添加した40ミリリットルのIMACバッファーAにペレットを再懸濁します。次に、500ワット、20キロヘルツ、40%の振幅でセルを9秒間オン、11秒オフで15分間超音波処理します。超音波処理に続いて、20, 000gで4°Cで1時間遠心分離することにより可溶性材料を収穫する。

可溶性ライセートを円錐形のフラスコに移し、2ミリリットルのTALON樹脂を加えます。懸濁液を105rpm回転させて1時間インキュベートします。次に、樹脂を回収し、250 mLのIMACバッファーAで洗浄し、続いて500 mLのIMACバッファーB.IMACバッファーCを使用してHis6タグ付きタンパク質を溶出します。事前に平衡化したサイズ排除カラムに溶出液を注入し、約87.7ミリリットルで溶出するFKBP12ピークを収集します。

SDS-PAGEでタンパク質の純度を評価し、必要に応じてプールおよび濃縮します。マルチウェルプレートアレイをセットアップするには、まず、サイズ排除クロマトグラフィーに使用するのと同じバッファーに100ナノモル精製FKBP12の溶液を調製します。凝集体の形成を防ぐために、13, 000rpmのクイックスピンで超音波処理し、遠心分離します。

次に、希釈したタンパク質の100〜200マイクロリットルを、底がガラスの8ウェル観察チャンバーにピペットで移します。BBダイマーライザーを最終濃度10、20、40、80、100、150、300、および500ナノモルまで追加します。参考として、100ナノモルのmVenusのみの溶液を調製して、潜在的な凝集および沈殿効果を評価し、同じ取得設定でモノマーの輝度値を回復します。

デジタル検出器または十分に特性評価されたアナログ検出器を装備し、取得したすべてのピクセルに対して一定の滞留時間を維持できる任意の光走査型顕微鏡共焦点システムを使用できます。蛍光相関分光法用に設計されたカラー補正水浸対物レンズを選択します。次に、カラー補正水浸対物レンズに水滴を追加します。

8ウェルの観察室をステージに取り付けます。514ナノメートルのレーザーをオンにし、対物レンズの出口で20〜100ナノワットの出力に設定して、励起ビームパスを設定します。1つのHyD検出器をオンにします。

フォトンカウンティングが可能な検出器が好ましい。520〜560ナノメートルの発光ウィンドウを選択します。取得モードの場合は、16 x 16 ピクセルを使用します。

フレーム時間がタンパク質の拡散よりも長くなり、ピクセルの滞留時間が大幅に短くなるように、ピクセルの滞留時間を設定します。これは、このデモンストレーションで使用したシステムの滞留時間を約 13 マイクロ秒に設定することに相当します。ピンホールをエアリー1台にセットすると、対応する約545ナノメートルの発光が得られます。

xy時間取得モードを選択し、取得およびウェルごとに取得するフレーム数を選択します。次に、ピクセルサイズを約120ナノメートルに設定します。システムにハイスループットモードが装備されている場合は、各ウェルの座標とウェルごとの取得数を導入して、プロセスを自動化します。

システムに灌流システムが装備されている場合は、BB溶液をロードし、5, 000フレームの直後に開始するように灌流をプログラムして、10, 000枚の画像を取得しながら二量体化の動力学を評価します。正しいウェルを選択し、ソリューションに焦点を当てます。次に、取得を開始し、結果の画像のスタックをTIFF形式で保存します。

100ナノメートル溶液中の精製FKBP12 mVenusの20, 000枚の画像の配列は、プロトコルセクションで指定されているように取得されました。最初のフレームの強度は、トレンド除去された画像の平均強度プロファイルとともに表示されます。スムースフィルタリングなしとスムースフィルタリングありの明るさも表示されます。

10, 000フレームを取得した後、ホモ二量体化薬BBを溶液に添加しながら取得しました。5, 000フレームの各連続したシリーズが分析されました。BB添加後5分の平均輝度は1.010で、これは2倍の増加であり、FKBP12ダイマーを示しています。

このプロセスの速度論は、BB添加と完全なFKBP12二量体化の間に約2分の遅延を示しています。in vitroでタンパク質間相互作用を評価するための重要な側面は、標識タンパク質の産生と精製です。標識された目的のタンパク質が少量あること、および分析ごとにタンパク質が凝集していないことを確認してください。

この手順に続いて、解離定数や拡散係数などの追加の質問に答えるために、表面プラズモン共鳴や蛍光相関分光法などの他の方法を実行できます。その開発後、この技術は、生物物理学の分野の研究者が生細胞におけるタンパク質間相互作用を詳細に探求する道を開きました。タンパク質精製のための試薬の取り扱いは非常に危険であり、この手順を実行する際には、安全メガネ、手袋などの予防措置を常に講じる必要があることを忘れないでください。