マウスにおける気腫の評価に対する一定圧力下での肺固定
September 26th, 2019
ここに提示される肺固定のための有用なプロトコルは、肺気腫のマウスモデルからの肺標本の組織学的評価のための安定した状態を作成する。このモデルの主な利点は肺の崩壊またはデフレなしで同じ一定した圧力の多くの肺を固定できることである。
固定装置内の一定の圧力は、軽度のタバコの煙誘発肺気腫の評価に適した組織学的肺検体を生成する合理的に膨張した状態で肺を維持する。このモデルの主な利点は、肺の崩壊やデフレなしに同じ一定の圧力を使用して、同時に多くの肺を固定できることです。この手順を実演するのが、研究室の大学院生である荒野直子です。
反射運動に対する応答性の欠如を確認した後、マウスの内側線に沿って皮膚および筋肉組織を切開し、頭蓋領域を目指し、横方向に切断してより広い作業空間を作り出す。ダイヤフラム層を露出させた後、組織を鉗子で穿刺し、胸腔を開く。胸部領域を切り取り、肺と心臓を視覚化します。
左心房と右心室を切ります。灌流ポンプに接続された24ゲージカニューレを右心室領域に挿入し、肺動脈に到達するまでカニューレを頭蓋領域に向けます。次に、ポンプをオンにし、肺組織のすべてが白色に変わるまで1時間PBSの約200ミリリットルで組織を浸透させます。
灌流の終わりに気管、肺および心臓を取り巻く結合組織を切断し、右の主気管支を結ぶために縫合糸を使用する。次に、右肺の個々のローブをすべて収穫し、左肺の心臓とローブを適切な固定剤を含む個々の10ミリリットルの注射器に入れる。肺を膨らませて、注射器から肺を取り除くために、シリンジに真空を作り出すプランジャーを引き込みます。
気管に20ゲージカニューレを挿入し、縫合糸を使用してカニューレを所定の位置に固定します。固定剤で満たされた1ミリリットルのシリンジをカニューレに接続し、肺に追加の固定剤を充填して漏れをチェックします。固定中に肺の検体が肺板から外れないように、挿入部位が確保されていることを確認してください。
次に、組織を肺固定圧装置に移し、サンプルを取り除き、固定期間の終わりに結び目で気管を引き離します。肺サンプルが挿入される肺固定圧力装置の下部成分は、3方向のストップコックでホルマリンフローの先端に20ゲージカニューレを介して接続される。圧力は、下側と上の区画の間の固定剤の異なる表面レベルから生成されます。
圧力差は水の25センチメートルですが、高さ調整ノブは、水の25〜30センチメートルの間に圧力を調整するために使用することができます。ポンプは下側と上側の容器をつなぎ、固定面高さの25センチメートル差を保ち、薬剤の流れを導く。48時間固定後、周囲の空気にさらされたSMP30ノックアウトマウスからの肺は、著しい空域拡大を示さない。
しかし、慢性タバコの煙にさらされたSMP30ノックアウトマウスでは、有意な空域の拡大および歯槽壁破壊が観察される。さらに、肺検体の平均線形インターセプトおよび破壊指数は、空気暴露された動物よりも、露出したSMP30ノックアウトマウスの煙において有意に大きい。私たちの研究室は10%ホルマリンを使用していますが、研究者は実験ニーズに応じて他の固定剤を使用することができます。
我々は実証された固定システムを使用して報告したように肺のサンプルは形態評価のための様々なマウス肺気腫モデルから採取することができる。固定剤は危険な場合がありますので、常に適切な人の保護具を着用し、換気の良い部屋で作業します。
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概要
このプロトコルは、肺気腫のマウスモデルからの肺組織の組織学的評価のための安定した条件を確保する肺固定法の方法を概説しています。この技術により、肺の崩壊や脱気なしに複数の肺を同時に固定することができます。
主要な研究要素
科学の分野
- 神経科学
- 生物学
- 組織学
背景
- 肺気腫は、しばしば喫煙によって引き起こされる肺の状態です。
- 組織学的評価は、肺の病理を理解するために重要です。
- 固定中の肺の膨張を維持することは、正確な評価に不可欠です。
- このプロトコルは、肺固定技術の課題に対処しています。
研究の目的
- 信頼性の高い肺固定法を提示すること。
- 研究における肺組織の評価を容易にすること。
- 肺気腫モデルの組織学的分析の一貫性を向上させること。
使用された方法
- 一定の圧力を維持する固定装置の使用。
- 胸腔にアクセスするためにマウスの正中線に沿った切開。
- 横隔膜を穿刺して胸腔を開く。
- 組織採取のための肺と心臓の可視化。
主要な結果
- 固定中の肺の膨張の成功的な維持。
- 複数の肺を同時に固定する能力。
- 評価に適した安定した組織学的標本。
- 大学院生による手順のデモンストレーション。
結論
- このプロトコルは、肺固定の信頼性の高い方法を提供します。
- 研究における組織学的評価の品質を向上させます。
- この技術は、肺の病理を含む様々な研究に適用できます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Consistent lung fixation under constant pressure addresses a critical challenge in preclinical respiratory disease models by enabling reproducible histological evaluation of emphysema in mice. This method supports reliable morphometric analysis, reducing variability and enhancing predictive confidence in early-stage target validation for COPD research. The ability to process multiple specimens simultaneously streamlines comparative studies and supports robust portfolio triage decisions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables standardized morphometric assessment of emphysema severity in mouse models.
- Supports functional validation of candidate targets by providing reproducible tissue architecture.
- Facilitates biological de-risking by minimizing fixation-induced artifacts.
- Improves predictive confidence in linking histological endpoints to mechanistic hypotheses.
Screening & Assay Development
- Prepares validated lung specimens for downstream quantitative histological assays.
- Ensures reproducibility and comparability across experimental cohorts.
- Supports scalable processing of multiple samples under identical conditions.
- Enables reliable evaluation of compound effects on lung structure in screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Aligns preclinical lung pathology models with disease-relevant endpoints for translational studies.
- Maintains continuity from discovery through preclinical validation by standardizing tissue preparation.
- Reduces risk of artifactual findings that could confound biomarker or efficacy assessments.
- Supports risk-adjusted advancement decisions based on robust histological data.
Pipeline & Workflow Integration
This constant-pressure fixation method integrates into the early discovery and preclinical validation continuum, supporting both target validation and lead identification in respiratory disease models.
- Discovery Biology: Provides reliable tissue architecture for hypothesis testing and pathway analysis in emphysema models.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative histological outputs for compound evaluation.
- Analytics: Enables morphometric measurements such as mean linear intercept and destructive index for comparative analysis.
- Translational Research: Supports alignment of preclinical findings with clinical emphysema pathology when relevant.
- Enterprise Reuse: Offers a standardized fixation capability adaptable across various mouse lung disease models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances predictive confidence and target validation by minimizing fixation variability.
- Operational Value: Increases throughput and standardization by enabling simultaneous fixation of multiple specimens.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency by supporting robust histological endpoints.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted prioritization of respiratory disease programs based on reliable tissue data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mouse surgical procedures and lung tissue handling.
- Needs specialized fixation equipment capable of maintaining constant pressure.
- Demands cross-team standardization of fixation parameters for reproducibility.
- Adaptable to different fixatives based on experimental requirements.
- Must address safety protocols for handling hazardous fixation agents.
