Name: 健康と病理の間の区別の形態に基づく細胞利用のフーリエ変換と自己組織化マップ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 59 s
Description: 学ぼう、フーリエ変換と自己組織化マップを用いて3D顕微鏡データから細胞形態を解析し、健康な細胞と病態細胞を自動識別する計算的手法。このワークフローはがん診断と免疫学研究に応用可能です。

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著者は、有意義な議論と彼のサポートありがとうベンジャミン ・ クラウス。さらに著者はロバート ・ ギュンターの生細胞顕微鏡検査して彼の支援をありがちましょう。
仕事は、DFG 支援 NI1167/3-1 (ジミ) r. n. に支えられて、Z.C.、DFG 金融支援 CRC 1278 PolyTarget プロジェクト Z01 Z.C.、r. n. SFB633、TRR130、A.E.H.、J.B.S. に Exc257 に TRR130 で C01BfR 提供 F.L.K およびアラバマの学内サポート SFP1322 642

1. プロトコルの要件
<ol><li>サンプリング間隔高解像度画像を得るための試験片の少なくとも 2 回最高の空間周波数とナイキスト基準に準拠して逆算高分解能逆算三次元 (3 D) 顕微鏡データを取得します。</li>
	<li>表面再構成とエクスポートは、3 D レンダリング ソフトウェアを使用します。</li>
	<li>Python スクリプトを実行することができる 3 D アニメーション ソフトウェアを使用 (Python スクリプトは github のレポジトリからダウンロードすることができます: https://github.com/zcseresn/ShapeAnalysis) 2 D 投影を作成します。</li>
	<li>フィジー13を使用して投影を分析し、DFT 成分を抽出します。<ol>
<li>現在のフィジー配布を使用します。フィジーのインストール済みのバージョンが既にある場合は、インストールされているバージョンが最新であることを確認します。これは簡単にヘルプを実行して実現できます |更新オプションです。</li>
		<li>を使用して動的輪郭プラグイン15、http://imagejdocu.tudor.lu/doku.php?id=plugin:segmentation:active_contour:start からダウンロードすることができますし、プラグインのフォルダーにコピーする必要があります。</li>
		<li>Github のレポジトリ、プラグインのフォルダーにコピーから陰フィジー プラグインをダウンロードします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>自己組織化マップの計算できる計算数学ソフトウェアを使用します。</li>
</ol>2. 3 D 画像を再構成します。
注: テスト目的のため、例のデータセットは、github のリポジトリ (上記参照) で提供されます。
<ol><li>三次元ソフトウェアを起動し、3 D 画像データを開きます。</li>
	<li>(すべて) オブジェクトの 3D サーフェスを作成します。<ol>
<li>表面の3 D 表示オプションを選択クリックします。サーフェスの作成ウィザードを続行する (白い三角形の付いた青い円)、次のボタンをクリックします。</li>
		<li>表面再構成のための画像チャネルを選択します。</li>
		<li>多孔性の表面を避けるために平滑化関数を適用します。<ol>
<li>表面の詳細を隠していないが、多孔性の表面を回避するスムージングの値を選択します。</li>
		</ol>
</li>
		<li>表面を見つけようしきい値選定法を選択します。<ol>
<li>オブジェクトを背景から十分に分離し、およそ均一の明るさレベルを持っている場合は、絶対強度しきい値を使用します。</li>
			<li>オブジェクトはその強度は異なりますが、まだローカルの背景から、それらを取り巻く他のオブジェクトから分離できる場合は、ローカル コントラストを適用されます。再建されたオブジェクトの期待される直径の値に従ってローカルしきい値検索領域を設定します。</li>
		</ol>
</li>
		<li>関心、ボリュームなど、真球度、表面・体積比などの形態学的パラメーターに従って再建された表面にフィルターを適用し、表面再構成を終了します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>保存し、次のステップで使用される 3 D アニメーション ソフトウェアと互換性のある形式で生成されたサーフェスをエクスポートします。</li>
</ol>3. 変換 3 D 2D プロジェクションにサーフェスを再構築
<ol><li>ミキサーを起動し、右側のウィンドウで、[出力] タブに移動します。ドロップ ダウン メニューから TIFF 形式を選択し、色深度を 8 ビット RGBA に設定します。</li>
	<li>スクリプト モードに切り替わり、この作品 (https://github.com/zcseresn/ShapeAnalysis) で提供されるリポジトリから提供されているスクリプト ファイル"GUI_AutoRotate.py"を開きます。</li>
	<li>スクリプトを実行するをクリックします。入力を求められたら wrl ファイルのフォルダーを選択します。</li>
	<li>必要な場合より複雑なサーフェスを使用するときより多くの回転を作成: GUIに移動し、回転ボックス 6 を超える値に設定します。 注: 6 さまざまな角度の回転は、異なる細胞集団を区別するために十分なすることができます。潜在的な情報損失のため表面あたり六つ以下の回転を作成することはお勧めしません。</li>
	<li>スクリプトを実行するには、GUI の回転ボタンをクリックします。個々 のサーフェスの投影を入力フォルダー (手順 2.3) として使用された同じフォルダーに保存します。既定では、画像は 8 ビット Tiff で保存されます。 書式設定 (手順 2.1 参照)、フィジー プラグイン日陰で必要な形式であります。</li>
</ol>4. 周囲を見つけるし、フィジーを使用してフーリエを求めよ。
<ol><li>フィジーを開き、プラグイン メニューでシェードを選択します。既定値を持つを開始し、後にパラメーターを微調整します。[Ok]プログラムを実行する準備ができたらクリックします。<ol>
<li>入力画像の閾値のグラデーションのしきい値を選択します。</li>
		<li>反復計算の回数を選択します。イテレーションの数の値を大きくより正確な周囲の再建。単純な形状より低い数で通常十分です。</li>
		<li>膨張数パラメーターを使用して、決定どのくらい大きい開始のマスクは、実際のセルと比較されます。通常より複雑な図形は、適切な周囲を見つけるのための拡張手順を必要があります。</li>
		<li>投影図形がバック グラウンドよりも明るい場合、暗い背景をチェックします。</li>
		<li>日陰のパフォーマンスを確認する小テスト データセットを使用する場合のみ、中間結果の表示]チェック ボックスを有効にします。大きなデータセットに対してこのオプションをアクティブにする計算の効率を下げるし、ビデオ メモリの少ないシステムを停止できる可能性があります。</li>
		<li>ステップ 5 で入力として日陰の結果を使用するには、[結果テーブルを保存] チェック ボックスをオンに。このオプションをオンにすると、すべての結果が個々 の csv ファイルで保存されます。出力データの要約は、常に"Result_collection_of_all_DFT_calculations.csv"というファイルに生成されます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>手順 3 で作成された TIFF ファイルを含む入力データ フォルダーを選択します。</li>
	<li>出力データのフォルダーを提供します。</li>
	<li>プラグインを起動する[ok]をクリックします。</li>
</ol>5 自己組織化マップ
注: SOM ネットワークでは、彼らはすべての予想される細胞の種類や条件からの入力が含まれている大規模なデータセットに訓練されるときデータを分類するだけです。デモンストレーションの目的についてこのようなデータセットが提供され、リポジトリ ("AllCells_summary_normalised.csv"https://github.com/zcseresn/ShapeAnalysis からで見つけることができます。
<ol><li>訓練された SOM がない場合これらのガイドラインに従ってください、まだ入力データそれ以外の場合 5.2 の手順に進みます。<ol>
<li>ニューラル ネットワークの分類を行うことができる計算の数学ソフトウェアを起動します。</li>
		<li>SOM ネットワークを訓練するために使用するデータ ファイルを選択します。このデータセットは、すべての特定のセルタイプに SOM を訓練するために実験条件、実験条件を含める必要があります。 注: システムをテストするため提供されている AllCells_summary_normalised.csv を使用することが可能ですも。</li>
		<li>トレーニングを開始し、続行する前に、トレーニングを完了するまで待ちます。既定では、スクリプトは 2000 のイテレーション (「エポック」) の実行に設定されます。 注: 反復回数 SOM の学習速度によって異なります入力データに応じてそれは新紀元の上位と下位の両方の数をテスト SOM のパターンの安定性を確認することをお勧め用意されているスクリプトを使用している場合は、ライン 32 の下で反復計算の回数を変更できます。(既定では 12 を 12 に設定すると) 34 行ネットワークのサイズを変更できます。</li>
		<li>トレーニングを終了すると、ネットワークのトポロジ(隣人の距離、入力面、サンプル ヒット等)を調べる。ネットワークは、今訓練されており、将来使用するため保存することができます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>データセットをクラスター化するに (これは、ステップ 5.1 または他のソースから来ることができる) すでに訓練されたマップを使用する場合、SOM のロードします。<ol>
<li>プリロードされた訓練された SOM を使用してテストは、csv ファイルをインポートします。日陰プラグインが作成したデータを使用する場合、手順 4 から陰プラグインの csv 出力を選択します。 注: それはまた github経由で提供されるサンプル データ ファイル"InteractingCells_summary_normalised.csv"、"MobileCells_summary_normalised.csv"または"PhagocytosingCells_summary_normalised.csv"を使用することが可能。</li>
		<li>分類が終了した後は、手順 5.1.5 と SOM の結果を評価します。<ol>
<li>Csv ファイルから生成されたを確認します。各マップのセル表示回数データセット「ヒット」訓練された SOM の特定のセルこのマップの小さな領域では、セルのグループがクラスター化されて、これはデータセットが均質であることを示します。サブグループの可能性が高いがデータセット内に存在する複数のクラスターを示します。</li>
			<li>近所の体重の距離を調べます。よく分かれているこのマップのエリアは、非常に別様に SOM の観点からオブジェクトのグループに対応しています。DFT コンポーネントを入力データとして、これは対応する 3 D 表面の非常に異なる形状があるこれらの細胞集団を意味します。</li>
			<li>特徴ベクトルの各要素の貢献について重量面を確認します。前述のように 20 の DFT コンポーネントを使用する場合 19 マップがここに表示されます。提供例のデータセットを使用して、最初の 5 または 6 の重量面は別になりますが、それらの残りの部分はかなりに似て表示されます。この場合約 7 DFT コンポーネントを使用するのに十分にあろうと判断できます。</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Masedunskas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+microscopy%3A+a+practical+guide+on+imaging+intracellular+structures+in+live+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Bioarchitecture%22%5BJournal%5D)">Intravital microscopy: a practical guide on imaging intracellular structures in live animals.</a> Bioarchitecture. 2 (5), 143-157 (2012).</li>
<li>Niesner, R. A., Hauser, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+dynamic+intravital+multi-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Recent advances in dynamic intravital multi-photon microscopy.</a> Cytometry A. 79 (10), 789-798 (2011).</li>
<li>Ho, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NeurphologyJ%3A+an+automatic+neuronal+morphology+quantification+method+and+its+application+in+pharmacological+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">NeurphologyJ: an automatic neuronal morphology quantification method and its application in pharmacological discovery.</a> BMC Bioinformatics. 12, 230(2011).</li>
<li>Yin, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+screen+for+morphological+complexity+identifies+regulators+of+switch-like+transitions+between+discrete+cell+shapes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A screen for morphological complexity identifies regulators of switch-like transitions between discrete cell shapes.</a> Nature Cell Biology. 15 (7), 860(2013).</li>
<li>Yu, H. Y., Lim, K. P., Xiong, S. J., Tan, L. P., Shim, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+Morphometric+Analysis+in+Cellular+Behaviors%3A+Shape+and+Size+Matter%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Healthcare+Materials%22%5BJournal%5D)">Functional Morphometric Analysis in Cellular Behaviors: Shape and Size Matter.</a> Advanced Healthcare Materials. 2 (9), (2013).</li>
<li>Johnson, G. R., Buck, T. E., Sullivan, D. P., Rohde, G. K., Murphy, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Joint+modeling+of+cell+and+nuclear+shape+variation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Joint modeling of cell and nuclear shape variation.</a> Molecular Biology of the Cell. 26 (22), 4046-4056 (2015).</li>
<li>Wang, S. -H., Cheng, H., Phillips, P., Zhang, Y. -D. <a target="_blank" href="http://www.mdpi.com/1099-4300/20/4/254">Multiple Sclerosis Identification Based on Fractional Fourier Entropy and a Modified Jaya Algorithm.</a> Entropy. 20 (4), 254(2018).</li>
<li>Kriegel, F. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+shape+characterization+and+classification+with+discrete+Fourier+transforms+and+self-organizing+maps%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">Cell shape characterization and classification with discrete Fourier transforms and self-organizing maps.</a> Cytometry Part A. 93 (3), 323-333 (2017).</li>
<li>Styner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Framework+for+the+Statistical+Shape+Analysis+of+Brain+Structures+using+SPHARM-PDM%5BTitle%5D)+AND+%22Insight+Journal%22%5BJournal%5D)">Framework for the Statistical Shape Analysis of Brain Structures using SPHARM-PDM.</a> Insight Journal. (1071), 242-250 (2006).</li>
<li>El-Baz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+shape+analysis+for+early+diagnosis+of+malignant+lung+nodules%5BTitle%5D)+AND+%22Medical+Image+Computing+and+Computer+Assisted+Intervention%22%5BJournal%5D)">3D shape analysis for early diagnosis of malignant lung nodules.</a> Medical Image Computing and Computer Assisted Intervention. 14 (Pt 3), 175-182 (2011).</li>
<li>Williams, E. L., El-Baz, A., Nitzken, M., Switala, A. E., Casanova, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spherical+harmonic+analysis+of+cortical+complexity+in+autism+and+dyslexia%5BTitle%5D)+AND+%22Translational+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Spherical harmonic analysis of cortical complexity in autism and dyslexia.</a> Translational Neuroscience. 3 (1), 36-40 (2012).</li>
<li>Kruggel, F. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1361841507001107">Robust parametrization of brain surface meshes.</a> Medical Image Analysis. 12 (3), 291-299 (2008).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Kohonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Essentials+of+the+self-organizing+map%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Networks%22%5BJournal%5D)">Essentials of the self-organizing map.</a> Neural Networks. 37, 52-65 (2013).</li>
<li>Andrey, P., Boudier, T. <a target="_blank" href="https://pdfs.semanticscholar.org/4b2d/57e828777e7f5578b1192fd804890f9a464f.pdf">Adaptive Active Contours.</a> ImageJ user and developer conference. , Luxembourg. (2006).</li>
<li>Burger, W., Burge, M. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBurger%2C+W+%22Principles+of+Digital+Image+Processing%22">Principles of Digital Image Processing</a>. , Springer-Verlag. (2013).</li>
<li>Lestrel, P. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLestrel%2C+PE+%22Fourier+Descriptors+and+their+Applications+in+Biology%22">Fourier Descriptors and their Applications in Biology</a>. , Cambridge University Press. (2008).</li>
<li>Bayerl, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time+lapse+in+vivo+microscopy+reveals+distinct+dynamics+of+microglia-tumor+environment+interactions-a+new+role+for+the+tumor+perivascular+space+as+highway+for+trafficking+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Time lapse in vivo microscopy reveals distinct dynamics of microglia-tumor environment interactions-a new role for the tumor perivascular space as highway for trafficking microglia.</a> Glia. 64 (7), 1210-1226 (2016).</li>
</ol>

著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。

そのまま、小さな組織サンプルを使用して潜在的病態の識別は、重要度が高いのです。このようなテクニックは、感染症やがんの積極的な種類に対して適時に応答を保証します。様々 な免疫細胞、ミクログリアなどマクロファージ、速度論的および形態学的応答は、体の免疫応答の特徴です。ほとんどの場合それは実用的またはこれらの細胞の運動動作を監視することも可能ではない、その形状を取得するために 3 次元画像を取得する非常に簡単です。通常、免疫細胞は、健康な組織や炎症やがんの条件18の下ではるかに簡単なフォームの複雑な形状を想定します。免疫反応の開発を理解するためこのような形状の変化の時間依存特性が追加したい、しながら細胞の代表的なグループの 3 D 図形だけを使用することができます健康や病理学的性質を決定するための十分です組織。
細胞の 3次元表面の特性は、単純なタスクではありません。球面調和関数のアプリケーションは、コンポーネント11,12の比較的大きい数 (50-70) と 3D サーフェスを表現する方法です。さらに、球面調和関数の決定は負荷がかかるです。単位球に非常に複雑な形状を投影は不可能または単位球; 様々 な繊度の複数のグリッドを適用する必要があるのため非常に困難最後に、球状の高調波成分のスペクトルの意味は、些細なところです。
我々 の仕事は、ここで紹介、病的な状態を識別するために十分な形態学的情報を得るために元のサーフェスの投影を使用しての多くの単純な方法で直接 3 D 表面分析の困難な作業を置き換えます。骨髄細胞から 3次元顕微鏡データを使用して、このワークフローのすべてのステップを行った、すべての手順が完了するために単純なことを明確に指摘しながら、結果の 2次元地図がわかりやすかった。
当然のことながら、3 D ・ 2 D 投影は、表面の構造に関する情報の損失に します。皮質腫瘍マウスモデルにおけるミクログリアの私たちの例のデータセット、2 D プロジェクションを作成するときに 6 個の角度を使用するのに十分だった。ただしより複雑な図形、またはより少なく顕著な形態的変化が必要突起の大きい数が確実に SOM を持つ細胞のサブグループを識別することができるように作成されています。この理由から、我々 のアプローチを生成し、任意の数の予測を分析できるように設計されています。単純に高いより複雑な図形の投影数を選択して許容最小値情報の損失を拡大することが可能です。例として図 4 aおよび4 bの相互作用細胞型は複雑なサーフェスを正しく表現するために大きい投影数を必要があります。
任意の近似解法としてここ提案ワークフローいたミクログリア18手動分類プロセスの結果を比較します。前に示した結果は、自動化されたワークフローの信頼性を確認します。さらに、ワークフローは、従来の解析と比較して効率的なより多くの時間です。ミクログリア細胞を手動で分類される医療の専門家は、私たちのワークフローに必要なたった 1 日に対し、データセットの彼の分析のため約 4 週間を必要です。我々 のアプローチの堅牢性も明確に、同じセルの種類に属したが、SOM、図 3 cに示すように訓練されていないデータのサブセットに訓練された SOM の再現性によって証明されました。
にもかかわらず、我々 のアプローチは、運動情報を考慮していない、DFT に基づく形状解析に関するタイミングの効果を検討しました。時間依存現象の最も典型的な例は、高いインデックス DFT コンポーネントからの貢献が明確に観測される、図 4 aのようにモバイル セル人口の中で発見されました。これは非常に時間に依存した方法で動作する可能性のある種類の細胞を扱うとき DFT コンポーネントの十分に高い数を活用の重要性に注意を喚起します。自動化という性質など弊社のソフトウェア ツールの高い実行速度により DFT コンポーネントと予測数の増加増える精度と、結果の信頼性彼らはかなり計算のパフォーマンスを妨げるがないながら。

生体組織の病理学的状態の迅速, 簡便かつ高感度定量は、生物医学研究へ関心が高いのです。マウス モデルは、免疫反応や複雑な 3 D および 4 D (3 次元空間と時間) 顕微鏡技術との組み合わせでガンなどの病態の範囲を研究するための手段を提供します。顕微鏡を用いた研究ができます実行を介して生体または切除組織 2 光子励起顕微鏡、光シート顕微鏡と - 約 100 μ m の-共焦点顕微鏡による限られた組織の深さに。時間関連について生理学的または病理学的状況下で細胞の動作するには、通常生体イメージング1,2を必要とする時間の長時間にわたって組織を監視する必要があります。.当然、この手法の適用性は、その侵襲性のための動物モデルに限定されます。非侵襲断層レントゲン写真撮影方法 (MSOT、CT、等) の様々 なを含む人間用もありますが、これらのメソッドはすべて必要な空間 - と多くの場合一時的な細胞レベルでの挙動を調べるため解像度を欠いています。
セルの外観に関する静的な情報をより簡単にアクセス可能性があります経由で実行するイメージング技術の様々 な 3 D 組織サンプルを摘出しました。ここでは、セルの運動挙動は測定されていない、従って彼らの形態3のみに基づいて検査された細胞の病原性の状態を確認することができる新しい解析技術を採用する必要があります。このようなアプローチは、病理学的挙動4,5,6セル図形と組織のテクスチャをリンクに使用されました。
ここで説明した新しい手法で 3 D サーフェスとしてセルを再構成し、その図形は、3 D ・ 2 D 投影によって特徴づけられる連続フーリエ ベースの外周形状分析7,8。寸法を 3 から 2 に削減、によって問題が簡素化されます。また、医療画像9の行われている球面調和解析を適用することで 3 D のセル表面を特徴付けることが可能です。しかし、球面調和関数処理しないシャープで頑丈な図形も、単位球上確立するマルチ スケール グリッドを必要とします。球面調和関数の必要なコンポーネントの数が非常に大きい (50-70)、基になる計算をすることができますさらに、要求および結果の10、11,12を解釈するは難しい。
新しく提案する手法、タスクは、一連の 2 次元図形については、2 D 投影数がアナリスト次第ですし、3 D 形状の複雑さに応じて調整することができますに低減されます。予測が自動的に生成されます経由で3 D アニメーション ツールを実行する Python スクリプト。2D プロジェクションが提供されているフィジー13プラグインによって計算されます、その周辺部の離散フーリエ変換 (DFT) コンポーネントによって記述されるここに私たちのソフトウェア パッケージの一部として。DFT は、sin および cos 関数のシリーズにセルの複雑なアウトラインを分解するためにここに適用されます。この方法では、我々 は (さらに詳細を参照方程式) のための問題の複雑さを減らす DFT コンポーネントの比較的小さい数の概要を記述できます。DFT のコンポーネントは、クラスターが客観的にすることができます形の存在が8をテスト訓練された自己組織化マップ (SOM14) に配置されます。Som は、人工知能の分野からの競争力と教師なし学習ツールを提供します。彼らは、経由で加重近所の距離関数同士の人工ニューロン リンクされた配列で構成されます。入力データセットの最初の要素に応答する神経系とニューロン応答は最強がお互いに近い「グループ」。神経系より多くの入力を受け取る繰り返し強く応答データ ニューロンはシステム内で定義されているクラスターの形成を開始します。DFT コンポーネントのセットの形式で 2 次元図形情報を含む大規模なデータセットの適切な訓練の後、任意の個々 のセルの DFT コンポーネントは訓練された SOM に置くことができるし、可能性のセルが健康または病原性細胞のグループに属しているかどうかを明らかにします。科学的・臨床的診断の方法へのすばらしい追加になるようなツールを見込んでいます。

<table><tbody><tr><td>Imaris 9.1.2、ソフトウェア</td><td>ビットプレーン、Z&uuml;rich, Switzerland</td><td>v.9.1.2</td><td>3D画像の再構築とサーフェス生成; これは私たちが使用しました!</td></tr><tr><td>Blender 2.75a、ソフトウェア</td><td></td> <td>https://www.blender.org/ v.2.75a</td><td>3D および 4D オープンソース アニメーション ソフトウェア; 2.75a は、この Python</td></tr><tr><td>Fiji /ImageJ、ソフトウェア</td><td>https://fiji.sc/</td> <td>ImageJ v.1.52b</td><td>オープンソースのマルチ D 画像解析ツールキット</td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks、www.mathworks.com</td><td>R2017b</td><td>一般的な計算数学ソフトウェア</td></tr><tr><td>MATLAB Machine学習キット</td><td>MathWorks, www.mathworks.com</td><td>R2017b</td> MATLAB Fiji プラグイン<td>と併用のみ</td></tr>可能 <tr><td>SHADE</td><td>https://github.com/zcseresn/ShapeAnalysis</td><td>v.1.0</td><td></td></tr><tr><td>Fiji プラグイン: ActiveContour</td><td>http://imagejdocu.tudor.lu/doku.php? id=plugin:segmentation:active_contour:start</td><td>absnake2</td><td></td></tr><tr><td>Computer</td><td>Any</td><td>NA</td><td>コンピュータの最小要件については、Imarisの指示を参照してください</td></tr></tbody></table>

健康と病理の間の区別の形態に基づく細胞利用のフーリエ変換と自己組織化マップ

Morphology-Based Distinction Between Healthy and Pathological Cells Utilizing Fourier Transforms and Self-Organizing Maps

外観は、免疫細胞の動きは、彼らの環境によって駆動されます。病原体の侵入への反作用、免疫細胞は炎症のサイトに募集が、侵略のそれ以上の広がりを防ぐために活性化します。これはまた動作と免疫細胞の形態の変化によって反映されます。癌組織における同様の morphokinetic 変更は、ミクログリア細胞の挙動の観察されている: 内腫瘍ミクログリア細胞プロセスより少なく分岐を持つより複雑なの 3 次元形状と健康のそれらより急速に移動組織。そのような morphokinetic 特性の検討では、複雑な 3 D 顕微鏡技術を縦方向に実行される非常にやりがいのあることができる必要があります。したがって、セルの静的 3次元形状の記録ははるかに簡単なのでこれは生体計測を必要としないし、摘出組織と同様に実行することができます。ただし、3次元形状の高速で正確な記述ができる分析ツールを持つことが不可欠ですし、静的な図形に関連情報のみに基づいて健康と病原性の組織標本の診断分類をことができます。離散フーリエ成分を分析するツールキットを提案するここでは、3 D の投影一連のアウトラインのセル表面自己組織化マップによる。人工知能の手法の応用により様々 なセル形状についてはワークフローを単純なままにしながらより多くの組織サンプルに適用する体制。

我々 は細胞突起に対応する形の主要なコンポーネントを計算する DFT を適用されます。フーリエ記述子は、DFT アルゴリズムを私たちのワークフローの AbSnake 部分の出力として得られる細胞突起の合われた周囲の xy 座標のペアに適用することによって得られました。これらの xycoordinate のペアは、複素 2次元ベクトル"g"として処理できます。 <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/58543/58543eq1.jpg">
"G"のベクトルから複素フーリエ スペクトルを計算するのに DFT を使用します。 <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/58543/58543eq2.jpg"> 離散フーリエ スペクトルととして"g"のラベルを複素数を使用してよく知られている数式に基づきます。 <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/58543/58543eq3.jpg"> 我々 は得る。 <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/58543/58543eq4.jpg">(1) リアル ("A") との架空の ("B") コンポーネントを計算できます<img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/58543/58543eq5.jpg">: <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/58543/58543eq6.jpg">(2) <img alt="Equation 7" src="/files/ftp_upload/58543/58543eq7.jpg">(3) ここでは、最初の DFT コンポーネント G0が m に対応 = 0 を与える。 <img alt="Equation 8" src="/files/ftp_upload/58543/58543eq8.jpg">(4) <img alt="Equation 9" src="/files/ftp_upload/58543/58543eq9.jpg">(5) その結果、このコンポーネントは、元のオブジェクトの幾何学的な中心をについて説明します。 DFT 前方スペクトル、G1、2 番目の要素は、m = 1。 <img alt="Equation 10" src="/files/ftp_upload/58543/58543eq10.jpg"> <img alt="Equation 11" src="/files/ftp_upload/58543/58543eq11.jpg">(6)
式 6 からこれらのポイントの半径の円を形成すると考えられた<img alt="Equation 12" src="/files/ftp_upload/58543/58543eq12.jpg">開始角度と<img alt="Equation 13" src="/files/ftp_upload/58543/58543eq13.jpg">は、一度図形をトレースしながら円が 1 つの完全な革命を説明。円の中心は原点 (0, 0) にある、半径は |G1|開始点です。
<img alt="Equation 14" src="/files/ftp_upload/58543/58543eq14.jpg"><img alt="Equation 15" src="/files/ftp_upload/58543/58543eq15.jpg">(7)
一般に、単一のフーリエ係数の<img alt="Equation 16" src="/files/ftp_upload/58543/58543eq16.jpg">、座標として記述されています。
<img alt="Equation 17" src="/files/ftp_upload/58543/58543eq17.jpg"> <img alt="Equation 18" src="/files/ftp_upload/58543/58543eq18.jpg">(8)
同様に、式 6 Eq.8 もについて説明します、円が半径 Rm= |Gm|、開始角度<img alt="Equation 19" src="/files/ftp_upload/58543/58543eq19.jpg">と出発点で<img alt="Equation 20" src="/files/ftp_upload/58543/58543eq20.jpg">、円を通る"m"による軌道16,17ながら輪郭は一度トレースします。
SOM の入力として形状パラメーター ワークフローで、図 1で説明したよう、逆算 (使用測定点広がり関数) につけた皮質健康や癌の形態的変化を特徴付けるミクログリア細胞の生体多光子顕微鏡データセット組織18。再建された 3D サーフェスの各 2 D 投影用 20 DFT コンポーネントを求めたし、SOM のトレーニングの結果が入力として使用されました。生理的条件下で、ミクログリアはむしろ複雑な形状を提示、複数の高度分岐プロセス (図 2 a)。癌の環境 (皮質腫瘍モデル)、(図 2 b) のより簡単なよりスピンドルのような図形に変更マイクログリアに置かれました。
訓練された SOM は、健康と癌細胞を区別する能力を評価するためにテストされました。健康な細胞の人口は、SOM (図 2 c) の単一の領域に映し出されました。SOM は、ダンベル型のアクティブな領域 (図 2 d) と癌ミクログリア データセットに対応。DFT 形状部品を健康と癌のグループから成っていた盲目的に混合入力データ セットは、2 つのグループに SOM で投影された分離グループ (のものと同様、個々 の輪郭の形状を維持しながら図 2e;2 cと2 dと比較)。混合のデータセットが SOM によって正常にクラスター化されているといえる
我々 は時空の動作に基づいてデータセットを分類医療専門家による同じデータの手動解析とその予測を比較することで SOM のパフォーマンスをテストしました。専門家を特定細胞の 4 つのグループ (静止期細胞、phagocytosing セル、相互作用する細胞とモバイル セル18) 再建され、12 x 12 のトレーニングに使用する SOM.訓練されたネットワーク (図 3 a) 特に左下と SOM の中間領域で高ヒット値人工ニューロンのグループを示しています。訓練を受けたネットワークの応答 4 つランダムに選択されたサブセット (トレーニング データセットの一部であった) 専門家18によって識別される 4 つのグループからの画像でテストされました。これらのイメージのサブセットは、図 3bに示すように、SOM によって 4 つの明確に定義された応答で起因しました。静止期細胞は、最も複雑な形状を展示し、ニューラル ネットワーク (図 3 b 「休息」パネル) 内で最も高い分離レベルを示した。他の 3 つの識別された細胞型は左下のコーナーで SOM の共通の領域を共有が、SOM によって分離されたそれ以外の場合左下のコーナー ソム エリアはこうして DFT の低いインデックス値に対応します。
アプローチの堅牢性は、3 つの訓練を受けた SOM を使用してテストされた - 休憩 - 同じのランダムなサブセットの細胞型 (トレーニング データセットの一部ではない)。SOM のこの入力に対する応答 (図 3 c, 1-3 のサブセット)、非常に同じような応答を展示提案手法のロバスト性を示します。
時間依存性細胞形状の変化が正確に DFT によって特徴づけられる DFT コンポーネントに及ぼすセル形状の経時変化を調べるためにサブグループごとに 1 〜 3 セル 13、28 の時点で追跡 (図 3b参照)。図 4は、最初の 10 の DFT 時間の関数としてプロットされた携帯電話基地 (図 4 a) と相互作用する細胞 (図 4 b) のコンポーネントを示します。携帯電話基地の展示粗い DFT 表面によって反映される永久に変更する形 ( 8で補助ビデオ 4 を参照)。最初から 3 番目相互作用細胞の時間経過の DFT 振幅のバースト補助ビデオ 5 に8のように高速かつ広大なセル形状変化と一致します。
19 DFT コンポーネントすべての時間のコースのまた特徴付けられる 3 つの独立した時点でこれらの 2 つのセルの携帯電話基地 (図 5 a) と相互作用する細胞 (図 5 b) の追跡中に。垂直軸はここ 6 回転角度を表す、すべての投影が両方の細胞の種類の図形の特性も同様に重要であることを示します。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58543/58543fig1.jpg"> 図 1。細胞の形に基づいて、セルのクラスターを識別するためにデータ処理のワークフロー ステップで。表面 3 D で再構築は、自動 3 D ・ 2 D 射影用ミキサーへの入力として使用されました。それぞれの投影の周囲に位置していたし、DFT コンポーネントを求めた。コンポーネントは、入力として提供しています Matlab または新しい SOM. を訓練する訓練された SOM のいずれか<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58543/58543fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58543/58543fig2.jpg"> 図 2。マウス大脳皮質ミクログリア細胞制御条件の下で (a) と癌組織 (b) での典型的な外観再建ミクログリア表面のスクリーン ショット。マウス大脳皮質からのミクログリアのサンプルの 3 つのグループから作成された SOM の予測: (腫瘤) 細胞 (c)、(d)、腫瘍細胞とセル (e) の混合された人口を制御します。この図は、アクセス許可8に変更されています。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58543/58543fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58543/58543fig3.jpg"> 図 3.(左)768 の入力特徴ベクトルから成るマウスのミクログリア データセットの自己組織化マップ。データセットは、12 x 12 の人工ニューラル ネットワーク、六角近所ジオメトリ、ランダムな初期化および 2000 のエポックを使用してのトレーニングに使用されました。(右)対応する SOM は、最初 10 DFT コンポーネント (b) の平面に描かれている SOM の応答を入力、(、)、1 つランダム VRML ファイルのサブセットにそれぞれ「モバイル」「相互作用」、「休息」と「食」の最初に記載されている図 5の 4 つのセル型からBayerlら18. 同じ SOM の (c) 応答 (左) のように「静止期細胞」の、データセット全体するではこのようにトレーニング データセットの一部) の 3 つのランダムなサブセットに-3D サーフェスを入力。3 つの応答の間で類似性は注目に値するです。この図は、アクセス許可8に変更されています。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58543/58543fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58543/58543fig4.jpg"> 図 4 。(マウスのミクログリアの生体イメージング実験中に最初 10 の DFT コンポーネントの a) の時間依存性このパネルには、「携帯電話セル」型のセルのデータが表示されます。X 軸対応 60 秒の時間分解能で実験の時間ポイントに y 軸は任意の単位 (a.u.) で DFT 成分の振幅を示します、z 軸が 1 から 10 まで DFT のコンポーネントに対応します。(b) (a) が「相互作用細胞」細胞ように入力します。この図は、アクセス許可8に変更されています。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58543/58543fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58543/58543fig5.jpg"> 図 5 。(a) 冒頭に、途中で、実験の終わりに「携帯電話セル」型のセルのすべての 19 DFT コンポーネントの動作です。X 軸上の数字は、1 から 19 まで DFT コンポーネント ID に対応します。Y 軸は、任意の単位 (a.u.)、DFT コンポーネント振幅しながら z-軸マーク 6 のランダムな回転角度。(b) (a) が「相互作用細胞」細胞ように同じタイプです。この図は、アクセス許可8に変更されています。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58543/58543fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

ここで、彼らの 3 次元形状に基づく健康と病理組織学的細胞の同定を可能にするワークフローを提供します。我々 は, 細胞集団の客観的クラスタ リングを提供する自己組織化マップを訓練する 3D サーフェスに基づいて 2D 投影アウトラインを使用してのプロセスを説明します。

The appearance and the movements of immune cells are driven by their environment. As a reaction to a pathogen invasion, the immune cells are recruited to ...

この方法は、がん研究やがん治療などの基礎研究や臨床応用における重要な質問に答えるだけでなく、免疫学分野においても答えることができます。この方法の主な利点は、それが静的な方法であり、容易に容易になりやすいということです。この技術は、その形状および動き特性に基づいて、病気の細胞タイプを自動的に識別することができる。この技術の意味は、がんまたは炎症性疾患の診断と治療にまで及ぶ。この方法は、免疫細胞とがん細胞の間の行動に関する洞察を提供することができますが、3次元顕微鏡データが必要な分野でも適用できます。この方法に新しい個人は、3次元顕微鏡データを記述し、検証する問題のために苦労するかもしれません。この方法の視覚的なデモンストレーションは、ここで使用するソフトウェアツールが多くの科学者にとって馴染みがないため、非常に重要であると考えました。まず、付属のテキスト プロトコルで説明されているように、高解像度のデコンボルブ 3 次元顕微鏡データ セットを取得します。3D イメージ データを再構築ソフトウェアにロードし、各オブジェクトの 3D サーフェスの作成を開始します。これを行うには、[3D ビュー]オプションを選択して[サーフェス]をクリックし、[次へ]ボタンをクリックしてサーフェス作成ウィザードを続行します。次に、サーフェス再構成用のイメージ チャネルを選択します。サーフェスの詳細を隠さないだけでなく、多孔質サーフェスを回避するスムージング値を選択します。スムーズオプションチェックボックスをクリックし、スムージング半径を指定して、スムージング機能を適用します。顕微鏡データの3次元画像構造を作成する場合、細胞特性や形状を失わないように、平滑化係数と適切な閾値法に注意することが特に重要です。次に、サーフェスを検索するしきい値方法を選択します。ここに示すようなオブジェクトが背景から十分に分離され、ほぼ均一な輝度レベルを持つ場合は、絶対強度しきい値を使用します。オブジェクトの強度が変化するが、ローカル背景とそれらを取り巻く他のオブジェクトから引き離すことができる場合は、ローカルコントラストしきい値を適用します。再構築されたオブジェクトの予想直径の値に従って、ローカルしきい値検索領域を設定します。次に、目的の形態学的パラメータに従って再構成されたサーフェスをフィルタリングするオプションのリストから選択します。これには、体積、球面性、サーフェス対体積比などが含まれます。生成されたサーフェスを、次のステップで使用する 3D アニメーション ソフトウェアと互換性のある VRML などの形式で保存およびエクスポートします。Blender を起動し、ウィンドウの右側にある [出力] タブに移動します。ドロップダウンメニューから TIFF 形式を選択し、色深度を 8 ビット RGBA に設定します。次に、スクリプト モードに切り替え、指定されたスクリプト ファイルに移動しますタイトル:GUI_Autorotate。この作業の github リポジトリからダウンロードできます。メインウィンドウに戻り、[スクリプトの実行]をクリックし、入力を求められたら wrl ファイルのフォルダを選択します。次に、デフォルトメニューに移動します。ここでは、回転を 6 以上の値に設定します。[回転]ボタンをクリックしてスクリプトを実行します。通常、6つの異なる角度の回転で、異なる細胞集団を区別するのに十分ですが、形状や特性に関する情報を失わないように、6回転未満を使用することはお勧めしません。入力に使用されたのと同じフォルダに、個々のサーフェスの投影を保存します。デフォルトでは、画像は、フィジープラグイン、Shadeで必要な形式である8ビットのTIFF形式で保存されます。フィジーを開き、プラグインメニューで「シェード」を選択します。デフォルト値から始め、後でパラメーターを微調整します。プログラムを実行する準備ができたら、[問題ありません] をクリックします。次に、前のセクションで作成した TIFF ファイルを含むソース フォルダを選択し、[選択] をクリックします。次に、出力データ フォルダーを指定します。最初の画像が表示されたら、セルの周囲に四角形を描き、まず[OK]をクリックします。プラグインが実行されると、赤い線で示されるセルの周辺の画像の前処理が表示されます。見つかったエッジの座標が、離散フーリエ成分の計算に使用されるようになりました。初めて自己組織化マップをトレーニングするには、MATLAB をロードして開始します。TrainSOM MATLAP スクリプトを読み込み、実行を選択してトレーニングを開始します。必要に応じて、ファイルのパスを正しく指定してください。実行が開始されると、追加のウィンドウがポップアップして進行状況が表示されます。トレーニングが完了するまで待ってから、続行してください。既定では、スクリプトは 2,000 回の反復処理またはエピックを実行するように設定されています。トレーニングが終了したら、ネットワークのトポロジ プロットを調べます。次に、隣接距離プロット、サンプルヒットプロット、入力平面プロットの例を示します。自己組織化マップは、データセット内の隠れた関係を発見するための重要なツールです。データを客観的にクラスター化し、教師なしの学習を行うため、トレーニング データ セットは必要ないという利点があります。これでネットワークのトレーニングが行われます。ワークスペース内のファイルを右クリックし、後で使用するために保存します。既にトレーニング済みのマップを使用する場合に、データ セットをクラスター化するために、自己組織化マップを読み込みます。次に、事前にロードされたトレーニング済みマップを使用してテストする CSV ファイルをインポートします。ここでは、シェードプラグインのCSV出力を選択します。データが読み込まれたら、出力タイプを数値マトリックスに変更し、[選択をインポート]を選択します。分類が完了したら、コマンド ウィンドウを使用してさまざまなプロットを評価します。ここでの画像は、ミクログリア細胞のデコンボルブインビトニエンタルマルチフォトンミスクロシスコピーデータセットから来たものである。生理学的条件下では、ミクログリアは、複数の高度に分岐したプロセスを有するかなり複雑な形状を提示した。この皮質腫瘍モデルのような癌性環境に置くと、ミクログリアはより単純でスピンドル状の形状に変化した。これらのフォーニア型の徴兵コンポーネントのうち20個は、自己組織化マップを訓練するための入力として使用された。訓練された地図は、健康な細胞と癌細胞を区別する能力を評価するためにテストされました。健康な細胞集団は、ここで示す単一の領域に投影されたのに対し、癌性ミクログリアデータセットはダンベル型の活性領域として提示された。地図はまた、異なる細胞群を識別するために医療専門家によって訓練することができます。ここで、休止細胞、貪食細胞、相互作用細胞、および移動細胞を、同定、再構成、および12x12マップのトレーニングに使用した。この結合されたマップは、特にマップの左下と中央の領域で、ヒット値の大きい人工ニューロンのグループを示しています。マッピングアプローチの堅牢性は、トレーニングデータセットの一部ではない同じ静止セルタイプの3つのランダムなサブセットを持つ訓練された自己組織化マップを使用してテストされました。この入力に対するS.O.Mの応答は、正しいセルタイプを示す非常によく似た応答を示します。この技術の開発後、私たちは簡単に細胞の形状の変化を分類できるツールキットを持っています。これらの変化は、例えば癌中、または他の免疫系応答の間に起こり、顕微鏡検査、動物全体、切除された組織、あるいはチップ上の器官を使用してそれらを測定することができる。

morphology-based-distinction-between-healthy-pathological-cells

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