Name: ヒト大動脈血管周囲脂肪前駆細胞の分化能力 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 43 s
Description: 学ぶヒト大動脈血管周囲脂肪由来前駆細胞の分化能力と骨髄間葉系幹細胞の比較解析。脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞への多能性分化を実証し、心血管疾患における再生医療への応用可能性を示す。

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我々 は臨床組織・病理組織学的強度コア (1P20GM121301、l. 俊哉 PI がサポート) メイン医療研究センターの調達を支援するため研究ナビゲーション メイン メディカル センターでの支援を認める区分所染色.この作品は、NIH によって支えられた R01 HL141149 を付与 (L. 俊哉)。

本研究では人間のティッシュの使用は評価し、制度レビュー ボードのメイン州医療センターで、承認、全員が実験の前に適切な訓練を受けた。
1. 準備
<ol><li>解離のバッファーを作る 50 mg を再構成することによって無料の動物コラゲナーゼ/当期ブレンド私溶液 nanopure H2o ・準備 1 mg/mL 作業溶液 1 mL と高グルコース再構成コラゲナーゼに w/v 1 %bsa を含む DMEM の 49 mL を追加することによって/当期のソリューションです。-20 ° C から暖かいお風呂前の水を使用して、使用する 37 ° C で 5 mL 作業因数を格納します。</li>
	<li>HBSS、49 ml (最終濃度は 200 単位/ml ペニシリン、200 単位/ml ストレプトマイシンと 0.5 μ G/ml fungizone) 100 x 抗生物質/抗真菌溶液 1 mL を追加して抗生物質溶液を行い、氷の上を格納します。</li>
	<li>牛皮 nanopure H2o ・ オートクレーブ 20 分のためのソリューション 100 ml から 200 mg ゼラチンを溶解することによりゼラチン溶液 (0.2 %w/v) を準備し、4 ° C で保存</li>
	<li>PVAT 成長媒体の 500 mL を準備: グルタミン、ピルビン酸ナトリウム 10 %fbs と 100 μ g/mL 抗菌剤 (材料の表を参照) を添加した重炭酸ナトリウムと高グルコース DMEM/f12 キー。</li>
	<li>50 mL の脂肪分化誘導メディアの準備: 40.8 mL 高グルコース DMEM、7.5 mL PVAT 成長媒体、抗生物質/抗真菌ソリューション (最終濃度が 100 単位/ml ペニシリン、100 単位/ml ストレプトマイシン 0.25 μ G/ml fungizone) x 100 の 500 μ L を添加しました。0.5 mM IBMX (0.1 M NaOH で 500 mM の在庫)、1 μ M デキサメタゾン (エタノールでストック 1 mM)、5 μ M ロシグリタゾン (DMSO で 5 mM 在庫)、33 μ M ビオチン (DMSO の株式 66 mM)、100 nM インスリン (0.1% の酢酸で 200 μ M ストック)、20 μ M パントテン酸 (100 mM 入荷 H2O)。</li>
	<li>脂肪細胞系統の誘導メディア コントロールの 50 mL を準備: 40.8 mL 高グルコース 7.5 mL PVAT 成長媒体とペン-連鎖球菌 (100 x の在庫) を 500 μ l 添加 DMEM。</li>
	<li>50 mL 脂肪維持媒体の準備: 41.5 mL 高グルコース DMEM 添加成長メディア手順 1.3、500 μ L ペン連鎖球菌から PVAT 7.5 mL (100 x の在庫)、デキサメタゾン 1 μ M (1 mM 入荷 EtOH)、33 μ M ビオチン (DMSO で 66 mM 在庫)、100 nM インスリン (200 μ M 株式 0.1 %acエティック酸) と 20 μ M パントテン酸 (100 mM 入荷 H2O)。</li>
	<li>骨と軟骨の系統の成長媒体の 500 mL を準備: 10% を添加した高グルコース アルファ MEM FBS、1 x グルタミンのサプリメント (材料の表を参照) とペン-連鎖球菌 (100 x の在庫) の 5 mL。</li>
	<li>骨系統の誘導メディアの 50 mL を準備: 10 nM デキサメタゾン 10 mM β-グリセロリン酸と補われる骨髄 MSC 成長媒体の 50 mL。</li>
	<li>軟骨細胞系統の誘導メディアの 50 mL を準備: 骨髄 MSC 成長培地 100 nM デキサメタゾン、50 μ g/mL ナトリウム アスコルビン酸-2-リン酸、および 10 ng/mL TGFβ1 50 mL。骨と軟骨の条件の基底の骨髄 MSC 成長媒体は非誘導メディアとして機能します。</li>
</ol>2. プロトコル 1: 文化人間 PVAT 細胞間質血管の一部から
注:冠動脈バイパス移植手術を受ける麻酔下の患者の上行大動脈に人工血管吻合部から PVAT が切除されます。大動脈 PVAT は、15 mL 円錐含む 10 mL の氷冷高グルコース DMEM F12 でされ、切除の 2 時間以内に検査室に手術室から転送です。大動脈 PVAT はバイパス プロシージャの間に破棄された組織をメイン メディカル センターの内部審査委員会ヒト以外の科目研究としてと判断されています。
<ol><li>このプロトコルは、人間 PVAT (約 0.5 cm3x 1 x 3) の ~ 500 mg 作品です。25 mL 抗生物質溶液 50 mL の円錐管に DMEM から新鮮な人間 PVAT を転送します。ロッキング 4 ° C で 20 分間インキュベートします。PVAT 抗生物質溶液の中、雪解け 37 ° C で解離バッファーの因数</li>
	<li>5 mL 解離バッファーに 100 x 抗生物質/抗真菌溶液 50 μ L を追加し、0.22 μ m シリンジ フィルターを使用して滅菌します。24 ウェル プレートの 1 にゼラチン溶液の 1 mL を追加します。層流フードは、滅菌ピンセットとはさみを使用して滅菌シャーレに抗生物質溶液から PVAT を転送します。組織に予め温めておいた解離バッファーの 1 つの mL を追加し、スラリー (作品は 〜 2 × 2 mm2を超える) に全体の組織を細かくミンチ滅菌鉗子と解剖はさみを使用しています。</li>
	<li>4 mL 解離バッファーに 1 mL スラリーを転送し、1 時間 200 rpm でシェーカーを軌道に予め温めておいた 37 ° C でその側にチューブを孵化させなさい。後 1 時間目に見える組織の部分は存在できず、ソリューションは、曇り細胞懸濁液として表示されます。</li>
	<li>50 mL コニカル チューブ上に設定 70 μ m 携帯こし器を通ってソリューションをフィルターします。可能な限り多くの細胞をキャプチャする追加 10 mL 抗生物質溶液でストレーナーをすすいでください。ストレーナーを押さないようにしてください。</li>
	<li>スイング バケツ遠心分離機で 300 x gで 12 分間細胞をペレットします。 注:遠心分離の後チューブは、脂肪細胞、中間期、ペレットの脂肪の最上位のレイヤーに分離されます。ペレットは、血管内皮細胞、免疫細胞、血液細胞、前駆細胞が含まれている間質血管の一部です。</li>
	<li>HBSS と 300 × gで 5 分間遠心分離機の 10 mL にペレットを再懸濁します。HBSS の 2 洗浄の合計のためには、この手順を繰り返します。最終的な洗浄の後、赤血球を溶解しません。いくつかの商業的に使用可能なバッファーとインキュベーション時間繰り返された試みは、前駆細胞の付着および生存率で大幅な節約につながっています。</li>
	<li>24 ウェル プレートからゼラチンを吸い出しなさい。非連結のゼラチンを削除する HBSS でよく 1 x は水洗い。</li>
	<li>成長媒体のゼラチン コーティング上にシード 1 mL でそのまま赤血球と間質ペレットを再懸濁しますも。25 ng/mL の培地での最終的な集中にヒト FGF2 (0.01% BSA w/v を添加した PBS で再停止される) を追加します。5% CO2と 37 ° C で 24 時間インキュベートします。</li>
	<li>次の日に削除成長の媒体および洗浄井戸 HBSS 赤い血液細胞と死んだ細胞を削除すると 5 倍の。25 ng/mL FGF2 と補われる新鮮な成長媒体の 1 mL を追加します。</li>
	<li>メディア 25 ng/mL で補うようにしてすべての 48 時間を変更して新鮮な FGF2 たびに。</li>
	<li>
電池が通常達する 100% 合流植; 後 7-10 日一節細胞、:
	<ol>
<li>成長のメディアと洗浄の単層 2 を吸引中、1 mL HBSS x。井戸からすべて HBSS を吸引し、細胞解離液を数滴を追加します。</li>
		<li>タップ プレートを数回旋回、5% CO2セルを解除する 5-7 分の 37 ° C で孵化させなさい。戸セルに新鮮な培地の 〜 1 mL を追加し、24 ウェル プレート、各含んでいる 500 μ L の成長媒体、25 の 2 の井戸を 500 μ L を配布 ng FGF2。</li>
	</ol>
</li>
	<li>前の手順で示されているように、ひと PVAT 由来細胞を拡大していきます。各通路を 1:2 分割以上にする必要があります。細胞は、分化アッセイを割り当てる前に 5 ~ 7 回継代が。</li>
</ol>3. プロトコル 2: 培養ひと骨髄 MSC コロニー
注:MSC の説明8として隔離され、として早期成立で株を凍結保存ひと骨髄液 N2中 〜 100,000 セル/mL でメディア (70% FBS 20% 基底 DMEM と 10 %dmso) で固定します。
<ol><li>急速に MSC 成長媒体の 3 mL を含む 6 ウェル培養プレートの 1 つの井戸を 37 ° C の水浴とプレートでリキッド N2から骨髄 MSC のバイアルを解凍し、37 ° C および 5% CO2で一晩インキュベートします。</li>
	<li>次の日、MSC 培地を吸引し、洗浄セル 3 HBSS の 2 mL で x。100% 合流、成長媒体を吸引し、洗浄セル 3 HBSS の 2 mL で x。500 μ L/ウェルの細胞剥離液を追加し、37 ° C、5% CO2分のすべてのセルを確認するプレートが外れている場合はタップで孵化させなさい 2 mL MSC 成長媒体を含む 6 ウェル プレートの 2 の井戸に内容を均等に分散します。</li>
	<li>ひと骨髄と並行して約 5-7 通路またはテストするための十分な量を達成するまで PVAT 由来 MSC を展開します。</li>
</ol>4. プロトコル 3: プレートし、脂肪細胞、骨、および軟骨細胞系統を誘発します。
<ol><li>骨髄とよく 12 ウェル プレートと適切なあたり PVAT 由来細胞の適切なナンバーは、実験条件ごとにレプリケートします。脂肪細胞や骨の条件、~ 200、000-225,000 細胞/ウェルは、条件に必要な軟骨、150,000-175,000 細胞/ウェルが必要があります。 注:N の最小値を実行制御用 3 複製井戸を = し、実行する独立した 2 の合計各実験の系列のための条件を誘発 (N = 6 レプリケート合計)。</li>
	<li>人間 PVAT 前駆細胞集団個別 15 mL コニカル バイアルに 5 分プール人口の 37 ° C、5% CO2で細胞剥離液と培養を用いたひと骨髄 MSC 人口から細胞の関連付けを解除します。ダウン 500 x g細胞のペレットを 7 分間でバイアルを回転します。1 mL の PBS に再懸濁します、診断を使用して、セル数を推定します。</li>
	<li>4.1 の手順で示されているように、12 ウェルの料理の細胞をプレートします。誘導と非誘導脂肪細胞、骨、および条件の別々 の皿を提供誘導条件の文化の継続を中断することがなく以前の時点で非誘発条件を修正できます。</li>
	<li>誘発条件の各ウェルに脂肪細胞と骨誘導メディアの 1.5 mL を追加します。非誘導条件の各ウェルに脂肪細胞や骨の非誘導メディアの 1.5 mL を追加します。脂肪細胞と 37 ° C、5% CO2で骨の誘導と非誘導の細胞集団による培養を開始します。</li>
	<li>スピン ・人間 PVAT 前駆細胞とひと骨髄 MSCs 500 x gで 7 分のための残りのボリューム ダウン。</li>
	<li>残りの骨髄と 100,000 セル/10 μ L (106セル/mL) の密度を達成するために PVAT 由来細胞ペレットを再懸濁しますに必要なボリュームを決定します。軟骨細胞系統の誘導の MSC 成長媒体の計算された容積でペレットを再懸濁します。優しく上下に均一な分布を確保するため、ピペットを使用してセルのボリュームに移動します。</li>
	<li>濃縮細胞液の 10 μ L の液滴のピペット、100,000 細胞存在しておりを形成する各井戸の中心に。蒸発を防ぐために隣接する井戸で 1 mL 滅菌 H2O を配置します。ように存在しており、CO2を 5% と 37 ° C で 2 時間存在しており文化をインキュベート集計します。</li>
	<li>2 時間後、慎重に追加軟骨分化メディア 10 ng/mL でスパイク誘発条件井戸の各に人間 TGFβ1。慎重に非誘発条件下の井戸に 1.5 mL の非誘導培 (骨髄 MSC 成長媒体) を追加します。誘導と非誘導条件の別 12 ウェル プレートを使用する非誘発条件は以前の時点で固定することができます。</li>
</ol>5. プロトコル 4: 文化脂肪、骨、軟骨細胞系統を 14 日間
<ol><li>37 ° C、5% CO2、さわやかなメディアごとに 2 日間で 4 日間のすべての 3 つの系統の誘導と非誘導条件の文化.4 日目、アッセイの残りの保守メディアに誘導メディアから誘導脂肪細胞系統条件を変更します。</li>
	<li>12 h. ホルマリン処分の 10% ホルマリンでのすべての非誘導条件を修正し、洗浄は、すべて固定井戸ホルマリンのすべてのトレースを削除する PBS で 2 倍。PBS で処理までの 4 ° C でプレートを格納します。</li>
	<li>更新メディアごとに 2 日間、14 日間の合計のための誘導条件の文化.10 ng/mL の最終的な集中更新するたびに軟骨細胞誘導メディアで新鮮な TGFβ1 を追加します。培養脂肪細胞系統で脂肪細胞維持媒体と骨系統誘導メディア、2 日おきの更新を続けます。14 日で 10% ホルマリンの汚損のための 12 時間すべて誘導条件を修正します。</li>
	<li>こすりまたは誘導軟骨状態で存在しており、注ぎ埋め込みカセット。ステータス退避をますます集中しているアルコール 70%、80%、95%、2 回と 2 回絶対アルコールで始まる 5 分風呂シリーズで存在しており。脱アルコール剤にカセットを配置し、最後にパラフィン切片の染色にカセットを埋め込みます。</li>
</ol>6. プロトコル 5: 染色油と脂肪分化状態赤 O
<ol><li>オイル赤 O 原液を準備するには、100% イソプロパノール 100 ml オイル赤 O の 350 mg を溶解します。0.2 μ m フィルターを介して攪拌棒と真空 2 h のミックスします。原液は、室温で暗闇の中で 1 年間保存できます。</li>
	<li>オイル赤 O 3 つの部分 (例えば 60 mL 原液 40 mL 式行先方向20 の) 2 つの部分式行先方向20 に原液を混合することによって作業ソリューションを準備します。使用液でオイル赤 O の最終濃度は 2.1 mg/mL です。</li>
	<li>井戸からすべての流体を削除します。完全に井戸の辺からすべての水を削除するを確かめて、60% イソプロパノールとも 2 x を洗浄します。60% イソプロパノールを吸引し、すぐに底をカバーする井戸の壁に触れることがなくオイル赤い O 作業ソリューションを追加します。井戸が乾燥しないように、この手順を迅速に行うことが重要です。</li>
	<li>オイル赤 O を追加すると、穏やかな揺動を室温で 10 分間インキュベートします。</li>
	<li>オイル赤 O のすべてを削除し、すぐに蒸留 H2o. 洗浄蒸留 H2O の非連結オイル赤い o. を削除するのには 10 m を追加10 分後オイル赤 O の吸引し、洗浄の手順 3 x。</li>
	<li>洗濯が完了する、PBS を追加し、セルをイメージします。染色細胞を PBS で 4 ° C で保存します。</li>
</ol>7. プロトコル 6: 染色アリザリン赤骨条件
<ol><li>各ウェルからすべての流体を削除します。各ウェル (12 ウェル プレートのウェルあたり 1.5 mL) を 2% アリザリン赤染色液の適切なボリュームを追加し、ソリューションは完全に井戸の底をカバーするまでプレートを左右を軽く傾けます。</li>
	<li>室温で 15 分間インキュベートします。井戸からアリザリン赤を削除します。優しく蒸留 H2O、ないカルシウムの結晶を取り除くため注意を取ってでも各 4 回を洗い流してください。乾燥することができます。</li>
</ol>8. プロトコル 7: 染色とマッソンの軟骨状態ヒアリン
<ol><li>
蒸留水に Deparaffinize とハイドレートのセクション 30 分の 60 ° C の乾燥炉内のスライドを焼きます。
	<ol>
<li>水分補給、脱アルコール剤、アルコール濃度を次のように降順で 5 分孵化後 3 5 分孵化にスライドを配置: 100% (無水エタノール) で 2 つ、95% アルコールで 2 つ、2 つで 80%、70% で 2 つ、最終的に 2 つに蒸留Bouin の定着剤は準備 H2H2O に残ります o. スライドします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bouin の定着剤 (発見) プラスチック製電子レンジ coplin jar の場所 40 mL。55 ° C に温度をもたらす高マイクロ波します。温水溶液中 20 分間; にスライドを配置します。カウンターに放置が覆われています。水道の流水で 10 分間、またはすべての黄色の色が消えるまで洗ってください。</li>
	<li>10 分の水道の流水で 10 分洗浄ダンピングを拒否のヘマトキシリンのセクションを染色します。</li>
	<li>10 分洗浄水道水の 3 × 10 分の Beibrich の緋酸フクシン溶液中のセクションを染色します。10 分間リンタングステン/リンモリブデン酸水溶液で媒染スライド。洗い流さないでください。</li>
	<li>10 分リンス水道水で 2 つの簡単なディップのアニリン ブルー溶液で直接スライドを配置します。</li>
	<li>ステップ 5.4 と合成樹脂マウントで示されているように、3 に 5 分洗浄 1 分 Dehydrate の 95% エタノールで 1 分の場所の水道水に 1% 酢酸溶液にスライドを配置します。</li>
</ol>

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別拠点から脂肪前駆細胞は、表現型と分化の潜在的な9が大きく異なります。3 つの異なる系統を同時誘導で単一の患者のドナーから PVAT 由来の前駆細胞を培養、脂肪細胞、骨、および軟骨、この小説の多能性容量の制御された調査可能します。前駆細胞の人口。人間 PVAT 由来の前駆細胞の分化能力をテストし、PVAT 病態と血管トーヌスの調節にその機能を理解する、このレポートで説明されている方法を使用できます。この手法のいくつかの利点は、そのシンプルさと冠動脈から主な人体への使用をバイパスする患者、重篤な心血管疾患患者から PVAT 前駆細胞機能の調査を可能にします。しかし、500 mg の組織片から植を通常もたらす < 1000 付着細胞し、こうしてこのアプローチの 1 つの重要な注意事項を強調表示、適切な番号を取得する 5-7 通路を必要とします。ドナー PVAT から初期細胞外植体の品質はトライ系統分化実験の成功にとって重要です。それは酵素分解の前に徹底的に組織を細かくミンチに不可欠です。さらに, 植の他のプロトコルとは異なり我々 は赤血球細胞の換散バッファーは、めっき前に使用されたとき細胞数、...

脂肪組織が豊富な万能幹細胞 (MSC) に分化骨、脂肪細胞と軟骨細胞系統1。この組織は、成熟脂肪細胞の肥大と脂肪細胞に常駐の MSC の de novo 分化を通じて展開します。血管周囲脂肪組織 (PVAT) は血管を囲むし、血管機能2,3を調節します。PVAT 肥満膨張は、心血管系の病態を悪化させます。人間の皮下脂肪のデポから MSC の多能性の可能性はよく勉強4,5をされている、どんな研究が仔あり、ために可能性が高い人間 PVAT 由来神経前駆細胞の分化能力を評価調達の侵襲。したがって、この作業の目的は、外植体し、心血管疾患を持つ患者から人間の大動脈 PVAT から前駆細胞を伝播し、彼らに骨を区別する傾向、軟骨細胞、脂肪細胞系統をテストする方法を提供します。PVAT のわれわれの情報源は、肥満患者の冠動脈バイパス術後大動脈のバイパスの吻合部からです。離 PVAT は酵素によって解離と間質の血管の一部が分離され、in vitro で初めて人間 PVAT 由来神経前駆細胞の分化能力をテストする私たちを有効に伝達されます。
プライマリの培養ひと PVAT 間質血管分数を使用すると、脂肪細胞、骨、または軟骨系統の方向へ分化する幹細胞/前駆細胞を誘導するために設計された 3 つのアッセイをテストしました。私たちの以前の研究は、その率はテストしていませんが CD73 +、CD105 +、および脂肪細胞6に区別できる頑健 PDGFRa + (CD140a) 細胞の人口を識別されます。PVAT は直接血管の緊張や炎症の7を調整します。この細胞集団の微分の潜在性をテストするための理論的根拠は、専門 PVAT 血管機能に及ぼすと PVAT 拡張肥満のメカニズムを理解し始めるためです。この方法は脂肪組織の派生前駆細胞の機能の私達の理解を高めるおよび識別し、類似点と異なる組織由来の前駆細胞の違いを比較することが出来ます。我々 は確立され、検証されたアプローチを分離し、異なる系統へ MSC の差別化のために構築し、人間 PVAT 由来神経前駆細胞の生存率を最大化するための手順を最適化します。これらのテクニックは、幹・前駆細胞の研究と脂肪組織開発の分野で広範なアプリケーションを持っています。

<table><tbody><tr><td>動物を含まないコラゲナーゼ/ディスパーゼブレンド I &nbsp;</td><td>ミリポアシグマ</td><td>SCR139</td><td>50mg</td></tr><tr><td>アルシアンブルー</td><td>NewComerSupply</td><td>1003A</td><td>1% 水溶液 pH 2.5</td></tr><tr><td>アリザリンレッド</td><td>アムレスコ</td><td>9436-25G</td><td></td></tr><tr><td>α-MEM</td><td>サーモフィッシャー</td><td>12561056</td><td></td></tr><tr><td>アニリンブルー</td><td>NewComerSupply</td><td>10073C</td><td></td></tr><tr><td>抗生物質/抗真菌剤</td><td>サーモフィッシャー</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>Beibrichの緋色の酸のfuchsin</td><td>Millipore-Sigma</td><td>A3908-25G</td><td></td></tr><tr><td>b-グリセロリン酸</td><td>Millipore-Sigma</td><td>G9422-10G</td><td></td></tr><tr><td>Biebrichの緋色のEKI</td><td></td><td>2248-25G</td><td></td></tr><tr><td>Biotin</td><td>Millipore-Sigma</td><td>B4501-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Bouinの固定剤</td><td>NewComerSupply</td><td>1020A</td><td></td></tr><tr><td>牛血清アルブミン</td><td>Calbiochem</td><td>12659</td>は<td>4°Cで保存されています。C</td></tr><tr><td>細胞剥離液</td><td>Accutase</td><td>AT104</td><td></td></tr><tr><td>ベルストレーナー (70 mm)</td><td>Corning</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>デキサメタゾン</td><td>ミリポアシグマ</td><td>D4902-100MG</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Corning</td><td>10-013-CV</td><td>4.5 g/L グルコース、L-glut およびピルビン酸</td></tr><tr><td>DMEM/F12 中</td><td>ThermoFisher</td><td>10565-042</td><td>高グルコース、グルタマックス、ナトリウムバイカルビネート</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>ミリポアシグマ</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>Atlanta Biologicals&nbsp;</td><td>S11550</td><td></td></tr><tr><td>FGF2</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td></td></tr><tr><td>ホルマリン</td><td>NewComerSupply</td><td>1090</td><td></td></tr><tr><td>ゼラチン、ウシ皮</td><td>ミリポアシグマ</td><td>G9391-500G</td><td></td></tr><tr><td>グルタマックス</td><td>サーモフィッシャー</td><td></td><td>35050061 グルタミンサプリメント</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>ロンザ</td><td>10-547F</td><td></td></tr><tr><td>IBMX</td><td>ミリポアシグマ</td><td>I5879-250MG</td><td></td></tr><tr><td>インスリン溶液</td><td>ミリポアシグマ</td><td>I9278-5ML</td><td></td></tr><tr><td>オイルレッドO</td><td>ミリポアシグマ</td><td>O0625-100G</td><td></td></tr><tr><td>パントテン酸</td><td>ミリポアシグマ</td><td>P5155-100G</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリンストレプトマイシン溶液</td><td>サーモフィッシャー</td><td>15240062</td><td>100ml</td></tr><tr><td>パーマウント</td><td>フィ</td><td>ッシャーSP15-500</td><td></td></tr><tr><td>リンタングステン酸/ホスホモイブディ酸溶液</td><td>ミリポアシグマ</td><td>P4006-100G / 221856-100G</td><td></td></tr><tr><td>プリモシン</td><td>Invivogenant-pm-1</td><td></td><td>培地用抗菌試薬。</td></tr><tr><td>ロシグリタゾン</td><td>ミリポアシグマ</td><td>R2408-10MG</td><td></td></tr><tr><td>TGFb1</td><td>Peprotech</td><td>100-21</td><td></td></tr><tr><td>ヴァイガートのヘマトキシリン</td><td>EKI</td><td>4880-100G</td><td></td></tr></tbody></table>

ヒト大動脈血管周囲脂肪前駆細胞の分化能力

Differentiation Capacity of Human Aortic Perivascular Adipose Progenitor Cells

脂肪組織が豊富な万能幹細胞 (MSC) に分化骨、脂肪細胞、軟骨細胞の血統。前駆細胞の脂肪細胞分化は、肥満に対する脂肪組織拡大と機能不全を運転する主要なメカニズムです。血管周囲脂肪組織 (PVAT) に変化を理解、代謝性疾患の臨床的に関連性の高いです。しかし、以前の研究は主にマウスや他の動物の実行をされているモデル。このプロトコルは、冠動脈バイパス手術を受けている患者から収集した人間の呼吸器 PVAT サンプルを使用します。上行大動脈からの脂肪組織は収集され、間質血管の端数の植用します。我々 は以前脂質含有に分化する能力を持つ人間 PVAT 脂肪前駆細胞の存在を確認した脂肪細胞。本研究では、おそらく万能幹細胞を含む間質血管分数からの細胞の微分の潜在性我々 さらに分析。ひと骨髄 MSC の脂肪、骨、軟骨細胞系統に分化する PVAT 由来細胞を比較しました。次の分化の 14 日は、特定の汚れ (オイル赤い O) 脂肪細胞における脂質の蓄積を検出を利用した骨形成系細胞 (アリザリン赤) やグリコサミノグリカンとコラーゲン軟骨幹細胞 (マッソンの Trichrome) の石灰鉱床。骨髄 MSC は効率的にすべての 3 つの系統に分化、PVAT 由来細胞が脂肪細胞と軟骨細胞の潜在的なしかし、骨の強い潜在性を欠けていた。

人間 PVAT 血管間質画分の分離
図 1 aは、上行大動脈を覆う PVAT が得られた解剖学的領域の概略を示しています。我々 は以前からこれらのサンプルあった派生6冠動脈バイパス術を受ける患者の集団を説明します。図 1 bは、手術後得られた人間 PVAT の例を示します。図 1は、マッソンのヒアリン染色代表 PVAT ティッシュ セクションを示しています。図 1は、分化する前の展開フェーズ中に PVAT 由来間質細胞の人口を示すフェーズ契約の顕微鏡写真です。セルを拡大し、将来使用するため凍結できます。2.5 倍の 70% から成るメデ...

このプロトコルの目的は、複数の細胞系統に分化する人間の血管周囲脂肪組織由来幹細胞の能力をテストすることです。分化は、脂肪細胞、骨細胞、軟骨に区別するために知られている人間の骨髄由来間葉系幹細胞と比較しました。

Adipose tissue is a rich source of multi-potent mesenchymal stem cells (MSC) capable of differentiating into osteogenic, adipogenic, and chondrogenic ...

血管周囲脂肪組織は血管を取り囲み、心血管生理を調節します。このプロトコルは、血管微小環境におけるヒト脂肪前駆体の機能に関連する主要な質問に答えるために使用される。脂肪前駆細胞は、解剖学的位置によって変化する。我々は、多能性前駆物質の集団が心血管疾患患者から血管内脂肪組織から正常に誘導できることを示す。手順を実証することは、私の研究室の医学生であるスペンサー・スコットです。テキストプロトコルに記載されているように、手術室からヒト血管内脂肪組織またはPVATの500ミリグラムの部分を取得します。新鮮なヒトPVATをDMEMから25ミリリットルの抗生物質溶液を含む50ミリリットルの円錐管に移す。摂氏4度で20分間ロッキングでインキュベートします。PVATが抗生物質溶液にある間、摂氏37度で解離緩衝液のアリコートを解凍する。50マイクロリットルの抗生物質/抗ミキサイト溶液を5ミリリットルの解離バッファーに加え、0.22ミクロンのシリンジフィルターを使用して滅菌します。24ウェルプレートの1つの井戸にゼラチン溶液を1ミリリットル加えます。薄層流れフードでは、滅菌鉗子とはさみを使用して、抗生物質溶液から無菌ペトリ皿にPVATを移します。組織に予温解離バッファーの 1 ミリリットルを追加します。.滅菌鉗子と解剖はさみを使用して、組織全体をスラリーに細かくミンチします。1ミリリットルのスラリーを4ミリリットルの解離バッファーに移します。200 rpm で摂氏37度の軌道シェーカーで、側面のチューブを1時間インキュベートします。1時間後、目に見える組織片が存在しなく、溶液が曇った細胞懸濁液として現れる。50ミリリットルの円錐チューブの上に設定された70ミクロンの細胞ストレーナーを介して溶液をフィルタリングします。できるだけ多くの細胞を捕捉するために、抗生物質溶液の追加10ミリリットルでストレーナーをリンスします。ストレーナーを絞らない。今度は、振るバケツ遠心分離機で300回gで12分間細胞をペレット化する。遠心分離後、チューブは脂肪細胞の脂肪の上層、相間およびペレットに分離される。ペレットは、内皮細胞、免疫細胞、血液細胞および前駆細胞を含む間質血管分率である。ペレットをHBSSと遠心分離機の10ミリリットルで300倍gで5分間再懸濁します。HBSS での合計 2 回のスッシュに対してこの手順を繰り返します。今、24ウェルプレートからゼラチンを吸引します。HBSSで井戸を1回静かに洗い、バインドされていないゼラチンを取り除きます。成長培地の1ミリリットルの赤血球とゼラチンコーティングウェルに種子を含む間質血管分画ペレットを再懸濁します。次に、培地中の培地に1ミリリットル当たり25ナノグラムの最終的な濃度にヒトFGF2を加える。5%CO2で摂氏37度で24時間インキュベートします。細胞を24時間増殖させた後、増殖培地を取り出し、HBSSで5回洗浄します。この洗浄ステップは、赤血球および死んだ細胞を除去する。その後、新鮮な成長培地の1ミリリットルを追加します 25 各ウェルにミリリットルFGF2あたりナノグラム.毎回1ミリリットル新鮮なFGF2あたり25ナノグラムで補うことを確認するために48時間ごとにメディアを変更します。通過細胞は、外植から7~10日後に100%合流に達すると。これを行うには、成長培地を吸引し、1ミリリットルHBSSで単層を2回洗浄する。ウェルからすべてのHBSSを吸引し、細胞解離溶液の数滴を追加します。プレートを数回タップして渦巻き、5%CO2で摂氏37度で5〜7分間インキュベートし、細胞を持ち上げます。次に、分離した細胞に約1ミリリットルの新鮮な培養培地を加える。500マイクロリットルの成長培地と25ナノグラムのFGF2を含む24ウェルプレートの2つの井戸に、取り外された細胞の500マイクロリットルを分配します。また、ヒト骨髄間葉系幹細胞またはMSCコロニーの培養は、テキストプロトコルに記載されている。12ウェルプレートのウェルごとに骨髄およびPVAT由来細胞の適切な数をプレートします。小児性および骨形成状態の場合、ウェルあたり約200,000〜225,000個の細胞をプレートします。一方、軟骨形成状態に対して、プレート150,000〜175,000細胞当たり175,000個の細胞。次に、細胞剥離液を添加することにより、ヒトPVAT前駆細胞集団およびヒト骨髄MSC集団の両方から細胞を解離する。剥離液中の細胞を摂氏37度、5%CO2で5分間インキュベートします。別々の15ミリリットル円錐バイアルに集団を引っ張ります。バイアルを500倍gで7分間回転させ、細胞をペレットにします。その後、PBSの1ミリリットルで細胞を再懸濁し、ヘモサイトームを使用して細胞数を推定する。以前のように12ウェル皿に細胞を盛り付けます。誘発および非誘導の浸食および骨形成状態のための別々の皿を提供する。そして、誘発された状態の各ウェルに1.5ミリリットルの有数および骨形成伝導媒体を加える。その後、非誘発状態の各ウェルに1.5ミリリットルの有量および骨形成性非誘導培地を加える。37°Cおよび5%CO2で、有数および骨形成性の誘導および非誘導細胞集団のインキュベーションを開始する。ヒトPVAT前駆細胞およびヒト骨髄MCの残量を500倍gで7分間スピンダウンします。残りの骨髄およびPVAT由来の細胞ペレットを再懸濁して、10マイクロリットル当たり100,000細胞の密度を達成するために必要な体積を決定します。次に、軟骨系系統誘導のためのMSC成長培地の計算された体積中のペレットを再懸濁する。ピペットを使用して細胞の体積を上下に静かに動かして、均質な分布を確保します。今ピペット濃縮細胞溶液の10マイクロリットルの液滴を各ウェルの中心に入れて、100,000個の細胞のマイクロ質量を形成する。蒸発を防ぐために、隣接する井戸に1ミリリットルの滅菌水を入れます。マイクロマスを37°C、5%CO2で2時間培養し、マイクロマスを凝集させます。2時間後、誘導された状態の各ウェルに、1ミリリットルのヒトTGF-β-1当たり10ナノグラムでスパイクした軟骨発生分化培地を慎重に添加する。今慎重に非誘導培地の1.5ミリリットルを非誘導状態の井戸に加える。テキストプロトコルに記載されているようにサンプルを脱水、埋め込み、染色するために、誘導された軟骨発生状態のマイクロ質量をカセットに擦り付けたり、注いだりします。アディポジェニック分化研究は、ヒト骨髄由来MSCおよびPVAT由来前駆細胞と並行して行った。非誘導状態では、脂質蓄積は明らかでない。これは、油赤Oを用いた中性脂質の染色後に示される誘導状態とは対照的であるが、ヒト大動脈PVAT由来細胞における分化の程度はより強いが、ヒト細胞源はいずれも脂肪系系統について分化する能力を示した。骨形成分化プロトコルは、ヒト骨髄由来のMSCおよびPVAT由来細胞に使用された。非誘導細胞はアリザリンレッドで染色しなかった。骨形成分化プロトコルの後、ヒトMSPはアリザリンレッドで染色された石灰化結節を開発したが、ヒト大動脈PVAT細胞は染色しなかった。ヒト骨髄MSCとヒトPVATの両方に由来する細胞は、微量のコラーゲン蓄積を伴う軟骨発生分化の特徴を示す。ヒト骨髄MCsおよび大動脈PVAT由来細胞から形成された微量は、アルシアンブルー染色で示されるように糖アミノグリカンの豊富な蓄積も示した。形態学的には、ラクナエに似た構造が、コラーゲン沈着に囲まれた空洞に座っている細胞で検出された。酵素的解離の前に血管内脂肪組織を細かくミンチし、各系統分化アッセイに適切な細胞密度をメッキすることが重要です。この手順に従って、ウェスタンブロットおよびフローサイトメトリーと組み合わせた定量PCRを使用して、血管内脂肪および骨髄源からの分化前駆物質の系統特異的マーカーを特徴付けるべきである。この技術により、肥満時に血管内脂肪組織の拡張と機能不全を調節するメカニズムと、前駆細胞が血管機能や心血管疾患に及ぼす影響を理解し始めることができます。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

人間の血管幹細胞（PSCの）間葉系幹細胞（MSC）に似た骨格組織再生のための新しい幹細胞のクラスです。...

骨再生のための人間の血管周囲の幹細胞の使用

ヒト脂肪由来の間質細胞内の転写の不均一性は、細胞表面マーカーと骨形成遺伝子を使用して単一細胞レベルで定義することができます。...

強化された骨形成のためのヒト脂肪由来間質細胞の単離および濃縮

成熟した脂肪細胞は、脱分化を通じて幹細胞の豊富な供給源を表している可能性があり、これにより線維芽細胞様細胞の均一な集団が形成されます。コラゲナーゼ消化は、ヒトの脂肪から成熟脂肪細胞を分離するために使用されます。私たちのプロトコルの目標は、ヒトの成熟脂肪細胞から多能性で脱分化した脂肪細胞を取得することです。...

天井の培養における成熟脂肪細胞の脱分化を経てヒト脂肪幹細胞の生成

このプロトコルは、ブタ脂肪由来幹細胞（pADSC）の皮下脂肪組織からの単離を、多能性の検査とともに説明するものです。多能性pADSCは、脂肪細胞の分化過程を描写し、中胚葉間葉の複数の細胞系統、または再生研究のための外胚葉および内胚葉のさらなる系統への分化転換を研究するために使用されます。...

ブタ皮下脂肪組織から分離し、脂肪由来幹細胞の分化

人間の心臓組織は、心筋再生のために適切であり得る多能血管周囲の前駆細胞集団を保有します。ここに記載された技術は、ネイティブの血管に関連する2つの多能ストローマ細胞集団の同時単離および精製を可能にする、すなわち CD146 + CD34 -周皮細胞およびCD34 + CD146 -外膜細胞、ヒト心筋から。...

ヒト心臓組織からの血管周囲多能前駆細胞集団の単離

ここでは、MCS（Magnetic-Activated Cell Sorting）を用いた脈管内脂肪組織（PVAT）からの脂肪細胞前駆細胞（APC）集団の単離方法を報告する。この方法は、蛍光活性化細胞選別（FACS）と比較した場合、脂肪組織のグラム当たりのAPCの単離の増加を可能にする。...

磁気活性化細胞選別法により単離された血管周囲脂肪組織からの脂肪細胞前駆体の拡大および脂肪生成誘導

白とベージュの脂肪細胞脂肪組織血管前駆細胞からの分化は、肥満の代謝改善の可能性を負いません。CD31 cd34 陽性 + + 人間の脂肪から内皮細胞分離および後続の in vitro拡張と白とベージュの脂肪細胞への分化のプロトコルについて述べる。いくつかのダウン ストリーム...

分離、拡張、および CD31 cd34 陽性 + + ひと大網と皮下脂肪組織から血管内皮細胞の脂肪分化誘導

Wnt-1 Cre+/-の周産脂肪組織から誘導された脂肪由来幹細胞 (NCAC)...

神経紋の分離、培養、脂肪形成誘導、周食脂肪組織由来の脂肪由来幹細胞

蛍光活性化細胞選別を用いて、マウス上体脂肪パッドから生存性の高い脂肪前駆細胞を単離する簡単な方法を提示する。...

マウス上端体脂肪組織からの脂肪前駆細胞の調製

このプロトコルにより、人工多能性幹細胞(iPSC)から純粋な脂肪細胞集団を作製することができます。レチノイン酸は、iPS細胞を脂肪細胞の産生に使用される間葉系幹細胞(MSC)に分化させるために使用されます。次に、ナイルレッド染色に基づくソーティングアプローチを使用して、純粋な脂肪細胞を取得します。...

脂肪細胞関連疾患を研究するためのヒトiPS細胞を純粋な脂肪細胞集団に確実に分化させる(英語)

本稿では、マウス大動脈周囲脂肪組織からの間質血管分画由来前駆脂肪細胞を単離、培養、脂肪誘発し、血管周囲脂肪組織の機能や血管細胞との関係を研究することを可能とする。...

マウス大動脈周囲脂肪組織からの間質血管分画由来前駆脂肪細胞の単離・培養・脂肪誘発

学ぶヒト大動脈血管周囲脂肪由来前駆細胞の分化能力と骨髄間葉系幹細胞の比較解析。脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞への多能性分化を実証し、心血管疾患における再生医療への応用可能性を示す。

ヒト大動脈血管周囲脂肪前駆細胞の分化能力

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