多発性硬化症の個人のための包括的な解剖プログラム
July 19th, 2019
多発性硬化症は、治療法のない炎症性脱筋膜疾患である。脳組織の分析は、疾患の病因を理解するための重要な手がかりを提供します。ここでは、クリーブランドクリニックで動作するユニークな迅速な解剖プログラムを通じて収集されたMS脳組織の方法論と下流分析について説明します。
私たちの研究の目的は、多発性硬化症の病因を研究することです。この目標を達成するために、我々は取得し、MSを持つ個人から脳を研究するための迅速な検死プログラムを確立しました。私たちの検死プログラムには2つの特別な側面があり、1つ目はそれが急速だということです。私たちは、脳の死の6〜8時間の下で収集します。
これは、最先端の分子研究を可能にします。第二の側面は、脳を動かす前にin situ MRIを行うということです。これにより、病理学的変化と脳イメージングの変化を関連付けすることができます。
ビジュアルデモンストレーションを使用すると、最適な結果を得るために、私たちが空間と時間をどのように整理しているかを視聴者が理解することができます。迅速かつ慎重に起こる組織処理は、RNA分析、免疫染色、免疫ブロット法およびMRI相関を可能にします。新しい研究者は、組織の完全性が悪い組織の処理に苦労する可能性があります。.
長い事後固定時間を避けることは重要であり、MRI組織のコーデの線条は困難であり、MRI分析の専門家との協議は非常に有用であり得る。手順を実証するには、エミリー・クリスティとクリスティーナ・ヴォルスコです。私たちの研究室の技術者。
その場で磁気共鳴画像化した後、脳を計量して撮影し、4%パラホルムアルデヒドまたはPFAの容器に付着した硬膜を置きます。小脳と脳幹を大脳から分離し、大脳を撮影します。プローブを使用して視神経、チアズム、および管を分離し、メスで構造を切除します。
脳半球を縦方向に分離し、各半球を個別に撮影します。左半球の一次運動皮質またはPMCをインクし、組織を再撮影し、長い固定のために3.3リットルの容器に組織を入れる。右半球のPMCを切除するには、覆いの髄を取り除き、組織を再撮影します。
次に、メスを使用してPMCを分けます。その後、半球の横に切除されたPMCを撮影します。PMCを6つの等しい大きさのセクションにカットし、各セクションのrostralの側面をインクします。
その後、PFA充填容器に他のすべてのセクションを配置して、短い固定を行います。そして、スナップは、クーラーナンバーワンで、密閉冷凍袋に保管するための残りのセクションを凍結します。右半球前部を後部に切り、厚さ1センチメートルのコロナセクションに切ります。
PFAの他のすべてのセクションを修正し、スナップはクーラーナンバーワンで密閉冷凍袋に保管するための残りのセクションを凍結します。脳幹を小脳から分離し、短い固定のためにPFA充填容器に脳幹を置く。各小脳半球を4つの等しく固定された矢状のセクションに切り、内側と横の景色を撮影する。
その後、左小脳半球スライスをPFAの容器に入れて短い固定を行います。そして、スナップは、クーラーナンバーワンで、密閉冷凍袋に保管するための右小脳半球スライスを凍結します。神経根で脊髄を得た後、脊髄硬膜を取り除き、硬膜をPFAに保存する。
左と右の前神経根と後神経根を分離し、左前神経と後神経根を脊髄から切り取り、PFAで短い固定を行う。脊髄から右前神経と後部神経根を切断し、冷却番号2で密閉冷凍袋に保管するためにこれらの組織を凍結します。その後、脊髄の尾体最も20センチメートルを撮影し、PFAの短い固定とスナップ凍結のためにコードの尾体方向から鼻の方向に2センチメートルの転送セクションを切断します。
次に、脊髄の残りの鼻の部分を撮影します。そしてPFA短い固定およびスナップの凍結のためにコードの尾口からrostral方向に2センチメートルの移動セクションを切った。短いまたは長い固定組織から関心のある部分をカットします。
セクションを6つのウェルプレートの個々の井戸に入れ、1回の洗浄ごとに新鮮なPBSを2ミリリットルで3回5分間洗浄して組織を洗浄し、揺動します。抗原の検索のために、マイクロ波は、10ミリモルクレートバッファーのおよそ30ミリリットルを含有するガラスビーカーで2〜3分間の切片を有する。セクションが室温に冷却されると、サンプルを新しい6つのウェルプレートに移し、3回の5分間の洗浄と2ミリリットルのPBS、さらに1回のウェルあたり0.3%トリトンX-100を洗浄します。
続いて、PBSで3%過酸化水素3%の2ミリリットルに加えて0.3%トリトンX-100を室温でブロックする内因性ペルオキシダーゼを続けた。インキュベーションの終わりに、PBSの2ミリリットルとトリトンX-100の2ミリリットルで3回洗浄します。続いて、3%正常ヤギ血清とPBSとトリトンX-100の2ミリリットルで室温で1時間ブロックする。
次に、摂氏4度で目的とする一次抗体で一晩から5日間までセクションをインキュベートし、続いて1回の洗浄につき2ミリリットルのPBSで3回の5分間の洗浄を行います。アビジンビオチン複合溶液またはABC複合体中のセクションを室温で1時間インキュベートします。PBSで3つの5分間の打ち付けでこれをフォローアップしてください。
1回当たり過酸化水素を3~8分間補充した濾過ジアミノベンジジン2ミリリットルでセクションにラベルを付けます。色が十分に発達したら、そのセクションをPBSで3回洗浄し、各セクションをPBS充填容器に個別に移します。各セクションを平らに配置し、個々の組織スライドの下に置きます。
そして、PBSから各スライドを静かに持ち上げ、セクションをできるだけ平らに保ちます。2本のペイントブラシを使用して、各組織を穏やかに平らにして伸ばします。そして、余分な水を手を出すためにペーパータオルを使用してください。
その後、適切な取り付け媒体でセクションを取り付け、各カバースリップを透明なマニキュアで密封します。組織切片は、白質病変の存在を調べ、選択された領域は免疫活性および脱髄のために染色される。急性多発性Sceloris病変では、これらの脱髄軸索の多くは、経欠軸索の近位端を反映する軸索の引き込み球根として作用する。
急性病変における経切軸索の密度は、隣接する非病変白白質領域のわずか15に比べて、活性病変において1立方ミリメートル当たり11000を超える。新たに生成されたオリゴデンドロサイトは、多くの慢性MS病変にも存在する。これらのプロセスは、髄除菌軸索と関連するが、筋芽脱髄軸索と関連しない。
慢性MS患者から得られた急速に凍結した運動コルテキストの神経細胞遺伝子変化を偏りのない探し出し、免疫細胞化学を用いた23の核およびコード化されたミトコンドリアメッセンジャーRNAの信任状研究と、その場でのハイブリダイゼーションにおいて、これらの遺伝子が皮質投影ニューロンにおいて高度に富化し、プロジェクション軸索から単離されたミトコンドリアが糖鎖を減少させたことを示した。髄鞘化および脱髄化海馬における神経ノード遺伝子発現の比較は、記憶および学習に関与するタンパク質を含む神経伝達者RNAの減少を明らかにする。さらに、対照皮質と比較して、皮質ニューロン喪失は、脊髄および脳コルテキストの脱髄を有するが、脳白質の除髄を有しないMS患者のサブ集団において有意に大きい。
組織加工の際には、コロナ切片が切断される際に、厚みや向きに関して一貫して切断されていることを確認してください。そして、固定剤に浮かぶとき、または凍結したときに平らに横たわっていること。免疫組織化学分析に加えて、凍結組織コレクションは、遺伝的およびプロテオーム解析を行う機会を提供します。
これらの技術は、MRI上の脳白質病変を有するMS患者の新しいコホートの同定に役立ったが、有意な白質脱髄なし。骨髄皮質MSと呼ぶ。
概要
この研究は、死後数時間以内に脳組織を収集するユニークな迅速剖検プログラムを通じて、多発性硬化症（MS）の病因を調査します。この方法論には、病理学的変化を脳イメージングと関連付けるためのin situ MRIが含まれ、MS脳組織の高度な分子研究と分析を促進します。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 神経科学
- 神経免疫学
- 病理学
背景
- 多発性硬化症は慢性炎症性脱髄疾患です。
- その病因の現時点での理解は、脳組織分析が不十分なために限られています。
- 迅速剖検プログラムにより、研究用に脳サンプルを適時に収集することができます。
- 病理学的所見とイメージング所見の相関は、疾患メカニズムの理解を深めます。
研究目的
- 多発性硬化症の病因を解明すること。
- 迅速剖検脳組織を包括的な分子分析に活用すること。
- 組織の完全性と処理における課題を克服する方法論を確立すること。
使用した方法
- 迅速剖検プログラムは、死後6〜8時間以内に脳組織を収集します。
- 脳の取り出し前にin situ MRIを実施し、病理学的観察と脳イメージングの変化を関連付けます。
- 処理により、RNA分析、免疫染色、免疫ブロッティングが可能になります。
- 主要なステップには、脳組織の撮影、断片化、固定、適切な保存が含まれます。
主要な結果
- この研究は、組織の完全性を維持しながら効果的な組織処理と分析技術を実証しています。
- 特定の染色法を通じて、免疫活性と脱髄に関する洞察が得られます。
- 軸索退縮球の同定は、急性MS病変における損傷メカニズムを強調しています。
- 詳細な方法論は、MS病理学のさらなる調査の基礎を提供します。
結論
- この研究は、リアルタイムの組織分析を通じてMSのより良い理解を可能にします。
- 適時の収集と高度な方法論により、疾患メカニズムに関する包括的な洞察が可能になります。
- この発見は、MSの潜在的な治療戦略の開発に影響を与えます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
The rapid autopsy program enables high-fidelity postmortem tissue collection for mechanistic studies of multiple sclerosis, supporting target validation through direct correlation of imaging and pathology. This approach de-risks translational efforts by providing disease-relevant human tissue for biomarker discovery and preclinical model alignment. The program’s speed and standardization enhance reproducibility in neuroimmunology research pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses via direct analysis of demyelination and axonal injury in human MS lesions.
- Operational Value: Provides well-characterized tissue with correlated MRI-pathology data for target engagement studies.
- Predictive Value: Supports biomarker identification through molecular profiling of rapidly frozen tissue for transcriptomic and proteomic analysis.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates validated histological and molecular readouts from standardized tissue sections for assay benchmarking.
- Operational Value: Ensures tissue consistency through rapid processing and fixed/frozen parallel processing workflows.
- Scalability: Enables platform reuse across multiple analytes including immunostaining, in situ hybridization, and RNA scope.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Facilitates correlation of clinical disability profiles with neuropathological findings in well-characterized donor cohorts.
- Mechanistic De-risking: Identifies molecular subtypes such as myelocortical MS to refine patient stratification in preclinical models.
- Predictive Confidence: Enables validation of imaging biomarkers via postmortem MRI-pathology co-registration.
Pipeline & Workflow Integration
The method supports early discovery through lead identification by supplying disease-relevant human tissue for target validation and mechanistic screening.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing via analysis of immune activity, demyelination, and axonal transection in acute and chronic lesions.
- Screening: Enables assay readiness through standardized 1 cm-thick brain and 2 cm spinal cord sections with fixed and frozen counterparts.
- Analytics: Provides quantitative outputs including lesion load, axonal density (>11,000/mm³ in active lesions), and molecular profiles from RNA and protein analysis.
- Translational Research: Connects discovery to preclinical work via MRI-pathology correlation and identification of MS subtypes.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable tissue processing pipeline for longitudinal neuroimmunology studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through direct human tissue analysis of MS pathology mechanisms.
- Operational Value: Standardization and reproducibility via rapid (<6 h postmortem) tissue procurement and parallel processing.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by reducing mechanistic ambiguity in neuroimmunology target selection.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization through biomarker-aligned tissue subsets and imaging-pathology correlation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in neuroanatomy, neuropathology, and rapid tissue handling protocols.
- Depends on 3 T MRI infrastructure and coordination with autopsy and imaging suites for in situ scanning.
- Necessitates standardized SOPs for tissue sectioning, fixation, freezing, and storage across research teams.
- Involves adaptation considerations for applying protocols to other neurodegenerative disease models.
- Includes practical limitations such as dependency on donor consent, neurological characterization, and 24/7 on-call staffing.
