Name: 多発性硬化症の個人のための包括的な解剖プログラム (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-19T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 41 s
Description: 学ぶ多発性硬化症の迅速剖検プログラムによる脳組織の分子解析と病理学的研究。in situ MRIを用いて画像変化と病理変化を相関させ、RNA分析や免疫染色を可能にする革新的な方法です。

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著者はまた、編集支援のためにクリストファー・ネルソン博士に感謝したいと思います。解剖プログラムは、R35 認可 NS097303 から BDT に部分的にサポートされています。RDの実験室での仕事はNINDS(NS096148)および米国国立多発性硬化症協会(RG 5298)からの助成金によって支えられている。

<ol><li>Trapp, B. D., Nave, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+sclerosis%3A+an+immune+or+neurodegenerative+disorder%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Multiple sclerosis: an immune or neurodegenerative disorder?</a> Annual Review of Neuroscience. 31, 247-269 (2008).</li>
<li>Chang, A., Nishiyama, A., Peterson, J., Prineas, J., Trapp, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NG2-positive+oligodendrocyte+progenitor+cells+in+adult+human+brain+and+multiple+sclerosis+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">NG2-positive oligodendrocyte progenitor cells in adult human brain and multiple sclerosis lesions.</a> Journal of Neuroscience. 20, 6404-6412 (2000).</li>
<li>Chang, A., Tourtellotte, W. W., Rudick, R., Trapp, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Premyelinating+oligodendrocytes+in+chronic+lesions+of+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Premyelinating oligodendrocytes in chronic lesions of multiple sclerosis.</a> New England Journal of Medicine. 346, 165-173 (2002).</li>
<li>Chang, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurogenesis+in+the+chronic+lesions+of+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Neurogenesis in the chronic lesions of multiple sclerosis.</a> Brain. 131, 2366-2375 (2008).</li>
<li>Chang, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+remyelination%3A+A+new+target+for+repair+therapies+in+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">Cortical remyelination: A new target for repair therapies in multiple sclerosis.</a> Annals of Neurology. 72, 918-926 (2012).</li>
<li>Dutta, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dysfunction+as+a+cause+of+axonal+degeneration+in+multiple+sclerosis+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dysfunction as a cause of axonal degeneration in multiple sclerosis patients.</a> Annals of Neurology. 59, 478-489 (2006).</li>
<li>Dutta, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+the+ciliary+neurotrophic+factor+%28CNTF%29+signalling+pathway+in+cortical+neurons+of+multiple+sclerosis+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Activation of the ciliary neurotrophic factor (CNTF) signalling pathway in cortical neurons of multiple sclerosis patients.</a> Brain. 130, 2566-2576 (2007).</li>
<li>Dutta, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Demyelination+causes+synaptic+alterations+in+hippocampi+from+multiple+sclerosis+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">Demyelination causes synaptic alterations in hippocampi from multiple sclerosis patients.</a> Annals of Neurology. 69, 445-454 (2011).</li>
<li>Dutta, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hippocampal+demyelination+and+memory+dysfunction+are+associated+with+increased+levels+of+the+neuronal+microRNA+miR-124+and+reduced+AMPA+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">Hippocampal demyelination and memory dysfunction are associated with increased levels of the neuronal microRNA miR-124 and reduced AMPA receptors.</a> Annals of Neurology. 73, 637-645 (2013).</li>
<li>Trapp, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+transection+in+the+lesions+of+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Axonal transection in the lesions of multiple sclerosis.</a> New England Journal of Medicine. 338, 278-285 (1998).</li>
<li>Trapp, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+neuronal+densities+and+cerebral+white+matter+demyelination+in+multiple+sclerosis%3A+a+retrospective+study%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Neurology%22%5BJournal%5D)">Cortical neuronal densities and cerebral white matter demyelination in multiple sclerosis: a retrospective study.</a> Lancet Neurology. 17, 870-884 (2018).</li>
<li>Young, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+correlates+of+decreased+axonal+Na%2B%2FK%2B+ATPase+in+chronic+multiple+sclerosis+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">Imaging correlates of decreased axonal Na+/K+ ATPase in chronic multiple sclerosis lesions.</a> Annals of Neurology. 63, 428-435 (2008).</li>
<li>Fisher, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+correlates+of+axonal+swelling+in+chronic+multiple+sclerosis+brains%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">Imaging correlates of axonal swelling in chronic multiple sclerosis brains.</a> Annals of Neurology. 62, 219-228 (2007).</li>
<li>Moll, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+correlates+of+leukocyte+accumulation+and+CXCR4%2FCXCL12+in+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Archieves+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">Imaging correlates of leukocyte accumulation and CXCR4/CXCL12 in multiple sclerosis.</a> Archieves of Neurology. 66, 44-53 (2009).</li>
<li>Moll, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+sclerosis+normal-appearing+white+matter%3A+pathology-imaging+correlations%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">Multiple sclerosis normal-appearing white matter: pathology-imaging correlations.</a> Annals of Neurology. 70, 764-773 (2011).</li>
<li>Nakamura, K., Chen, J. T., Ontaneda, D., Fox, R. J., Trapp, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T1-%2FT2-weighted+ratio+differs+in+demyelinated+cortex+in+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">T1-/T2-weighted ratio differs in demyelinated cortex in multiple sclerosis.</a> Annals of Neurology. 82, 635-639 (2017).</li>
<li>Chen, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinically+feasible+MTR+is+sensitive+to+cortical+demyelination+in+MS%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Clinically feasible MTR is sensitive to cortical demyelination in MS.</a> Neurology. 80, 246-252 (2013).</li>
<li>Nakamura, K., Fox, R., Fisher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CLADA%3A+cortical+longitudinal+atrophy+detection+algorithm%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroimage%22%5BJournal%5D)">CLADA: cortical longitudinal atrophy detection algorithm.</a> Neuroimage. 54, 278-289 (2011).</li>
<li>Sled, J. G., Zijdenbos, A. P., Evans, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+nonparametric+method+for+automatic+correction+of+intensity+nonuniformity+in+MRI+data%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Transactions+of+Medical+imaging%22%5BJournal%5D)">A nonparametric method for automatic correction of intensity nonuniformity in MRI data.</a> IEEE Transactions of Medical imaging. 17, 87-97 (1998).</li>
<li>Fisher, E., Cothren, J. R. M., Tkach, J. A., Masaryk, T. J., Cornhill, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Knowledge-based+3D+segmentation+of+the+brain+in+MR+images+for+quantitative+multiple+sclerosis+lesion+tracking%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+SPIE+3034%2C+Medical+Imaging%22%5BJournal%5D)">Knowledge-based 3D segmentation of the brain in MR images for quantitative multiple sclerosis lesion tracking.</a> Proc. SPIE 3034, Medical Imaging. , 19-25 (1997).</li>
<li>Avants, B. B., Epstein, C. L., Grossman, M., Gee, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Symmetric+diffeomorphic+image+registration+with+cross-correlation%3A+evaluating+automated+labeling+of+elderly+and+neurodegenerative+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Medical+Image+Analysis%22%5BJournal%5D)">Symmetric diffeomorphic image registration with cross-correlation: evaluating automated labeling of elderly and neurodegenerative brain.</a> Medical Image Analysis. 12, 26-41 (2008).</li>
<li>Jenkinson, M., Bannister, P., Brady, M., Smith, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+optimization+for+the+robust+and+accurate+linear+registration+and+motion+correction+of+brain+images%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroimage%22%5BJournal%5D)">Improved optimization for the robust and accurate linear registration and motion correction of brain images.</a> Neuroimage. 17, 825-841 (2002).</li>
<li>Lewis, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+brain+revisited%3A+opportunities+and+challenges+in+postmortem+studies+of+psychiatric+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropsychopharmacology%22%5BJournal%5D)">The human brain revisited: opportunities and challenges in postmortem studies of psychiatric disorders.</a> Neuropsychopharmacology. 26, 143-154 (2002).</li>
<li>Chomyk, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+methylation+in+demyelinated+multiple+sclerosis+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">DNA methylation in demyelinated multiple sclerosis hippocampus.</a> Scientific Reports. 7, 8696(2017).</li>
<li>Huynh, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenome-wide+differences+in+pathology-free+regions+of+multiple+sclerosis+brains%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Epigenome-wide differences in pathology-free regions of multiple sclerosis brains.</a> Nature Neuroscience. , (2014).</li>
<li>Ishii, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+myelin+proteome+and+comparative+analysis+with+mouse+myelin%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Human myelin proteome and comparative analysis with mouse myelin.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. U. S. A. 106, 14605-14610 (2009).</li>
</ol>

著者は利益相反を宣言しない。

我々は、MSを持つ150人以上の個人から組織を迅速に調達し、処理するために使用されているプロトコルについて説明する。このプロトコルの重要な特徴は、組織を利用する科学者がプロトコルを確立し、組織集を行うことも担当していることです。これにより、個々の研究プロジェクトの科学的ニーズを柔軟に満たすことができます。このプロトコルのいくつかの側面は、そのユーティリティを強化します。患者の多くは、私たちのセンターで神経科医が続いているので、患者は通常、死ぬ前によく特徴付けられます。重要なステップは、死後すぐに組織の寄付の処理です, これは、他のいくつかの脳バンクと比較して凍結組織の品質を増加させます.これにより、組織学的および免疫細胞化学的観察の実証に不可欠な転写および翻訳遺伝子産物の変化を記述する上で大きな価値のある分子研究が可能になります。複数の症例にわたる形態学的/免疫細胞化学的および分子データの活用は、結論の信頼性を高めます。これは、大脳皮質におけるミトコンドリア遺伝子の変化と脱筋脱海馬における神経遺伝子の変化の記述によって最もよく示される。新しい遺伝子プロファイリングプロトコルは急速に開発されており、当バンクの凍結組織は、組織および単一細胞分析のための高品質のRNAを提供する必要があります。
私たちのプロトコルのもう一つの重要な側面は、短い固定脳スライスです。これらのティッシュは30 μmの厚さ、自由な浮遊セクションに切断される。これらのセクションは、共焦点顕微鏡を使用して3次元で2つ以上の抗原を分析するのに最適です。良い例は、慢性MS病変におけるジストロフィー軸索との前骨髄化オリゴデンドロサイトプロセスの相互作用、ならびに経絶軸索引力球根球への単一軸索接続の同定を含む。これは、3D 画像が実現不可能な 7 μm 厚のパラフィン セクションの日常的な使用とは対照的です。パラフィン埋め込み組織は、いくつかの質問、特に半球7 μm厚のセクションにおける神経密度の定量化に大きな価値を有する。従って私たちのティッシュ処理のプロトコルは多様であり、固定され、急速に凍結されたティッシュを保証する柔軟性を提供する。
私たちのプロトコルのもう一つのユニークな特徴は、その中の脳MRIの死後です。脳MRIsはMS疾患のかけがえのないバイオマーカーです。したがって、異常なMRI信号の病理学的相関を確立することが不可欠である。我々の研究は、T2のみおよびT2T1MTR ROIsの両方がしばしばミエリン化されることが明らかである。この知見は、骨髄異分化と脱筋化性脳白質を確実に区別する、より具体的なイメージングモダリティの必要性を支持する。MRIはミエリンの検出に敏感であるように見えるが、我々の研究は、T1/T2/MTRの組み合わせでさえ、髄質を同定するために特異的ではないことを示している。私たちの死後プロトコルは、新しいイメージングモダリティの能力をテストするための理想的なプラットフォームを提供し、骨髄切れと脱筋化された脳白質を区別します。MRIはまた、翻訳研究におけるMRIの使用と生きている患者における広範な臨床使用を考えると、基礎科学の結果を臨床実践に翻訳するための理想的な手段を提供します。
短く、長い固定だけでなく、冷凍スライスを切断すると、異なる研究のための複数のモードで組織を処理するための利点を提供していますが、この方法にはいくつかの制限があります。構造の全体の評価は、隣接するスライス上で異なる方法で処理される可能性があるため、構造の一部が制限される場合があります。しかし、組織バンクの大量は、サンプリングを改善するために、複数の被験者に関心のある構造を調査する能力を提供する。死後組織を利用する研究のもう一つの一般的な制限は、それらが断面的であることです。変更のタイミングと進行に関する結論は、この文脈の中で解釈する必要があります。組織を寄付する患者に選択バイアスがあり、MSを有するすべての患者にデータの一般化が制限される可能性があります。ほとんどのドナーは高度なMSの合併症で死亡するので、これらの患者からMSの初期段階の所見を外挿することは適切ではないかもしれません。それにもかかわらず、我々は非MS関連の状態(すなわち、急性心筋梗塞、薬物過剰摂取、自殺)で死亡した若い患者から組織を受け取った。我々のプロトコルの範囲は、MSに関与している他の器官(例えば、消化管および骨髄)のサンプリングを含まない。私たちは、プログラムの強みは、その限界を大きく上回ると信じています。

病気を研究する最良の方法の一つは、病気の組織自体を調べることです。これは、中枢神経系(CNS)の疾患を研究する人々に課題を提示します。病気の脳と脊髄の生検は非常にまれであり、通常は非定型症例を伴う。CNS疾患を有する個人の解剖率は近年劇的に減少しており、行われると、しばしば組織の迅速な調達を提供しない。これらの課題は、多発性硬化症(MS)を有する個人からの組織の採取に焦点を当てたいくつかの疾患中心の脳バンクの確立をもたらした。MSは、ミエリン、オリゴデンドロサイト(ミエリン形成細胞)、ニューロン、および軸母を破壊するCNSの炎症媒介性疾患である。MS患者の大半は、可変回復を伴う神経障害の発作から始まる双ファシス病コースを有し、最終的には自然界で神経変性である可能性が高い徐々に進行性の疾患に進化する。寄付されたMS脳の大半では、死後の間隔(PMI)が24時間を超える。これらの組織は、MS脳の病理学的変化に関する貴重な情報を提供しているが、それらは病気の病態生理学に強力な洞察を提供することができるより高度な分子研究には適していない。これは、無傷のRNAを必要とする遺伝子プロファイリング研究の場合に特に当てはまる。
上記の限界を克服するために、MRI/病理学的相関を可能にする迅速な組織寄付プログラムを開発しました。このプロトコルは、現代の分子研究に適したよく保存された組織を提供し、MS脳の脳病理とMRI異常の直接比較を可能にします。クリーブランドクリニック多発性硬化症組織寄付プログラムは、20年以上にわたり存在しています。この急速な組織の寄付プログラムはMSおよび他の関連する自己免疫神経学的条件を持つ個人から脳および脊髄を調達する。このプログラムは、死後6時間以内にMRIで取得し、その後、組織処理のための脳と脊髄の除去を目指す。
募集 寄付は、患者(事前同意)から直接得られる、または死後の親族の次から得られるアンテモーテムの同意のいずれかを通じて得られます。同意前の患者は、通常、オハイオ州クリーブランドの多発性硬化症治療研究センターの臨床集団から同定される。迅速な組織寄付プログラムにおける募集の好みは、縦方向の研究に従った患者に与えられるが、それは中心で見られるすべての患者に開かれている。死亡前に登録した参加者には、死亡時または死亡が差し迫っていると思われる場合に、家族または介護事業者に調査チームに連絡するよう指示されます。組織寄付プログラムに入る個人のための第二の方法は、近親者の同意を通じて死亡時です。オハイオ州は、オハイオ州北東部の20郡で活動するLifeBancという連邦政府の義務付けられた臓器調達組織に対して、死亡を義務付けています。LifeBancは、臓器提供の除外であるMSの診断のためにすべての死亡をスクリーンします。ライフバンクは、クリーブランド・クリニックから半径75マイル以内で発生したMSの関連診断を伴うすべての死亡に関して、MS組織寄付プログラムから調査官に通知する手配を行いました。次に、親族と病院のスタッフが組織寄付プログラムスタッフから連絡を受け、脳および脊髄組織の寄付に同意を得ます。LifeBancを通じて、これらの2つの募集のアンテモーテムと死後の方法は、年間約10-12の脳の寄付をもたらす。LifeBancから派生した紹介の数を管理するために、死亡の上限年齢制限に調整が行われます。
寄付金の調達 このプログラムでは、組織調達のための組織寄付プログラムのメンバーによる24時間のカバレッジ、365日が必要です。一元的な組織寄付通知電子メール/ポケットベル/モバイルデバイスのテキスト通知システムは、組織の寄付をカバーする臨床チームによって使用されます。LifeBancは、組織寄付プログラムのオンコール担当者に連絡するための番号を提供しています。メンバーは、病院の提供者/近親者(事前に同意)またはLifeBancおよびその他の紹介元によって死亡を通知されます。まず、死亡時刻と組織寄付の実現可能性の判定がなされる。その後、死亡は、長期死後低酸素症、大規模な破壊的な脳組織(例えば、大脳頭蓋内出血、広範な二半球脳卒中、広範な腫瘍)を含む、質の悪い組織をもたらす可能性のある条件についてスクリーニングされる。負担)、長時間の人工呼吸器サポート(>3日)、および血管活性剤の長期使用(>3日前)。医療検査官が死亡に関与する場合、研究神経科医は、医療検査官の責任を損なうことなく、タイムリーな組織を受け取る方法を模索するために、医師と話すことができます。生存可能な組織が存在すると感じられる場合は、書面による同意が得られ(死後前に得られなかった場合)、身体輸送のための準備がなされる。その後、以前に契約した受託輸送サービスに連絡して、クリーブランド・クリニックのMRI施設への輸送を行います。体温がMRI信号特性の変化に関連しているので、体が室温のままで、冷蔵庫に入れられていないように注意が必要です。
臨床履歴 臨床履歴には、MSの診断、症状の発症、使用される治療、臨床および準臨床検査の結果(誘発電位、脳脊髄液の結果、光学コヘレンス断層撮影)、多発性硬化症機能複合材料の詳細が含まれます。、医療記録(利用可能な場合)から収集される障害者ステータススケール(EDSS;実際または推定)、および近親者の次の直接面接を拡大した。死後MRIも採取されます。

<table><tbody><tr><td>抗体</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ビオチン化ヤギ抗マウスIgG</td><td>ベクター研究所</td><td>BA-9200</td>半<td>球の1:500希釈;30&microの1:1,000;m free-floating. RRID: AB_2336171</td></tr><tr><td>ビオチン化ヤギ抗ウサギ IgG Vector</td><td>Laboratories</td><td>BA-1000</td><td>1:500 希釈。</td></tr><tr><td>ビオチン化ヤギ抗ラットIgG</td><td>ベクター研究所</td><td>BA-9400</td>半<td>球の1:500希釈;30&microの1:1,000;m free-floating. RRID: AB_2336208</td></tr><tr><td>Glial fibrillary acid protein (GFAP)</td><td>Dako</td><td>Z0334</td><td>1:700 dilution for hemispheric. RRID: AB_10013382</td></tr><tr><td>HuR, mouse IgG, 3A2 clone</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-5261</td><td>1:500 for 30&micro; RRID: AB_627770</td></tr><tr><td>Major histocompatibility complex (MHC) class II HLA-DR CR3/43</td><td>Dako</td><td>Mo746</td><td>1:250 dilution for hemispheric; 1:500 for 30 &micro; RRID:AB_2313661</td></tr><tr><td>非リン酸化ニューロフィラメント(SMI32)</td><td>Biolegend</td><td>801701</td><td>半球の場合は1:5,000希釈、30 & microの場合は1:2,500。m free-floating. RRID: AB_2564642</td></tr><tr><td>リン酸化ニューロフィラメント (SMI31)</td><td>Biolegend</td><td>801601</td> 半<td>球の場合は 1:5,000 希釈、30 & マイクロの場合は 1:2,500;m free-floating. RRID: AB_2564641</td></tr><tr><td>プロテオリピッドタンパク質 (PLP)</td><td>ウェンディ・マックリン</td><td></td>からの贈り物 <td>IHC 用 1:250 希釈; 代替の抗 PLP 抗体が市販されています。</td></tr><tr><td>試薬</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>125 mm フィルターペーパー</td><td>Whatman</td><td>1452-125</td><td>PFAのろ過用。</td></tr><tr><td>50% グルタルアルデヒド</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>16320</td><td>電子顕微鏡グレード。</td></tr><tr><td>Cytoseal</td><td>ThermoScientific</td><td>8310-16</td><td></td></tr><tr><td>エチレングリコール</td><td>フィッシャーケミカル</td><td>BP230-4</td><td></td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7893</td><td>400 mL/2 L 凍結保護液。</td></tr><tr><td>Millex-HVシリンジフィルターユニット、0.45 &micro;m、PVDF、33 mm、ガンマ滅菌ミリ</td><td>ポアシグマSLHV033RB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>19200</td><td>プリルフォーム。</td></tr><tr><td>ポリビニルピロリドン(PVP-40)</td><td>フィッシャーケミカル</td><td>BP220-212</td><td></td></tr>ア<tr><td>ジ化ナトリウム</td><td>フィッシャーケミカル</td><td>S227I</td><td>2 g / 2 Lソレンソン緩衝液。</td></tr><tr><td>リン酸ナトリウム二塩基性</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0876</td><td>98.8 g/2 L ソレンソン緩衝液。</td></tr><tr><td>リン酸ナトリウム 1塩基性 一水和物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9638</td><td>14.352 g/2 L ソレンソン緩衝液。</td></tr><tr><td>スクロース</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>PVP40-500G</td><td></td></tr><tr><td>VectaStain ABCキット</td><td>ベクターラボラトリーズ</td><td>PK-6100</td><td>AおよびB. RRIDの1:1,000希釈:AB_2336819</td></tr><tr><td>防水描画黒インク</td><td>ヒギンズ</td><td>44201</td><td></td></tr><tr><td>キシレン</td><td>フィッシャーケミカル</td><td>X3S</td><td>組織学グレード。</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3T MRI Magnetom Prisma</td><td>Siemens Healthineers</td><td></td><td></td></tr><tr><td>7T MRI Agilent 830AS</td><td>Siemens Healthineers</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

多発性硬化症の個人のための包括的な解剖プログラム

Comprehensive Autopsy Program for Individuals with Multiple Sclerosis

多発性硬化症(MS)を持つ個人のための迅速な組織寄付プログラムについて説明し、科学者や技術者が24/7、365日オンコールする必要があります。参加者は、脳と脊髄を寄付することに同意します。ほとんどの患者は、MS治療と研究のためのクリーブランドクリニックメレンセンターで神経科医が続きました.彼らの臨床コースと神経学的障害はよく特徴付けられています。死後まもなく、身体はMSイメージングセンターに搬送され、そこで脳は3T磁気共鳴イメージング(MRI)によってその場でスキャンされる。その後、遺体は解剖室に移され、そこで脳と脊髄が取り除かれる。脳は2つの半球に分かれています。1つの半球はすぐにスライスボックスに入れられ、代替1cm厚のスライスは2日間4%のパラホルムアルデヒドで固定されるか、またはドライアイスと2-メチルブタンで急速に凍結される。短い固定された脳のスライスは凍結保存液に貯え、敏感な抗原の組織学的分析および免疫細胞化学的検出のために使用される。冷凍スライスは-80°Cで保存され、分子、免疫細胞化学、およびその現場のハイブリダイゼーション/RNAスコープ研究に使用されます。他の半球は、数ヶ月間4%のパラホルムアルデヒドに入れられ、スライスボックスに入れ、3 T磁気共鳴(MR)スキャナで再スキャンし、センチメートル厚いスライスにスライスします。その現場での死後MR画像(MRI)は、MRI病理相関を促進するために1cm厚の脳スライスと共登録される。すべての脳スライスが撮影され、脳白物質病変が同定される。脊髄は2cmの区分に切断される。代替セグメントは、4%パラホルムアルデヒドまたは急速に凍結して固定される。死後MS組織の迅速な調達により、MS脳と脊髄の病理学的および分子的解析と脳MRI異常の病理学的相関が可能になります。これらの急速に処理された死後組織の品質(通常死亡の6時間以内)は、MS研究にとって大きな価値があり、多くのインパクトの強い発見をもたらしています。

多発性硬化症は、治療法のない炎症性脱筋膜疾患である。脳組織の分析は、疾患の病因を理解するための重要な手がかりを提供します。ここでは、クリーブランドクリニックで動作するユニークな迅速な解剖プログラムを通じて収集されたMS脳組織の方法論と下流分析について説明します。

We describe a rapid tissue donation program for individuals with multiple sclerosis (MS) that requires scientists and technicians to be on-call 24/7, 365 ...

私たちの研究の目的は、多発性硬化症の病因を研究することです。この目標を達成するために、我々は取得し、MSを持つ個人から脳を研究するための迅速な検死プログラムを確立しました。私たちの検死プログラムには2つの特別な側面があり、1つ目はそれが急速だということです。私たちは、脳の死の6〜8時間の下で収集します。これは、最先端の分子研究を可能にします。第二の側面は、脳を動かす前にin situ MRIを行うということです。これにより、病理学的変化と脳イメージングの変化を関連付けすることができます。ビジュアルデモンストレーションを使用すると、最適な結果を得るために、私たちが空間と時間をどのように整理しているかを視聴者が理解することができます。迅速かつ慎重に起こる組織処理は、RNA分析、免疫染色、免疫ブロット法およびMRI相関を可能にします。新しい研究者は、組織の完全性が悪い組織の処理に苦労する可能性があります。.長い事後固定時間を避けることは重要であり、MRI組織のコーデの線条は困難であり、MRI分析の専門家との協議は非常に有用であり得る。手順を実証するには、エミリー・クリスティとクリスティーナ・ヴォルスコです。私たちの研究室の技術者。その場で磁気共鳴画像化した後、脳を計量して撮影し、4%パラホルムアルデヒドまたはPFAの容器に付着した硬膜を置きます。小脳と脳幹を大脳から分離し、大脳を撮影します。プローブを使用して視神経、チアズム、および管を分離し、メスで構造を切除します。脳半球を縦方向に分離し、各半球を個別に撮影します。左半球の一次運動皮質またはPMCをインクし、組織を再撮影し、長い固定のために3.3リットルの容器に組織を入れる。右半球のPMCを切除するには、覆いの髄を取り除き、組織を再撮影します。次に、メスを使用してPMCを分けます。その後、半球の横に切除されたPMCを撮影します。PMCを6つの等しい大きさのセクションにカットし、各セクションのrostralの側面をインクします。その後、PFA充填容器に他のすべてのセクションを配置して、短い固定を行います。そして、スナップは、クーラーナンバーワンで、密閉冷凍袋に保管するための残りのセクションを凍結します。右半球前部を後部に切り、厚さ1センチメートルのコロナセクションに切ります。PFAの他のすべてのセクションを修正し、スナップはクーラーナンバーワンで密閉冷凍袋に保管するための残りのセクションを凍結します。脳幹を小脳から分離し、短い固定のためにPFA充填容器に脳幹を置く。各小脳半球を4つの等しく固定された矢状のセクションに切り、内側と横の景色を撮影する。その後、左小脳半球スライスをPFAの容器に入れて短い固定を行います。そして、スナップは、クーラーナンバーワンで、密閉冷凍袋に保管するための右小脳半球スライスを凍結します。神経根で脊髄を得た後、脊髄硬膜を取り除き、硬膜をPFAに保存する。左と右の前神経根と後神経根を分離し、左前神経と後神経根を脊髄から切り取り、PFAで短い固定を行う。脊髄から右前神経と後部神経根を切断し、冷却番号2で密閉冷凍袋に保管するためにこれらの組織を凍結します。その後、脊髄の尾体最も20センチメートルを撮影し、PFAの短い固定とスナップ凍結のためにコードの尾体方向から鼻の方向に2センチメートルの転送セクションを切断します。次に、脊髄の残りの鼻の部分を撮影します。そしてPFA短い固定およびスナップの凍結のためにコードの尾口からrostral方向に2センチメートルの移動セクションを切った。短いまたは長い固定組織から関心のある部分をカットします。セクションを6つのウェルプレートの個々の井戸に入れ、1回の洗浄ごとに新鮮なPBSを2ミリリットルで3回5分間洗浄して組織を洗浄し、揺動します。抗原の検索のために、マイクロ波は、10ミリモルクレートバッファーのおよそ30ミリリットルを含有するガラスビーカーで2〜3分間の切片を有する。セクションが室温に冷却されると、サンプルを新しい6つのウェルプレートに移し、3回の5分間の洗浄と2ミリリットルのPBS、さらに1回のウェルあたり0.3%トリトンX-100を洗浄します。続いて、PBSで3%過酸化水素3%の2ミリリットルに加えて0.3%トリトンX-100を室温でブロックする内因性ペルオキシダーゼを続けた。インキュベーションの終わりに、PBSの2ミリリットルとトリトンX-100の2ミリリットルで3回洗浄します。続いて、3%正常ヤギ血清とPBSとトリトンX-100の2ミリリットルで室温で1時間ブロックする。次に、摂氏4度で目的とする一次抗体で一晩から5日間までセクションをインキュベートし、続いて1回の洗浄につき2ミリリットルのPBSで3回の5分間の洗浄を行います。アビジンビオチン複合溶液またはABC複合体中のセクションを室温で1時間インキュベートします。PBSで3つの5分間の打ち付けでこれをフォローアップしてください。1回当たり過酸化水素を3~8分間補充した濾過ジアミノベンジジン2ミリリットルでセクションにラベルを付けます。色が十分に発達したら、そのセクションをPBSで3回洗浄し、各セクションをPBS充填容器に個別に移します。各セクションを平らに配置し、個々の組織スライドの下に置きます。そして、PBSから各スライドを静かに持ち上げ、セクションをできるだけ平らに保ちます。2本のペイントブラシを使用して、各組織を穏やかに平らにして伸ばします。そして、余分な水を手を出すためにペーパータオルを使用してください。その後、適切な取り付け媒体でセクションを取り付け、各カバースリップを透明なマニキュアで密封します。組織切片は、白質病変の存在を調べ、選択された領域は免疫活性および脱髄のために染色される。急性多発性Sceloris病変では、これらの脱髄軸索の多くは、経欠軸索の近位端を反映する軸索の引き込み球根として作用する。急性病変における経切軸索の密度は、隣接する非病変白白質領域のわずか15に比べて、活性病変において1立方ミリメートル当たり11000を超える。新たに生成されたオリゴデンドロサイトは、多くの慢性MS病変にも存在する。これらのプロセスは、髄除菌軸索と関連するが、筋芽脱髄軸索と関連しない。慢性MS患者から得られた急速に凍結した運動コルテキストの神経細胞遺伝子変化を偏りのない探し出し、免疫細胞化学を用いた23の核およびコード化されたミトコンドリアメッセンジャーRNAの信任状研究と、その場でのハイブリダイゼーションにおいて、これらの遺伝子が皮質投影ニューロンにおいて高度に富化し、プロジェクション軸索から単離されたミトコンドリアが糖鎖を減少させたことを示した。髄鞘化および脱髄化海馬における神経ノード遺伝子発現の比較は、記憶および学習に関与するタンパク質を含む神経伝達者RNAの減少を明らかにする。さらに、対照皮質と比較して、皮質ニューロン喪失は、脊髄および脳コルテキストの脱髄を有するが、脳白質の除髄を有しないMS患者のサブ集団において有意に大きい。組織加工の際には、コロナ切片が切断される際に、厚みや向きに関して一貫して切断されていることを確認してください。そして、固定剤に浮かぶとき、または凍結したときに平らに横たわっていること。免疫組織化学分析に加えて、凍結組織コレクションは、遺伝的およびプロテオーム解析を行う機会を提供します。これらの技術は、MRI上の脳白質病変を有するMS患者の新しいコホートの同定に役立ったが、有意な白質脱髄なし。骨髄皮質MSと呼ぶ。

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実験的自己免疫性脳脊髄炎の誘導と多様な評価指標

これまでのところ、すべての主要な中枢神経系常在細胞タイプを同じマウスから同時に単離するためのプロトコルは、満たされていない需要です。プロトコルはneuroinflammationの間に複雑な細胞ネットワークを調査し、同時に必須のマウス数を減らすために素朴で、実験的な自己免疫の脳脊髄炎のマウスで適当なプロシージャを示す。...

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実験的自己免疫性脳脊髄炎は、多発性硬化症の最も広く使用されているマウスモデルの1つです。現在のプロトコルでは、雌雄のC57BL/6Jマウスにミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質ペプチドを免疫し、主に尾と四肢の上行麻痺を引き起こします。ここでは、EAEの誘導と評価のプロトコルについて説明します。...

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多発性硬化症の個人のための包括的な解剖プログラム

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