ヒトの胎児微生物叢に対する介入レジメンの影響を推定するインビトロバッチ培養モデル
2019年7月31日
このプロトコルは、ヒトのフェカル微生物叢のインビトロバッチ培養発酵システムを説明し、イヌリン(よく知られているプレバイオティクスと最も広く研究された微生物モジュレーターの1つ)を使用して、特定の効果を推定する上でこのシステムの使用を実証する。fecal微生物叢組成および代謝活動に対する介入。
様々なヒト疾患における腸内微生物叢の新たな役割を考えると、プロバイオティクス、プレバイオティクス、ダイエットおよび薬物のようないくつかの腸内微生物叢調節剤は、腸内微生物叢関連の健康病気を改善するのに役立ちます。しかし、このような腸内微生物叢変調器の影響を予測するための迅速かつ手頃な価格のスクリーニングシステムはありませんが、このシステムは、特定の介入が最終的にホストの健康に影響を与える可能性のある腸内微生物叢にどのような影響を与えるかを予測するのに十分簡単です。このプロトコルは、腸内微生物叢変調器と微生物叢および宿主の健康への影響を調査する実験室にとって、シンプルで手頃な価格で実用的です。
無菌および嫌気性条件の維持は、この実験のために重要である。また、便標本は、すぐに収集時に、新たに使用する必要があります。それ以外の場合、実験が後で計画されている場合、サンプルは、周囲温度や空気に暴露することなく、収集時にすぐにマイナス80で保存する必要があります。
アリコートの準備とピペッティングの際の取り扱い精度は、精度と再現性を維持するためにも重要です。昼間は12時間未満かかります。彼らが24時間でサンプルを必要とするならば、私たちは一晩で文化を構築することができます。
次いで、短鎖脂肪酸とマイクロバイオーム定量を続ける。このプロセスは、私の研究室の2人の偉大なユニ学生、ショコウ・アフマディとラビナ・マイナによって実証されます。ヒュームフードの下で発酵培地を調製するために、磁石混合物上の試薬ボトルに、混合溶液A、溶液B、微量ミネラル溶液、水溶性ビタミン溶液、葉酸ビオチン溶液、リボフラビン溶液、ヘミン溶液、短鎖脂肪酸混合、およびレサズリンを混合する。
その後、ボトル酵母エキス、炭酸ナトリウム、システイン塩酸塩一水和物、トリプチケースに添加する。蒸留水を296.1ミリリットル加え、通常の塩酸塩または水酸化ナトリウムでpHを調整して7.0前後になるようにします。ビーカーを無菌ワークステーションに移し、0.22マイクロメートルの孔径の真空フィルターを使用して、滅菌のために培地を濾過します。
1リットルの嫌気性希釈液を調製するには、5グラムの塩化ナトリウム、2グラムのグルコース、および0.3グラムのシステイン塩酸塩水和物をイオン化水中で溶解する。121.1°Cのキャップで試薬ボトルを15分間オートクレーブし、嫌気性チャンバーの中に保管します。発酵実験を開始する前に、発酵実験に必要なすべての材料、溶液、およびツールを嫌気室内に少なくとも48時間保管し、酸素を除去します。
発酵実験の少なくとも24時間前に、イヌリンの300ミリグラムの重量を量り、それを50ミリリットルのチューブに移し、嫌気室の中に入れる。26ミリリットルの殺菌発酵培地をチューブに加え、渦を混ぜます。約24時間の繊維の水和を可能にする。
発酵実験の当日、便接種を調製する。まず、50ミリリットル円錐形チューブに5グラムの新鮮な胎児サンプルを量る。嫌気性希釈液をチューブに加えて、最終体積50ミリリットルに達します。
ボルテックスは15分間、または完全に均質化されるまでである。接種チューブを嫌気室内で摂氏37度に保ち、1時間に1回穏やかに反転して繊維と接種を再中断します。3時間、6時間、9時間、または24時間後に、適切な量の発酵培地を取り出し、摂氏4度で10分間14,000倍gのサンプルを遠心分離する。
直ちに上清とペレットを液体窒素に凍結し、スナップ凍結後、短鎖脂肪酸分析用の上清とマイクロバイオーム分析用のペレットをマイナス80°Cで保存します。このプロトコルは、特定のプレバイオティクスの効果を実証するために使用されます。健康なヒト被験者の便は、イヌリンによる治療後、9時間の間比較的安定したpHを示したが、24時間後に劇的に低下した。
イヌリンの接種は、イヌリン処理した便標本における短鎖脂肪酸および乳酸のレベルを有意に増加させ、非処理された便の微生物叢培養と比較する。主な座標分析は、イヌリン処理サンプルと未処理サンプル間のベータ多様性の加重および非加重UniFrac尺度に対する異なる微生物叢組成を示す。アルファ多様性とPD全体の樹木を通じた系統学的多様性の指標、種の豊かさ、運用分類単位、種の均一性、ならびに主要なフィラおよび属の相対的な豊富さは、すべてイヌリン処理および未治療サンプルの間に異なる腸内微生物叢シグネチャを提示する。
分類学的クラドグラムは、16S配列の線形判別効果サイズ分析から導出され、異なるサンプル群間の異なる豊富な分類を表す。すべての手順を慎重に実行します。最も重要なことは、厳格な無菌および嫌気性条件を維持することです。
上清および実験から繊維の発酵の結果として短鎖脂肪酸のレベル変化を治療するために使用することができる。さらに、ペレット中の腸内微生物叢組成物の変化を分析するために使用することができる。培養培地の製造に使用される化学物質の中には、潜在的に危険な化学物質があります。
MSDSシートを使用し、それに応じて注意してください。
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概要
本プロトコルでは、イヌリンを用いてヒト糞便微生物叢のin vitroバッチ培養発酵システムを構築し、特定の介入が糞便微生物叢の組成および代謝活性に及ぼす影響を評価する方法について解説します。
研究の主要構成要素
科学分野
- マイクロバイオーム研究
- 腸内環境の健康
- プレバイオティクス効果
背景
- 腸内マイクロバイオームは、ヒトの健康において極めて重要な役割を果たしています。
- プレバイオティクスなどの調節因子は、腸内細菌叢に影響を与える可能性があります。
- 腸内マイクロバイオームへの影響を評価するための現在のスクリーニングシステムには限界があります。
- 本プロトコルは、研究室にとって実用的なソリューションを提供します。
研究目的
- 簡便で低コストなスクリーニングシステムを開発すること。
- 介入が腸内細菌叢に与える影響を予測すること。
- 宿主の健康における細菌叢の役割への理解を深めること。
使用した手法
- in vitroバッチ培養発酵システム。
- 新鮮な糞便検体を使用するか、-80°Cで適切に保存すること。
- 無菌および嫌気条件の維持。
- 微生物叢の組成および代謝活性の評価。
主要な結果
- 本システムは、特定の介入による影響を効果的に予測します。
- 糞便微生物叢の組成における変化を実証しました。
- イヌリンによって影響を受ける代謝活性を明らかにしました。
- 腸内マイクロバイオームの調節に関する知見を提供しました。
結論
- このプロトコールは、マイクロバイオーム研究における有用なツールです。
- これにより、腸内環境改善に向けた介入策の評価が可能になります。
- 微生物叢とホストの健康に関するさらなる研究を支援します。
よくある質問
産業界における重要性
ヒト糞便微生物叢の高スループットなin vitroバッチ培養モデルを利用することで、動物実験やヒト臨床試験に依存することなく、マイクロバイオーム調節因子の迅速かつスケールアップ可能なスクリーニングが可能になります。このアプローチは、微生物叢の組成と代謝産物に関する定量的で再現性のあるデータを提供し、候補となる介入策の早期段階におけるリスク低減を支援します。このようなモデルを探索パイプラインに組み込むことで、腸内健康ポートフォリオに向けたプレバイオティクス、プロバイオティクス、および食事由来化合物の評価を加速させることができます。
バイオ医薬品R&Dにおける戦略的応用
初期探索およびターゲットバリデーション
- ヒト由来の微生物コミュニティにおけるマイクロバイオーム調節因子の機能的な解析を可能にします。
- 微生物叢の多様性と代謝活性の変化を定量化することにより、生物学的なリスク低減を支援します。
- さらなる開発に向けた有望な介入策を選択する際の予測的な信頼性を高めます。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 微生物叢の組成に対する介入効果を評価するための、標準化され再現可能なシステムを提供します。
- 比較分析のために、pH、乳酸、および短鎖脂肪酸レベルなどの定量的な出力を生成します。
- 並行ワークフローにおける複数の化合物やレジメンのスケーラブルなスクリーニングをサポートします。
トランスレーショナル・前臨床研究
- in vitroでの知見を疾患に関連するマイクロバイオームシグネチャーと整合させ、トランスレーショナルな連続性を確保します。
- メカニズムおよび代謝のリードアウトに基づき、リスク調整された候補物質の推進を可能にします。
- 介入によって誘導された変化を測定可能なアウトプットに結びつけることで、バイオマーカーの探索を支援します。
パイプラインおよびワークフローの統合
このin vitroバッチ培養モデルは、初期探索とリード化合物同定の境界に位置し、前臨床in vivo試験に先立って実行可能なデータを提供します。
- 探索生物学：マイクロバイオームの変調およびパスウェイへの影響に関する仮説検証をサポートします。
- スクリーニング：介入策の比較に向けた、再現性のある定量的なリードアウトを提供します。
- アナリティクス：微生物叢の組成および代謝シフトの統計解析を可能にします。
- トランスレーショナルリサーチ：代謝および多様性の出力結果に基づき、in vitroでの知見を前臨床検証へと結びつけます。
- エンタープライズ再利用：多様なマイクロバイオーム標的候補の継続的な評価に向けた、再利用可能なプラットフォームを提供します。
運用および企業への影響
- 科学的価値：マイクロバイオームを標的とした探索における予測の信頼性を高め、メカニズム的な曖昧さを低減する。
- 運用的価値：ワークフローを標準化し、スクリーニングキャンペーン全体における再現性を向上させる。
- 戦略的価値：早期に実行可能なデータを提供することで、go/no-go判断および資本配分を改善する。
- ポートフォリオへの影響：リスク調整に基づいたマイクロバイオーム調節剤の優先順位付けを可能にし、開発を推進させる。
実施上の検討事項
- 嫌気性微生物学および無菌操作の専門知識が必要です。
- 嫌気チャンバー、および代謝物やマイクロバイオームのプロファイリング用の分析プラットフォームへのアクセスが必要です。
- サンプルの取り扱いおよびデータ解析において、チーム間での厳格な標準化が必要です。
- ドナーの供給源や介入の種類に応じて、調整が必要になる場合があります。
- 化学試薬による潜在的な危険があるため、安全プロトコルの遵守が必要です。
