Name: 患者の生体流体における腫瘍関連循環DNAの検出とモニタリング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 53 s
Description: 学ぶ デジタルPCRを用いた患者生体流体からの腫瘍関連循環DNA検出法。侵襲性の低いモニタリングにより、治療判断に有用な縦断的分子データを提供する。

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著者は、すべての患者とその家族の寛大さを認めしたいと思います。この研究は、スマッシング・クルミズ財団(ミドルバーグ、VA)、V財団(アトランタ、ジョージア州)、ガブリエラ・ミラー・キッズ・ファースト・データ・リソース・センター、小児国立臨床・翻訳科学研究所()5UL1TR001876-03)、ムセラ財団(ヒューレット、ニューヨーク)、マシューラーソン財団(フランクリンレイク、ニュージャージー州)、小児脳癌研究のためのライラビーン財団(シルバースプリング、MD)、小児脳腫瘍財団(ドイツタウン、MD)、小児脳腫瘍組織コンソーシアム(フィラデルフィア、PA)、および小児がん研究のためのラリー財団(アトランタ、ジョージア州)。

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この原稿に記載されている方法は、ジャワド・ナザリアン&エシニ・パンディタラトナによる国際特許出願「がんバイオマーカーの検出方法」に含まれています。

ここでは、患者の液体生検からcfDNAにおける腫瘍変異のア列周波数を検出・定量化する方法を紹介した。我々は、事前分析サンプル処理、cfDNA抽出、PCRアッセイ設計、データ分析など、この方法の成功のための重要なステップを強調します。使用するサンプル量を制限するために、cfDNAは1mLのプラズマから抽出されますが、CSFの500 μLのみが抽出されます。CSFから抽出する場合、製造業者の勧告に従って、1mLの尿からの抽出のためのプロトコル(cfDNA抽出キットハンドブック12に従って)が使用される。血漿とCSFの間に必要なサンプル体積の違いは、脳腫瘍を有する患者のCSFと比較して血漿中の腫瘍特異的cfDNAのレベルが低いためであり、変異検出のためにより大きなサンプル体積を必要とする8。サンプルが利用可能な場合、より高いDNA収率を生成するためにから1mL以上の血漿を抽出してもよい。しかし、小児患者の場合、放射線治療を受けているがん患者にとっては、血液採取などの簡単な手順でさえ、可能な限り使用される血液量を最小限に抑えることが重要です。プラズマの1 mLアリコートからの抽出は、アッセイを繰り返すことができるように複製抽出を可能にします(例えば、DNA抽出またはサンプル汚染の失敗の場合)。
厳密に必要でないサンプルの使用を減らすために、cfDNAは通常定量されません。しかし、プラズマとCSFでは、それぞれ0.2-2 ng/μLと0.6-13 ng/μLの間のcfDNA濃度の範囲を見出しました。cfDNAの量が少なく、腫瘍特異的変異性アレルが低周波で存在するという事実を考えると、dPCRに使用される同じプライマーを用いたプリ増幅工程は、サンプル中の標的DNAの量を大幅に増加させる必要がある。突然変異検出8.DNA懸濁液バッファーで増幅前の製品を希釈すると、技術的な反復に十分な量を提供し、真陽性の区別に役立ちます。変異液滴の数は少ない場合(例えば、血漿サンプル中の0~2変異液滴の間)、技術的な反復を含めることは、変異状態を解決するための鍵となります。一方のPCRウェルは0個の変異液滴を得ることができますが、他の2つは三量体で分析された単一のプラズマサンプルに対して1-2を得ることができます。したがって、反復を含めることで、突然変異状態を決定する際の精度が向上します。MAF は、反復値の平均として計算されます。
多重化プリ増幅(目的の2つの変異の前増幅ワイルドタイプおよび変異アレル)は、同じ開始材料を使用して2つの変異をテストするために使用することができるので、単一のサンプルの有用性を増加させる。重要なのは、ここで説明するように、多重プリ増幅産物は、dPCR中にシングルプレックスで分析できるため、より簡略化できます。ただし、プリアンプ化 PCR と dPCR の両方が多重化されてもよい。多重化の場合、プライマーとプローブの両方のセットに対して条件を最適化する必要があります:プライマーアニーリング温度はPCR増幅で一緒に実行するように類似する必要があり、プローブは(蛍光シグナルに基づいて)異なるクラスターを生成するように設計する必要があります。強度)。新しいプライマーとプローブのセットを検証する場合は、アニーリング温度勾配を実行して、製造元が提案する範囲に基づいて最適なアニーリング温度を決定します。患者cfDNA標本のプローブをテストする前に、異なる入力(すなわち、最大10ng)の合成DNA構築物および/または腫瘍組織gDNAを使用してそれらを検証します。
標的DNAへのプローブのハイブリダイゼーションにおけるより大きな特異性と減少したミスマッチを伴う変異性アレンの検出のために、ロックされた核酸(LNA)プローブが使用される。LNAは、リボースリング9の2'-酸素と4'-カーボンを接続するメチレンブリッジを持つ核酸アナログです。メチレンブリッジは、柔軟性を制限し、熱二重安定性を高め、DNA10、18を標的とするプローブハイブリダイゼーションの特異性を向上させる堅い二極構造に核酸をロックします。19.LNAプローブとテンプレートDNAの間に単一の塩基不一致が存在する場合、プローブとターゲット間の二重形成は不安定になります。そのため、LNAプローブはプローブ結合の特異性を向上させ、信号対雑音比11を高くする。非CNS病の小児患者からの血漿およびCSFの分析は、H3F3A p.K27Mを標的とするLNAプローブを用いて我々のアッセイの特異性を確立し、0.001%以下のアレール周波数が偽陽性であると判断した。8.GC含有量、アンプリコンサイズ、プローブレポーター染料、およびクエンチャーを含むプローブおよびプライマーの設計を最適化するための追加の考慮事項については、dPCR製造元ガイドライン14,17を参照してください。この方法は RainDance システムでの使用に最適化されていますが、プロトコルは他の dPCR プラットフォームでの使用に適しています。
ここで提示される方法は、cfDNAのまれな腫瘍変異を検出するための選択のプラットフォームであり続けるdPCRによって達成される高感度および標的濃縮から強さを引き出す。強力ですが、dPCRは単一のアッセイでテストできる変異の数に制限されています。dPCRに代わりは、多くの遺伝子にわたって複数の変異を検出し、単一のサンプルの有用性を高める次世代シーケンシング(NGS)です。NGSは、脳幹神経膠腫20を有する患者のCSFおよび血漿中の変異を検出できるが、現在、cfDNAにおける腫瘍変異の検出においてdPCRよりも感受性が低く、検出限界はPCRベースのアプローチ21の0.001%と比較して0.1〜10%MAFである。.dPCRはまたNGSより速いターンアラウンド時間を達成し、目的の突然変異の急速な検出を可能にする。PCRアプローチは、がんの種類にまたがって適用可能であり、ホットスポット変異およびメチル化cfDNA22を検出するために拡張することができる。
液体生検は確かにその幼児期であり、特定の疾患に合わせてさらなる開発が必要になります。腫瘍進化の文脈における腫瘍モニタリングは、高感度で新たな変異を検出できるプラットフォームが必要となる次の課題です。さらに、様々な生体分子(ペプチド、サイトカイン、RNA)を検出できるプラットフォームは、治療に対する腫瘍応答を評価し、パーソナライズされた臨床介入を進める上で非常に有益です。

分子分析のための腫瘍組織の利用可能性の限界のために、血漿、血清および脳脊髄液(CSF)を含む患者の生体流体における腫瘍体細胞変異を検出することができる高感度な方法の開発の必要性がある。.例えば、小児拡散中線神経膠腫(DMG)は、その神経解剖学的位置に起因する課題を提示する。過去10年間にわたり、DMG組織標本の分子プロファイリングは、この腫瘍タイプ1のドライバ変異を明らかにし、変異の空間的および時間的な不均一性を明らかにし、疾患内の患者を特徴付けるのに必要な生検を行った。サブグループと分子標的治療の促進2.したがって、臨床試験は、事前診断3、4、5、6で腫瘍分子プロファイリングのための外科生検を統合することを提唱する。治療中、DMGにおける治療応答のモニタリングはMRIに限られており、小さな変化や腫瘍ゲノムの進化を検出する感受性を欠いている。MRIはまた、疑似進行を検出する傾向があり、画像化上の真の進行を模倣し、腫瘍応答7の誤った解釈を模倣する腫瘍の部位における一過性炎症7。したがって、DMGは、腫瘍変異を検出し、臨床応答を監視する代替的で最小限に侵襲的な手段の必要性が高い腫瘍型を表す。これらのニーズに対応するために、中線神経膠腫8の小児の血漿、血清およびCSFからのcfDNAにおける腫瘍変異を検出し、定量するためのプロトコルを開発し、最適化した。小児期のDMGがしばしばあることを考えると(>80%)ヒストン変異体H3.1(H3.1K27M、症例の20%)またはH3.3(H3.3K27M、症例の60%)の位置にある体性リジン-メチオニン変異を抱えている1、これらおよび他の変異はDMG(すなわち、ACVR1、PIK3R1)に対して特徴的であった。cfDNA8を用いた変異対立遺伝子定量このアッセイは、配列特異的プライマーおよびプローブを使用して他の腫瘍タイプのホットスポット変異を検出するように調整することができる。このアプローチの多様性はcfDNAベースの診断用具および治療的モニタリングの統合から利益を得るさまざまな癌に適用可能にする。
cfDNAの低ア列周波数変異を敏感に検出するために、液滴デジタルPCR(dPCR)ベースのアプローチを採用しています。この方法では、PCR反応混合物は、dPCRプラットフォーム(例えば、RainDance)を使用して理論上最大1,000万液滴に分割され、PCR当たり7〜900万滴が実験的によく見られる。サンプルのパーティショニングの度合いが高いため、各液滴には、せいぜい1~2個のDNA分子しか存在できません。PCR増幅および配列特異的蛍光プローブハイブリダイゼーションは、数百万の反応が起こるように、各液滴で起こりうる。これは感受性を最大にし、そうでなければ野生型DNAの背景に対して検出されないかもしれないまれな変異性ア列の検出を可能にする。ロックされた核酸(LNA)プローブの利用は、不一致のハイブリダイゼーションを制限し、正確な変異検出9、10、11をサポートすることにより、アッセイの特異性を高めます。ここでは、サンプル処理、cfDNA抽出、標的アレルのプリアンプ化、dPCRおよびデータ解析の方法について説明します。

<table><tbody><tr><td>10 mM Tris-HCl、0.1 mM EDTA DNA 懸濁液バッファー (pH 8.0)</td><td>Teknova</td><td>T0227</td><td></td></tr><tr><td>BD Vacutainer K2-EDTA 7.2 mg 採血チューブ (10 mL)</td><td>Becton Dickinson Diagnostics</td><td>367525</td><td>血漿採取用</td></tr><tr><td>BD Vacutainer プラスチック血清チューブ、赤色 BD ヘモガード クロージャー付き (10 mL)</td>ベ<td>クトン ディッキンソン ダイアグノスティック</td>ス <td>367895</td><td>血清採取用</td></tr><tr><td>漂白剤</td><td>一般ラボサプライヤー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>バッファー ATL</td><td>Qiagen</td><td>19076</td><td></td></tr><tr><td>無細胞 DNA 採血チューブ</td><td>Streck</td><td>218961</td><td>cfDNA 採血チューブ (オプション)</td></tr><tr><td>CentriVap コンセントレーター</td><td>Labconco</td><td>7810010</td><td></td></tr><tr><td>Forward Primer</td><td>Integrated DNA Technologies, Inc.</td><td></td><td>カスタムデザイン</td></tr><tr><td>MiniAmpサーマルサイクラー</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>A37834</td><td></td></tr><tr><td>分子生物学グレード無水エタノール(200プルーフ)</td><td>一般的なラボサプライヤー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ミュータントプローブ統合</td><td>DNAテクノロジーズ株式会社</td><td></td><td>カスタムデザイン</td></tr><tr><td>PAXgene血液ccfDNAチューブ</td><td>PreAnalytiX</td><td>768115</td><td>cfDNA採血チューブ(オプション)</td></tr><tr><td>PCR 8ウェルストリップチューブキャップ</td><td>VWR</td><td>10011-786</td><td></td></tr><tr><td>PCR 8ウェルストリップチューブ</td><td>Axygen</td><td>PCR-0208-C</td><td></td></tr><tr><td>ピペット(p20、p200、p1000)</td><td>一般ラボサプライヤー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ピペットフィルターチップ(p20、p200、p1000)</td><td>一般的なラボサプライヤーQ5</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ホットスタートハイファイ2xマスターミックス</td><td>ニューイングランドバイオラボ株式会社</td><td>M0494S</td><td></td></tr><tr><td>QIAamp循環核酸ハンドブック&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td></td><td>cfDNA抽出キットハンドブック(2013年版)</td></tr><tr><td>QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit</td><td>Qiagen</td><td>55114</td><td>cfDNA抽出キット(プロトコールステップ4)&nbsp;</td></tr><tr><td>QIAamp MinEluteウイルススピンキット</td><td>Qiagen</td><td>57704</td><td>小さな(<または=200 &micro;L) サンプル量</td></tr><tr><td>Qiavac 24 Plus</td><td>Qiagen</td><td>19413</td><td>QIAamp Circulating Nucleic Acids キットで使用するため</td></tr><tr><td>Raindance 消耗品キット</td><td>Bio-Rad</td><td>20-04411</td><td>液滴発生装置チップ、定量装置チップ、高速キャップを含む PCR ストリップキャップ、液滴安定化オイル</td></tr><tr><td>Raindance Sense 装置</td><td>バイオ・ラッド</td><td></td><td>定量装置 (プロトコールステップ9)</td></tr><tr><td>Raindanceソース機器</td><td>Bio-Rad</td><td></td>液<td>滴発生装置(プロトコールステップ9で使用)</td></tr><tr><td>RainDrop Analyst IIソフトウェア</td><td>RainDance Technologies</td><td></td><td>アナリストデータ解析用ソフトウェア(プロトコールステップ10)</td></tr><tr><td>冷蔵蒸気トラップ</td><td>Savant</td><td>RVT5105-115</td><td></td></tr><tr><td>Reverse Primer</td><td>Integrated DNA Technologies, Inc.</td><td></td><td>カスタムデザイン</td></tr><tr><td>Smartblock 2 mL</td><td>Eppendorf</td><td>05 412 506</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Genotyping Master Mix</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>4371353</td><td></td></tr><tr><td>Thermomixer C</td><td>Eppendorf</td><td>14 285 562PM</td><td></td></tr><tr><td>WT Probe</td><td>Integrated DNA Technologies, Inc.</td><td></td><td>カスタムデザイン</td></tr></tbody></table>

患者の生体流体における腫瘍関連循環dnaの検出とモニタリング

Detection and Monitoring of Tumor Associated Circulating DNA in Patient Biofluids

前頭部および繰り返し外科組織サンプリングに関連する合併症は、治療に対する腫瘍応答の分子サブ分類および時間的モニタリングが可能な最小限に侵襲的なプラットフォームの必要性を提示する。ここでは、患者の生体流体で容易に利用できる細胞外DNA(cfDNA)における腫瘍体細胞変異の検出のためのdPCRベースの方法について説明する。各アッセイでテストできる変異の数は限られていますが、この方法は高いレベルの感度と特異性を提供します。MAFによって計算された突然変異の豊富さのモニタリングは、治療に対する腫瘍応答の評価を可能にし、それによって放射線画像に非常に必要なサプリメントを提供する。

図1は、DMGを有する2人の小児からの予め増幅された血漿(左上パネル)およびCSF(右上パネル)cfDNAにおけるH3F3A p.K27M変異の正常な検出に関する代表的な結果を示す。cfDNAサンプルを反復で分析したが、サンプルタイプごとに1つの代表的なグラフのみが示されている。dPCRプロットは、PCR当たり7〜900万滴(そのほとんどは標的DNAを含まない負の液滴)で、液滴生成が成功したことを示しています。PCRあたりの最小700万滴は、液滴化が成功したことを示し、700万未満はアッセイの失敗を示し、その場合、ユーザーはデータ分析を進めるべきではない。図 1は、それぞれ x 軸と Y 軸に沿った変異型クラスターとワイルドタイプ クラスターの明確な分離を示しています。堅牢な野生型クラスターは、テンプレートDNAが存在するため、cfDNA抽出が成功したことを示しています。変異クラスターは、プラズマおよびCSFサンプルに対してそれぞれ1.60%および39.92%のMAFを示し、変異の陽性検出を実証する。これらの患者に対して、dPCR結果は、腫瘍変異状態に従って、生検腫瘍組織8のゲノム解析によって確認される。陰性対照(左下パネル)は、0変異体および0野生型液滴を示し、PCR反応混合物の汚染が無かっていることを示す。陽性対照腫瘍組織gDNA(右下パネル)は、選択された特定の腫瘍試料に対する期待されるアレルギー周波数で検出されている変異を示す。
図2では、DMGを有する小児からの血漿cfDNAにおける目的の変異、H3F3A p.K27Mの検出に失敗した代表的な結果が示されている。 腫瘍組織8のゲノム解析により変異状態を確認した。2つの複製PCRウェルからの代表的な結果が示されている(トップパネル)。負の液滴を含む液滴の総数は、PCR当たり7〜900万個の間であり、液滴化が成功したことを示している。Y軸に沿ってプロットされた野生型クラスターは、血漿cfDNAに対してPCR当たり約7〜8,000個の野生型液滴を示し、cfDNA抽出に成功した(サンプル中に標的野生型DNAがあるので)。しかし、プラズマサンプルでは0つの変異液滴が検出されます。左下のパネルには、ワイルドタイプまたは変異液滴のない負のコントロール(MB H2O)が表示されます。そして右下のパネルは肯定的な突然変異の検出と陽性の制御前増幅腫瘍組織gDNA(0.025 ng)を示す。この図に示すように、血漿中の変異検出の欠如は、必ずしも患者が目的の変異に対して野生型であることを意味するわけではなく、偽陰性が8が生じる。場合によっては、先行生検で採取された血漿中に変異が見逃されると、後の時点で同じ患者から得られた血漿中で検出される。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59721/59721fig1v2.jpg"> 図 1: の検出に成功H3F3A中線神経膠腫の小児からの予め増幅された血漿およびCSF cfDNAにおけるp.K27M変異。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59721/59721fig1v2large.jpg" target="_blank">この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59721/59721fig2.jpg"> 図 2: 目的の変異を抱えることを知っている患者からの予知血漿cfDNAサンプルの分析から得られた偽陰性結果、H3F3A腫瘍内のp.K27M。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59721/59721fig2large.jpg" target="_blank">この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>

ここでは、患者の生体液(生体流体)に存在する循環DNAにおける腫瘍体細胞変異を検出するプロトコルを提示する。当社の液滴デジタルポリメラーゼ連鎖反応(dPCR)ベースの方法は、腫瘍変異アレーリン周波数(MAF)の定量化を可能にし、腫瘍応答の診断および時間的モニタリングに最小限に侵襲的な補体を促進する。

患者の生体流体における腫瘍関連循環DNAの検出とモニタリング

Complications associated with upfront and repeat surgical tissue sampling present the need for minimally invasive platforms capable of molecular ...

このプロトコルは、腫瘍関連の突然変異の検出を可能にし、現在侵襲的な外科的処置を補完する。もう一つの強みは、このプロトコルを使用して腫瘍突然変異負荷を残業時間で監視する能力である。この技術は、組織へのアクセスが制限された脳幹のような困難な場所の腫瘍に特に役立つ実際の外科組織生検を必要とせずに腫瘍ジェノタイピングを可能にする。繰り返し生検がない場合、縦方向の分子データはMRIを補完することはできません。デジタルPCRモニタリングは、診断に対する分子ベースのサプリメントを容易にし、より多くの情報に基づいた治療意思決定プロセスを可能にします。同様の方法は、従来のFluo-4およびクエンチャー結合プローブを用いて、定量PCRよりも高い感度を有する、特定の系における遺伝子の発現を検出するために使用することができる。液滴デジタルPCR手順を開始する前に、ベンチスペースと装置を10%漂白剤と70%エタノールで洗浄し、液滴安定化油を除くすべての試薬を穏やかに渦巻き、短く遠心分離します。圧縮窒素ガスボンベが液滴発生装置に取り付けられていること、およびシリンダータンクが1平方インチあたり90ポンドに設定されていることを確認します。そして、38マイクロリットルのデジタルPCR反応混合物を8つのウェルPCRチューブストリップの各ウェルの底部に直接入れ、きれいなピペットチップを持つ泡を取り除きます。チューブストリップの適切なウェルに3重に増幅されたDNAサンプルの12マイクロリットルを追加します。全容を10回軽くピペット化し、反応混合物をDNAサンプルと混合し、各ウェルからフルボリュームを液滴発生器用チップの対応するA~Hチャンネルにピペットします。新しいPCRチューブストリップを液滴生成機器に挿入し、インストルメントコンピュータ上のソフトウェアにインストルスト生成器チップIDをスキャンします。次に、[実行を開始] をクリックしてサンプルのドロップレットを開始します。液滴分解が完了したら、PCRチューブストリップを取り除き、チューブストリップキャップを適用します。チューブストリップをサーマルサイクラーに移し、チューブを井戸あたり80マイクロリットルの水を含む別のチューブストリップとバランスを取ります。次に、適切なサーマルサイクル条件下でサーマルサイクラーを実行します。ストリップキャップを高速キャップに交換してください。サーマルサイクリングが完了したら、チューブストリップを定量化機器に移し、計測器ソフトウェアで「実行を設定」をクリックし、チューブストリップを定量装置に挿入します。新しい定量計測器チップの上に金属シールドを置き、チップIDを機器にスキャンしてチップを機械に挿入します。楽器のふたを閉じます。コンピューターソフトウェアで、デジタル PCR 実行の名前と 8 つのチャンネルのそれぞれに名前を入力し、高速モードを選択して[開始]をクリックして定量を開始します。生スペクトルデータを分析するには、アナリストソフトウェアを起動し、fcsファイルを開きます。[解析ビュー] で、そのまま選択します。サンプル ビューで、8 つのサンプルの横にあるボックスをクリックします。ソフトウェアは、それぞれxとy軸に沿って変異型と野生型対立体の信号をプロットします。計算されたマトリックス関数を使用して、メーカーのインストラクターに従って、無傷の液滴のスペクトル補正を適用し、軸オプションの軸の下で軸の設定を調整します。X 軸を最小値の 0、最大値 30,000、y 軸を最小値から 5,000、最大値 10,000 に設定します。液滴クラスタが特定されたら、軸を調整してグラフの空き領域を減らします。陽性対照腫瘍組織ゲノムDNAに対応するサンプルを選択して、陰性変異体および野生型のゲートを設定し、クラスターが明確かつ容易に同定されるようにする。次に、右クリックして[選択したサンプルにすべての設定を適用]を選択し、正のコントロールのゲート設定をすべてのサンプルに適用します。グラフィック表示の下で複数のサンプルをクリックして、選択したすべてのサンプルのプロットを表示し、画像を tif ファイルとして書き出します。次に、[ワークスペース] で [分析のエクスポート] を選択し、分析したデータ ファイルを csv ファイルとして保存します。ここで、びまん性正中性神経膠腫を有する2つの小児からの、前増幅された血漿および脳脊髄液細胞遊離DNAにおける突然変異の検出に成功した代表的な結果が示されている。本実験では、それぞれx軸とy軸に沿って変異型クラスターと野生型クラスター間の明確な分離を観察することができる。堅牢な野生型クラスターは、テンプレートDNAが存在するため、細胞の無細胞DNA抽出が成功したことを示す。これらの患者に対して、変異体クラスターは、生検された腫瘍組織のゲノム解析によって確認された腫瘍突然変異状態に従って、それぞれ血漿および脳脊髄液サンプルに対して1.6および39.32%の変異アレル頻度を示す。一方、負の対照は、PCR反応混合物の汚染が存在していないことを示す変異体ゼロおよびゼロ野生型液滴を示す。陽性対照腫瘍組織ゲノムDNAは、選択された特定の腫瘍試料について予想されるアレクトリス頻度で検出される突然変異を示す。血漿中の突然変異検出の欠如は、患者が偽陰性が起こるように目的の突然変異のための野生型であることを意味する可能性があります。例えば、この患者では、目的の変異は検出されなかったが、腫瘍組織のゲノム解析により変異状態が確認された。PCR は、誤検知データの取得を避けるために作業領域と機器の頻繁な除染を要求する非常に敏感な技術です。

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Research

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がん研究

プロトコルは、ポリ（N -iso-プロピル）効果的な捕獲、生存循環腫瘍細胞（CTC）の熱応答性放出のための（PIPAAm）コーティングされたマイクロフィルター提示さを利用します。この方法は、患者の血液と下流オフチップの文化のための実行可能なCTCの今後のリリースからのCTCの捕獲を可能に分析し、特性評価。...

キャプチャと血液から生存循環腫瘍細胞のリリース

本稿では葉緑体 ER 以下の低頻度の変異を検出するための手法を説明しますこのメソッドは、2 方向エラー訂正、特別なバック グラウンド...

次世代シーケンシングによる葉緑体の稀な遺伝子変異の検出

このプロトコルは、回復し、単一細胞レベルの分子遺伝学的解析の非対象の背景セルの混合物から珍しいターゲット セルを準備することです。DNA の品質は非処理の単一細胞であるし、により、単一セルに適用 (両方のスクリーニング...

単一のセル下流解析のターゲット細胞前濃縮と全体のゲノム増幅

腫瘍細胞の特徴への新しいアプローチを提案します。我々 は DNA 蛍光-原と蛍光を組み合わせる-機能性医療用ワイヤー線の生体内でCtc...

循環腫瘍細胞を取り込むため医療用ワイヤー線を用いた腫瘍細胞の特性解析: 蛍光抗体法や DNA 魚に基づく 3 D アプローチ

リボ核酸 (cRNA) 血液からを循環の検出は、臨床診断で満たされていない必要性です。ここで我々 は非小細胞肺癌患者特異的かつ高感度デジタル ポリメラーゼ連鎖反応を使用してから cRNA を特徴付ける方法を説明します。テストは、72...

血液ベース ROS1 の検出のためのテストし、デジタル ポリメラーゼ連鎖反応を使用してリボ核酸を循環から融合の成績証明書を RET

がん患者からの血漿サンプル マイクロ Rna (Mirna) の循環の表現のレベルを評価するためのプロトコルを提案します。特に、マイクロ Rna 抽出および逆のトランスクリプションを循環させるため市販のキットを使用しました。最後に、斑点を付けられた前のリアルタイム プローブ カスタム プレートを使用して 24 選択した Mirna...

転移性大腸癌患者における循環マイクロ Rna カスタム パネルの検出

本論文では、非侵襲的な液体生検法の詳細なプロトコルを紹介し、血液採取、血漿およびバフィーコート分離、cfDNAおよび生殖系列DNA抽出、cfDNAまたは生殖系列DNAの定量、cfDNA断片濃縮分析を含む。...

がん患者の血漿サンプルにおける無細胞DNAの検出

リキッドバイオプシーは、腫瘍学のトランスレーショナル研究へのアプローチに革命をもたらし、サンプルの収集、品質、および保管は、臨床応用を成功させるための重要なステップです。ここでは、ほとんどのトランスレーショナルリサーチラボで適用できる、下流の循環のないDNAアプリケーションのための標準化され検証されたプロトコルについて説明します。...

下流循環フリーDNAアプリケーションのための標準化されたリキッドバイオプシー前分析プロトコル

本稿では、全血から無細胞DNAや循環腫瘍細胞などの物質を簡便かつ効率的に分離・回収するための自動化装置の適用について述べる。...

臨床検体からのがん関連物質の自動分離・回収

マイクロ流体ベースのハイスループット循環腫瘍細胞選別およびシングルセルシーケンシング技術

学ぶ デジタルPCRを用いた患者生体流体からの腫瘍関連循環DNA検出法。侵襲性の低いモニタリングにより、治療判断に有用な縦断的分子データを提供する。

患者の生体流体における腫瘍関連循環DNAの検出とモニタリング

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