患者の生体流体における腫瘍関連循環DNAの検出とモニタリング
June 8th, 2019
ここでは、患者の生体液(生体流体)に存在する循環DNAにおける腫瘍体細胞変異を検出するプロトコルを提示する。当社の液滴デジタルポリメラーゼ連鎖反応(dPCR)ベースの方法は、腫瘍変異アレーリン周波数(MAF)の定量化を可能にし、腫瘍応答の診断および時間的モニタリングに最小限に侵襲的な補体を促進する。
このプロトコルは、腫瘍関連の突然変異の検出を可能にし、現在侵襲的な外科的処置を補完する。もう一つの強みは、このプロトコルを使用して腫瘍突然変異負荷を残業時間で監視する能力である。この技術は、組織へのアクセスが制限された脳幹のような困難な場所の腫瘍に特に役立つ実際の外科組織生検を必要とせずに腫瘍ジェノタイピングを可能にする。
繰り返し生検がない場合、縦方向の分子データはMRIを補完することはできません。デジタルPCRモニタリングは、診断に対する分子ベースのサプリメントを容易にし、より多くの情報に基づいた治療意思決定プロセスを可能にします。同様の方法は、従来のFluo-4およびクエンチャー結合プローブを用いて、定量PCRよりも高い感度を有する、特定の系における遺伝子の発現を検出するために使用することができる。
液滴デジタルPCR手順を開始する前に、ベンチスペースと装置を10%漂白剤と70%エタノールで洗浄し、液滴安定化油を除くすべての試薬を穏やかに渦巻き、短く遠心分離します。圧縮窒素ガスボンベが液滴発生装置に取り付けられていること、およびシリンダータンクが1平方インチあたり90ポンドに設定されていることを確認します。そして、38マイクロリットルのデジタルPCR反応混合物を8つのウェルPCRチューブストリップの各ウェルの底部に直接入れ、きれいなピペットチップを持つ泡を取り除きます。
チューブストリップの適切なウェルに3重に増幅されたDNAサンプルの12マイクロリットルを追加します。全容を10回軽くピペット化し、反応混合物をDNAサンプルと混合し、各ウェルからフルボリュームを液滴発生器用チップの対応するA~Hチャンネルにピペットします。新しいPCRチューブストリップを液滴生成機器に挿入し、インストルメントコンピュータ上のソフトウェアにインストルスト生成器チップIDをスキャンします。
次に、[実行を開始] をクリックしてサンプルのドロップレットを開始します。液滴分解が完了したら、PCRチューブストリップを取り除き、チューブストリップキャップを適用します。チューブストリップをサーマルサイクラーに移し、チューブを井戸あたり80マイクロリットルの水を含む別のチューブストリップとバランスを取ります。
次に、適切なサーマルサイクル条件下でサーマルサイクラーを実行します。ストリップキャップを高速キャップに交換してください。サーマルサイクリングが完了したら、チューブストリップを定量化機器に移し、計測器ソフトウェアで「実行を設定」をクリックし、チューブストリップを定量装置に挿入します。
新しい定量計測器チップの上に金属シールドを置き、チップIDを機器にスキャンしてチップを機械に挿入します。楽器のふたを閉じます。コンピューターソフトウェアで、デジタル PCR 実行の名前と 8 つのチャンネルのそれぞれに名前を入力し、高速モードを選択して[開始]をクリックして定量を開始します。
生スペクトルデータを分析するには、アナリストソフトウェアを起動し、fcsファイルを開きます。[解析ビュー] で、そのまま選択します。サンプル ビューで、8 つのサンプルの横にあるボックスをクリックします。
ソフトウェアは、それぞれxとy軸に沿って変異型と野生型対立体の信号をプロットします。計算されたマトリックス関数を使用して、メーカーのインストラクターに従って、無傷の液滴のスペクトル補正を適用し、軸オプションの軸の下で軸の設定を調整します。X 軸を最小値の 0、最大値 30,000、y 軸を最小値から 5,000、最大値 10,000 に設定します。
液滴クラスタが特定されたら、軸を調整してグラフの空き領域を減らします。陽性対照腫瘍組織ゲノムDNAに対応するサンプルを選択して、陰性変異体および野生型のゲートを設定し、クラスターが明確かつ容易に同定されるようにする。次に、右クリックして[選択したサンプルにすべての設定を適用]を選択し、正のコントロールのゲート設定をすべてのサンプルに適用します。
グラフィック表示の下で複数のサンプルをクリックして、選択したすべてのサンプルのプロットを表示し、画像を tif ファイルとして書き出します。次に、[ワークスペース] で [分析のエクスポート] を選択し、分析したデータ ファイルを csv ファイルとして保存します。ここで、びまん性正中性神経膠腫を有する2つの小児からの、前増幅された血漿および脳脊髄液細胞遊離DNAにおける突然変異の検出に成功した代表的な結果が示されている。
本実験では、それぞれx軸とy軸に沿って変異型クラスターと野生型クラスター間の明確な分離を観察することができる。堅牢な野生型クラスターは、テンプレートDNAが存在するため、細胞の無細胞DNA抽出が成功したことを示す。これらの患者に対して、変異体クラスターは、生検された腫瘍組織のゲノム解析によって確認された腫瘍突然変異状態に従って、それぞれ血漿および脳脊髄液サンプルに対して1.6および39.32%の変異アレル頻度を示す。
一方、負の対照は、PCR反応混合物の汚染が存在していないことを示す変異体ゼロおよびゼロ野生型液滴を示す。陽性対照腫瘍組織ゲノムDNAは、選択された特定の腫瘍試料について予想されるアレクトリス頻度で検出される突然変異を示す。血漿中の突然変異検出の欠如は、患者が偽陰性が起こるように目的の突然変異のための野生型であることを意味する可能性があります。
例えば、この患者では、目的の変異は検出されなかったが、腫瘍組織のゲノム解析により変異状態が確認された。PCR は、誤検知データの取得を避けるために作業領域と機器の頻繁な除染を要求する非常に敏感な技術です。
概要
このプロトコルは、患者の生体液からの循環DNAの腫瘍関連変異の検出を可能にし、外科的生検に代わる最小侵襲的な選択肢を提供します。これは、アクセスが困難な場所の腫瘍の変異負荷を時間とともにモニタリングすることを可能にし、特に有益です。
主要な研究構成要素
科学分野
- 腫瘍学
- ゲノミクス
- 分子生物学
背景
- 腫瘍変異の検出は診断と治療に不可欠です。
- 従来の生検は侵襲的で、特定の腫瘍にとっては困難な場合があります。
- 腫瘍変異負荷のモニタリングは治療決定に役立ちます。
- デジタルPCRは従来の方法と比較して高い感度を提供します。
研究目的
- 生体液中の腫瘍体細胞変異を検出するためのプロトコルを提示すること。
- 腫瘍反応をモニタリングするための非侵襲的手法を容易にすること。
- 外科的組織生検の信頼できる代替手段を提供すること。
使用された方法
- 変異アレル頻度を定量化するためのドロップレットデジタルPCR（dPCR）。
- dPCR分析のための試薬とサンプルの準備。
- PCR産物の熱サイクリングと定量化。
- 変異体および野生型アレルを特定するための特殊ソフトウェアを使用したデータ分析。
主な結果
- 血漿と脳脊髄液サンプルにおける変異の成功的な検出。
- 1.6%と39.32%の変異アレル頻度が観察されました。
- データ分析における変異体と野生型クラスターの明確な分離。
- ネガティブコントロールで汚染がなく、アッセイの信頼性が確認されました。
結論
- このプロトコルは腫瘍変異検出のための感度の高い方法を提供します。
- 腫瘍のダイナミクスの経時的なモニタリングを可能にします。
- 偽陰性が発生する可能性があり、包括的な分析の必要性を強調します。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Digital PCR-based detection of tumor-associated mutations in circulating cell-free DNA enables minimally invasive molecular monitoring, addressing the limitations of repeat surgical biopsies. This approach enhances predictive confidence in assessing tumor response and supports more informed, real-time treatment decisions. Integration of such liquid biopsy platforms into discovery and translational pipelines can accelerate risk-adjusted portfolio advancement, especially for tumors with restricted tissue access.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables molecular sub-classification of tumors through non-invasive genotyping.
- Supports functional target validation by tracking mutation dynamics over time.
- Facilitates biological de-risking in challenging anatomical contexts.
Screening & Assay Development
- Provides validated cfDNA-based assays for mutation detection in biofluids.
- Delivers high sensitivity and specificity for quantitative mutation analysis.
- Enables reproducible, scalable workflows for longitudinal sample monitoring.
Translational & Preclinical Research
- Aligns molecular monitoring with radiographic imaging for comprehensive response assessment.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by enabling serial sampling.
- Reduces reliance on invasive procedures, improving patient-centric study designs.
Pipeline & Workflow Integration
This dPCR-based cfDNA detection method fits within the continuum from early discovery to translational research, supplementing imaging and tissue-based diagnostics.
- Discovery Biology: Provides quantitative mutation data to test therapeutic hypotheses and clarify tumor biology.
- Screening: Offers assay-ready, reproducible outputs for mutation tracking in patient-derived samples.
- Analytics: Generates mutation allelic frequency (MAF) data for comparative analysis across timepoints and conditions.
- Translational Research: Enables molecular monitoring to inform preclinical and clinical decision-making.
- Enterprise Reuse: Establishes a platform technology adaptable to multiple tumor types and biofluid sources.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in tumor response assessment.
- Operational Value: Standardizes minimally invasive workflows and supports high-throughput sample processing.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk by enabling real-time molecular monitoring.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of therapeutic candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in digital PCR assay design and data interpretation.
- Demands access to specialized instrumentation for droplet generation and quantification.
- Necessitates rigorous contamination control and cross-team standardization.
- May require adaptation for different tumor types or biofluid matrices.
- Limited by the number of mutations detectable per assay, as supported by the protocol.
