Name: プログラマブル出力周波数を備えた自作ボルトアンペメーターを用いてTEER測定を行う簡単なアプローチ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 43 s
Description: 学ぶ、上皮細胞単層のバリア機能評価のための経上皮電気インピーダンス測定法。自作プログラマブルボルトアンペメーターとチョップスティック電極を用いて、コスト効率の良い信頼性の高い測定システムを構築する方法を解説します。

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著者らは、ヘルマン・リッジスマイヤーとマーヴィン・ベンデに、電気技術と情報学に関する専門家のアドバイスに感謝したいと思います。

1. TEER測定のための基本的なボルトアンペメーターのアセンブリ
<ol><li>5 V D.C.電源、USB 延長コード、プログラム可能な正方形波ジェネレータとして使用されるマイクロコントローラ、2 つの標準マルチメータとして標準の USB 充電器を準備し、電流と電圧をルート平均平方として測定できます(True-RMS)、バナナプラグ付き4本のケーブル、内側4本有線(6P4C)を備えた6本のピンを含むRJ14メスコネクタを備えた内線コード、2本の短いケーブル、光沢端子、120 kΩプリ抵抗器、ワイヤエンドフェルール、およびはんだ付けラグ。必要なツールは、絶縁ストリッパー、圧着ツール、およびはんだ付け鉄です。</li>
	<li>まず、USB拡張機能をマイクロコントローラボードに接続します。</li>
	<li>2本の短いケーブルの端絶縁を取り除きます。ケーブルごとに片面をマイクロコントローラのピン0と2に直接、またははんだ付けラグに向けます。もう一方の端をワイヤエンドフェルールに圧着し、図 1に示すように光沢端子に接続します。</li>
	<li>バナナプラグをマルチメーターにリンクします。4 本のケーブルのもう一方の端を取り除き、圧着します。</li>
	<li>内線コードを2枚切り、メスコネクタを含む側の導体を解体し、圧着します。導体とピンの連続性を確認します。</li>
	<li>最初のマルチメータは、μAで電流を測定するために使用されます(ACモードを明示的に設定する必要があります)。箸電極の外側の電極ペアに対応するRJ14コネクタの5と6をピンに120 kΩプリ抵抗を持つシリーズで接続します。</li>
	<li>最後に、mVにおける経上皮電圧降下を測定するために使用される第2のマルチメータをリンクし、光沢端子を介してRJ14コネクタの3および4をピンにし、箸電極の内部電極対に対応する。</li>
	<li>必要に応じて、シャーシに取り付けます。</li>
</ol>2. マイクロコントローラのプログラミング
<ol><li>必要に応じて、提供されたソース コード (補足コード ファイル 1) を変更します。指定された形式では、ピン 0 と 2 は、振動の 40 ミリ秒の半分の時間で地面と +5 V の間で交互になります。これにより、振幅5V、周波数約12.5Hzの正方形波信号が発生します。実際の値は、マイクロコントローラのタイムエミッタの精度が不正確なため、異なる場合があります。</li>
	<li>USBポートを介してデスクトップコンピュータにマイクロコントローラを接続し、一致するソフトウェア25でソースコードをアップロードします。</li>
</ol>3. 電圧オシログラムの記録(オプション)
<ol><li>1 kΩテスト抵抗を備えたRJ14コネクタの5と6ピンをバイパスし、オシロスコープに接続します。</li>
	<li>周波数、ピーク電圧、波形を確認します。データをデジタル化およびエクスポートします。</li>
	<li>必要に応じて、比較のために参照装置(EVOM)と自己組み立てボルタンメータからオシログラムを記録します。 注:この場合、データはデジタル記憶域スコープHM 208で記録された。非常に基本的なデジタルオシロスコープである、画像は内部的にデジタル化(凍結)することができましたが、アナログPM 8143 X-Yレコーダーを使用してプロットする必要があります。その後、画像がスキャンされました。</li>
</ol>4. 細胞培養とTEER測定
<ol><li>細胞培養フィルター上の種子ヒトコロイド叢パピローマ(HIBCPP)細胞は、10%の胎児子牛血清9を含有するDMEM/F12(材料の表を参照)で3μmの細孔サイズの挿入物を挿入する。Dinner etal.9. で説明したように、5% CO2を含む水飽和雰囲気で 37 °C で細胞を成長させる。</li>
	<li>フィルタが 70 Ω ∙ cm2のインピーダンスに達すると、血清フリーの DMEM/F12 に変更し、タイムポイントを 0 日目として定義します。</li>
	<li>電極を自己組み立てボルタンメータのRJ14ポートに接続し、USB電源を差し込みます。マルチメータをそれぞれAC電圧モード(mV)とAC電流モード(μA)に設定します。<ol>
<li>または、電極を市販のリファレンスデバイスに接続し、製造元の指示に従って電源を入れます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>80%エタノールで電極を10分間殺菌し、別の10分間適切な培地で平衡化する。</li>
	<li>測定値が一定になるまでHIBCPPセル層を含むセル培養フィルタ挿入システムの両方のコンパートメント(下部区画の電極の長い部分と上部のコンパートメントの短い部分)に電極を入れます。</li>
	<li>リファレンスデバイスの場合は、インピーダンスを直接メモするか、自己組み立てボルタンメータのオームの法則(R = U/I)に従ってインピーダンスを計算します。電極角度は測定に影響を与えます。</li>
	<li>0 日目から 4 日目まで、TEER 測定 (手順 3-6) を繰り返します。</li>
</ol>

<ol><li>Matter, K., Balda, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+analysis+of+tight+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Functional analysis of tight junctions.</a> Methods. 30, 228-234 (2003).</li>
<li>Srinivasan, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TEER+measurement+techniques+for+in+vitro+barrier+model+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Laboratory+Automation%22%5BJournal%5D)">TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems.</a> Journal of Laboratory Automation. 20, 107-126 (2015).</li>
<li>Daniels, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immortalized+human+cerebral+microvascular+endothelial+cells+maintain+the+properties+of+primary+cells+in+an+in+vitro+model+of+immune+migration+across+the+blood+brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Immortalized human cerebral microvascular endothelial cells maintain the properties of primary cells in an in vitro model of immune migration across the blood brain barrier.</a> Journal of Neuroscience Methods. 212, 173-179 (2013).</li>
<li>Weksler, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-brain+barrier-specific+properties+of+a+human+adult+brain+endothelial+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Federation+of+American+Societies+for+Experimental+Biology+Journal%22%5BJournal%5D)">Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line.</a> Federation of American Societies for Experimental Biology Journal. 19, 1872-1874 (2005).</li>
<li>Lippmann, E. S., Al-Ahmad, A., Azarin, S. M., Palecek, S. P., Shusta, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+retinoic+acid-enhanced%2C+multicellular+human+blood-brain+barrier+model+derived+from+stem+cell+sources%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A retinoic acid-enhanced, multicellular human blood-brain barrier model derived from stem cell sources.</a> Scientific Reports. 4, 4160(2014).</li>
<li>Stins, M. F., Badger, J., Sik Kim, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+invasion+and+transcytosis+in+transfected+human+brain+microvascular+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Pathogenesis%22%5BJournal%5D)">Bacterial invasion and transcytosis in transfected human brain microvascular endothelial cells.</a> Microbial Pathogenesis. 30, 19-28 (2001).</li>
<li>Muruganandam, A., Herx, L. M., Monette, R., Durkin, J. P., Stanimirovic, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+immortalized+human+cerebromicrovascular+endothelial+cell+line+as+an+in+vitro+model+of+the+human+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Federation+of+American+Societies+for+Experimental+Biology+Journal%22%5BJournal%5D)">Development of immortalized human cerebromicrovascular endothelial cell line as an in vitro model of the human blood-brain barrier.</a> Federation of American Societies for Experimental Biology Journal. 11, 1187-1197 (1997).</li>
<li>Ishiwata, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+characterization+of+a+human+malignant+choroids+plexus+papilloma+cell+line+%28HIBCPP%29%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Cell%22%5BJournal%5D)">Establishment and characterization of a human malignant choroids plexus papilloma cell line (HIBCPP).</a> Human Cell. 18, 67-72 (2005).</li>
<li>Dinner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Choroid+Plexus+Epithelial+Cell-based+Model+of+the+Human+Blood-Cerebrospinal+Fluid+Barrier+to+Study+Bacterial+Infection+from+the+Basolateral+Side%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A Choroid Plexus Epithelial Cell-based Model of the Human Blood-Cerebrospinal Fluid Barrier to Study Bacterial Infection from the Basolateral Side.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2016).</li>
<li>Schwerk, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polar+invasion+and+translocation+of+Neisseria+meningitidis+and+Streptococcus+suis+in+a+novel+human+model+of+the+blood-cerebrospinal+fluid+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Polar invasion and translocation of Neisseria meningitidis and Streptococcus suis in a novel human model of the blood-cerebrospinal fluid barrier.</a> PLoS One. 7, e30069(2012).</li>
<li>Tenenbaum, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polar+bacterial+invasion+and+translocation+of+Streptococcus+suis+across+the+blood-cerebrospinal+fluid+barrier+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Polar bacterial invasion and translocation of Streptococcus suis across the blood-cerebrospinal fluid barrier in vitro.</a> Cellular Microbiology. 11, 323-336 (2009).</li>
<li>Gath, U., Hakvoort, A., Wegener, J., Decker, S., Galla, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Porcine+choroid+plexus+cells+in+culture%3A+expression+of+polarized+phenotype%2C+maintenance+of+barrier+properties+and+apical+secretion+of+CSF-components%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Porcine choroid plexus cells in culture: expression of polarized phenotype, maintenance of barrier properties and apical secretion of CSF-components.</a> European Journal of Cell Biology. 74, 68-78 (1997).</li>
<li>Haselbach, M., Wegener, J., Decker, S., Engelbertz, C., Galla, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Porcine+Choroid+plexus+epithelial+cells+in+culture%3A+regulation+of+barrier+properties+and+transport+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+Research+and+Technique%22%5BJournal%5D)">Porcine Choroid plexus epithelial cells in culture: regulation of barrier properties and transport processes.</a> Microscopy Research and Technique. 52, 137-152 (2001).</li>
<li>Strazielle, N., Ghersi-Egea, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiology+of+blood-brain+interfaces+in+relation+to+brain+disposition+of+small+compounds+and+macromolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Physiology of blood-brain interfaces in relation to brain disposition of small compounds and macromolecules.</a> Molecular Pharmaceutics. 10, 1473-1491 (2013).</li>
<li>Hilgendorf, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caco-2+versus+Caco-2%2FHT29-MTX+co-cultured+cell+lines%3A+permeabilities+via+diffusion%2C+inside-+and+outside-directed+carrier-mediated+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmaceutical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Caco-2 versus Caco-2/HT29-MTX co-cultured cell lines: permeabilities via diffusion, inside- and outside-directed carrier-mediated transport.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 89, 63-75 (2000).</li>
<li>Mathia, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permeability+characteristics+of+calu-3+human+bronchial+epithelial+cells%3A+in+vitro-in+vivo+correlation+to+predict+lung+absorption+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Drug+Targeting%22%5BJournal%5D)">Permeability characteristics of calu-3 human bronchial epithelial cells: in vitro-in vivo correlation to predict lung absorption in rats.</a> Journal of Drug Targeting. 10, 31-40 (2002).</li>
<li>Fuchs, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+human+alveolar+epithelial+cells+in+primary+culture%3A+morphological+characterization+and+synthesis+of+caveolin-1+and+surfactant+protein-C%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Differentiation of human alveolar epithelial cells in primary culture: morphological characterization and synthesis of caveolin-1 and surfactant protein-C.</a> Cell and Tissue Research. 311, 31-45 (2003).</li>
<li>Furie, M. B., Cramer, E. B., Naprstek, B. L., Silverstein, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cultured+endothelial+cell+monolayers+that+restrict+the+transendothelial+passage+of+macromolecules+and+electrical+current%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cultured endothelial cell monolayers that restrict the transendothelial passage of macromolecules and electrical current.</a> The Journal of Cell Biology. 98, 1033-1041 (1984).</li>
<li>Hidalgo, I. J., Raub, T. J., Borchardt, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+human+colon+carcinoma+cell+line+%28Caco-2%29+as+a+model+system+for+intestinal+epithelial+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Characterization of the human colon carcinoma cell line (Caco-2) as a model system for intestinal epithelial permeability.</a> Gastroenterology. 96, 736-749 (1989).</li>
<li>Yeste, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Geometric+correction+factor+for+transepithelial+electrical+resistance+measurements+in+Transwell+and+microfluidic+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physics+D+Applied+Physics%22%5BJournal%5D)">Geometric correction factor for transepithelial electrical resistance measurements in Transwell and microfluidic cell cultures.</a> Journal of Physics D Applied Physics. 49 (37), 3754(2016).</li>
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<li>Griep, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BBB+on+chip%3A+microfluidic+platform+to+mechanically+and+biochemically+modulate+blood-brain+barrier+function%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Microdevices%22%5BJournal%5D)">BBB on chip: microfluidic platform to mechanically and biochemically modulate blood-brain barrier function.</a> Biomedical Microdevices. 15, 145-150 (2013).</li>
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</ol>

著者は、競合する金銭的利益やその他の利益相反を持っていません。

自作のボルタンメーターを毎日のルーチンで使用する前に、適切な機能のためにデバイスをチェックすることが不可欠です。我々の場合、40ミリ秒(12.5Hz)の振動の半分の時間がプログラムされましたが、有効振動時間は60ミリ秒(16.7 Hz)であることが判明しました。マイクロコントローラの時間エミッタのこの不正確さは、TEER測定に検出可能な影響を与えなかった。マルチメータのいずれかの周波数設定を使用して、実際の周波数を決定するのが最善の場合があります。偏差が見つかった場合は、それに応じてソースコードを調整できます。さらに、テスト抵抗またはその他の定義済みの設定が正しく再現可能な結果を与えるかどうかを確認することを強くお勧めします。人工細胞バリアシステムを使用する場合は、常に分子フラックスとインピーダンス測定を相関させるのが最善かもしれません。
この場合、適用電流は120kΩプリ抵抗を用いて制限された。一般的なTEER値が100 Ω−2,000 Ωの範囲であると仮定すると、セル層全体の電圧降下は4−83 mVと計算できます。1 kΩのTEERを試験抵抗でシミュレートし、結果として得られる...

上皮細胞と内皮細胞は細胞境界として機能し、身体の頂点と側側を分離します。それらがタイトな接点を介して接続されている場合、準細胞空間を通る受動物質拡散は1に制限され、選択的に透過性の障壁が形成される。いくつかの人工バリアシステムは、微小血管内皮細胞(HBMEC、血液脳関門3、4、5、6、7)、コロイド叢を用いて2を開発した。上皮細胞(HIBCPP/PCPEC、血脳脊髄液関門8,9,10,11,12,13,14)大腸腺癌細胞(Caco-2、消化器モデル15)、または気道/肺胞細胞株(肺モデル16、17)。これらのシステムは、通常、透過性膜上の単層(すなわち、フィルタ挿入システム)で増殖した細胞から成り立ち、頂点および側側へのアクセスを可能にする。モデル システムの整合性がインビボ条件と一致することが重要です。そこで、細胞層全体のトレーサー化合物の細胞細胞拡散を測定することにより、バリア機能を解析するいくつかの技術が開発されている。これらの物質には、放射性標識されたスクロース、色素ラベルアルブミン、FITCラベル付きイヌリン、または色素標識デクトランス2が含まれる。しかし、化学染料は、さらなる実験のために細胞を使用不能にすることができます。バリアシステムを非侵襲的に監視するために、細胞単層にわたっての経上皮/経体皮電気抵抗(TEER)の測定は、2、18、19を使用することができる。双極電極システムは電極電解質界面での電極偏光インピーダンスの影響を受けるため、四極値測定は一般にこの制限20を克服するために使用される。下敷き技術は、ウィリアム・トムソン(ケルビン卿)21によって1861年に最初に記述された4端子センシング(4T)です。簡単に言えば、電流は一対の電流を運ぶ電極によって注入され、2組の電圧感知電極は電圧降下20を測定するために使用される。今日、いわゆる箸電極は二重電極のペアから成り、それぞれ電圧を測定するための銀/塩化物ペレットと電流2を通過するための銀電極を含む。電気インピーダンスは、頂点と帯状部の間のセル層との間で測定される(図1)。通常12.5Hzの周波数での正方形波信号が外極に適用され、得られた交流電流(AC)が測定されます。さらに、細胞層全体の潜在的な低下は、第2(内部)電極ペアによって測定される。電気インピーダンスはオームの法則に従って計算されます。TEER 値は、インピーダンスとセル層の表面積を乗算することによって正規化され、通常 Ω ∙ cm2として表されます。
セルや電極をより洗練された方法で配置するシステムもありますが、4T測定原理に基づいており、同じ測定装置で使用できます。EndOhmシステムは、例えば、フィルタが挿入される中で、箸電極と同じ構造を有する同心円電極のペアを有するチャンバーおよびキャップを含有する。電極の形状は、膜を横切るより均一な電流密度の流れを可能にし、それによって読み取り値間のばらつきを減らします。さらに複雑な(しかし、より正確な)は、細胞層がリンガーの溶液22で満たされた2つのチャンバーを分離するUssing室である。チャンバ自体は、酸素、CO2、またはN2でガス化し、実験物質を攪拌または補充することができる。細胞層を横切るイオン輸送が起こると、組織の近くにある2つの電圧感知電極によって電位差を測定できます。この電圧は、セル層の隣に配置された2つの電流を運ぶ電極によって取り消されます。測定された電流は、次に正味イオン輸送を与え、バリアの完全性を反映する経上皮抵抗は、22を決定することができる。TEER測定はまたバリアティッシュモデル23、24を表すボディオンチップシステムに適用することができる。これらのシステムは、細胞の生体内条件を模倣し、多くの場合、層の上に積み重ねられたいくつかのタイプの細胞で構成されています。
次のプロトコルでは、市販の測定システムと比較して TEER に統計的に有意な差を生じさせない、プログラマブルな出力周波数を持つ費用対効果の高い信頼性の高いボルタンメーターを設定する方法について説明します。

<table><tbody><tr><td>120kΩ 抵抗</td><td></td><td></td>器 <td>一般(汎用)機器</td></tr><tr><td>バナナプラグケーブル</td><td></td><td></td><td>一般(汎用)機器</td></tr><tr><td>ケーブル 一般</td><td></td><td></td><td>(汎用)機器</td></tr><tr><td>チョップスティック電極</td><td>メルクミリセル</td><td>MERSSTX01</td><td></td></tr><tr><td>チョップスティック電極(代替)</td><td>WPI ワールド精密機器</td><td>STX2</td><td></td></tr><tr><td>圧着工具</td><td></td><td></td><td>一般工具</td></tr><tr><td>Digispark / ATtiny85</td><td>AZ-Delivery Vertriebs GmbH</td><td>Digispark Rev.3 Kickstarter</td><td></td></tr><tr><td>DMEM:F12</td><td>Gibco (Thermo Fisher)</td><td>31330038</td><td></td></tr><tr><td>Fetal calf serum (FCS)/Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Life Technologies</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>Filter inserts 3&micro;m 半透明</td><td>グライナー バイオワン</td><td>662631</td><td></td></tr><tr><td>HIBCPP</td><td></td><td></td><td>石川 浩 / ホルスト シュローテン</td></tr><tr><td>断熱ストリッパー</td><td></td><td></td><td>汎用工具</td></tr><tr><td>光沢端子</td><td></td><td></td><td>一般(汎用)機器</td></tr><tr><td>オシロスコープ</td><td>HAMEG</td><td>デジタルストレージスコープ HM208</td><td></td></tr><tr><td>プロッター</td><td>フィリップス</td><td>PM 8143 XYレコーダー</td><td></td></tr><tr><td>ソフトウェア Arduino</td><td>https://www.arduino.cc</td><td>Arduino 1.8.9</td><td></td></tr><tr><td>はんだごて</td><td></td><td></td><td>汎用工具</td></tr><tr><td>はんだ付けラグ</td><td></td><td></td><td>一般(汎用)機器</td></tr><tr><td>RJ14(6P4C)コネクタ</td><td></td><td></td>付き電話ケーブル <td>一般(汎用)機器</td></tr><tr><td>テスト抵抗</td>器 <td>メルク ミリセル</td><td>MERSSTX04</td><td></td></tr><tr><td>True-RMS マルチメータ</td><td>VOLTCRAFT</td><td>VC185</td><td></td></tr><tr><td>USB 充電器</td><td></td><td></td><td>一般(汎用)機器</td></tr><tr><td>USB 延長コード</td><td></td><td></td><td>一般(汎用)機器</td></tr><tr><td>TEER測定用ボルトhmメータ</td><td>WPI World Precision Instruments</td><td>EVOM</td><td></td></tr><tr><td>TEER測定用ボルトHMメータ(代替)</td><td>Merck Millicell</td><td>ERS</td><td></td></tr><tr><td>ワイヤーエンドフェルール</td><td></td><td></td><td>一般(汎用)機器</td></tr></tbody></table>

プログラマブル出力周波数を備えた自作ボルトアンペメーターを用いてteer測定を行う簡単なアプローチ

A Simple Approach to Perform TEER Measurements Using a Self-Made Volt-Amperemeter with Programmable Output Frequency

経上皮/内皮電気抵抗(TEER)は、1980年代からインビトロバリアモデルシステムの合流性と透過性を決定するために使用されてきました。ほとんどの場合、箸電極は、細胞培養フィルター挿入システムの上下のコンパートメント間の電気インピーダンスを決定するために使用される。フィルター膜は細胞が密着し、偏光し、堅いジャンクションを造ることによって相互作用することを可能にする。この技術は、種々の異なる細胞株(例えば、血液脳関門の細胞、血脳脊髄液関門、または消化管および肺管)で説明されている。TEER測定装置は異なった実験室装置のサプライヤーから容易に得ることができる。しかし、適切なボルタンメーターが自己組み立てされている場合に想像できる、より費用対効果の高いカスタマイズ可能なソリューションがあります。この出版物の全体的な目的は、TEER測定のために市販の箸電極と使用することができるプログラム可能な出力周波数を持つ信頼性の高いデバイスを設定することです。

自己組立ボルタンメーターの動作を市販のボルタンメーターと比較するために、両方のデバイスの電圧オシログラムを記録した。
図2Aに示すように、基準機器は、1 kΩテスト抵抗でオンロードを動作させる場合、12.5 Hzの周波数に相当する80mVの振幅と80ミリ秒の振動時間を持つ正方形波信号を生成しました。
対照的に、自己組立装置のマイクロコントローラは、プリ抵抗が設定されていない場合、電源電圧を5V(図2B)の振幅で正方形波信号に切り替えた。得られた電流はバリア機能を破壊し、細胞培養実験には適用されないことが明らかになった(データは示されていない)。さらに問題は、このセットアップでは1 kΩのテスト抵抗が...

ここでは、市販の箸電極で使用できるプログラム可能な出力周波数を備えた安価なボルトアンペメーターを設定する方法を示します。

プログラマブル出力周波数を備えた自作ボルトアンペメーターを用いてTEER測定を行う簡単なアプローチ

Transepithelial/endothelial electrical resistance (TEER) has been used since the 1980s to determine confluency and permeability of in vitro barrier model ...

この経上皮電気インピーダンスの測定は、細胞培養における上皮単層の合流およびバリア機能を決定するために1980年代から使用されてきた。基礎となる技術は、より正確な測定を行うために、異なる対の電流運送電極と電圧センシング電極を使用する4端子センシングです。経上皮インピーダンスを測定するために市販のデバイスがいくつかありますが、使いやすさや高い信頼性にもかかわらず、非翻訳可能な出力周波数とその高価さなど、いくつかの欠点もあります。したがって、コスト効率とプログラマブルな電圧計の構築方法を表しています。まず、市販デバイスを使用した TEER 測定のしくみを示します。そのために、3マイクロメートルの細孔サイズのトランスウェルフィルター上の脈絡叢上皮乳頭腫細胞の細胞層を培養しました。この設定は、シュローテンらによって血液脳脊髄液バリアのインビトロモデルとして記述されている。さて、箸の電極は上皮ボルト・アンメーターに接続されています。装置はスイッチが入り、抵抗を測定するように設定される。電極は80%エタノールで滅菌され、その後適切な培地で平衡化される。測定されるインピーダンスは、その後組み立てられる電圧計の信頼性を評価するために基準値として機能します。この例では、680 Ωのインピーダンスを記録します。プログラム可能な出力周波数を持つ低予算のボルト・アンメーターの組み立てから始めましょう。まず、標準のUSB充電器と5ボルト直流電源としてUSB延長コードが必要です。USB開発ボード上の8ビットマイクロコントローラを使用して、方形波電流を生成します。バナナプラグ付きの4本のケーブルは、電圧と電流を測定するために2つの標準マルチメーターに接続されています。マルチメータがTrueRMSを使用していくつかのマイクロアンパーの範囲で電流を測定できることを確認してください。メス型のRJ14コネクタは、標準の電話ケーブルに記載されています。コネクタに 6 本のピンがあり、そのピンが少なくとも内側の 4 本が配線されていることを確認してください。最後に、ケーブル、光沢端子、120キロポーム抵抗器、絶縁ストリッパー、圧着工具、ワイヤーエンドフェルール、およびはんだ付け鉄などの標準機器が必要です。デバイスは、レイアウト図に示したとおりに組み立てられます。最初は、USB拡張機能がマイクロコントローラに接続されています。通常の動作中は、5ボルトのDC USB充電器を搭載し、プログラミング用にパーソナルコンピュータに簡単に接続できます。2 本のケーブルを取り外し、片側にワイヤーエンド フェルールを付けて圧着します。反対側は、直接、ピンゼロと2つのマイクロコントローラまたははんだラグに、それぞれのピンでクリップされます。次に、電力供給ケーブルを光沢端子に接続します。最初のマルチメーターは電流を測定するために使用され、120キロポーム抵抗と電流通過箸電極で直列に接続されます。この配置により、出力電流が制限されるため、測定は細胞の生存率に影響を与えなくなります。内線延長コードの4つの導体は、前に示すように解体され、フェルールに圧着されます。ケーブルを準備したら、導体とピンの連続性をテストする必要があります。この例では、3~6本のピンが白、茶色、緑、黄色の導体に接続されています。現在、緑色と黄色のピン5と6が光沢端子に接続され、外側の電極ペアに電圧が適用されます。最後に、次上皮電圧降下を測定するために使用される2番目のマルチメーターをピン3と4、つまり白と茶色の導体に接続する必要があります。私たちは、安価なプラスチックシャーシにインストールをマウントすることにしました。最初の使用の前に、マイクロコントローラはプログラムされなければならない。ソースコードはC +で書かれ、USBでアップロードできます。簡単に言えば、中央出力モードにゼロをピン留めします。オンにすると、関数ループは、グランドとプラス5ボルトの間のピンと可変遅延の間のピンとして交互に開始されます。この例では、理論上の半振動時間を 40 ミリ秒にしました。測定結果と以前に得られた参照値との比較を見てみましょう。箸の電極は最近組み立てられたボルト・アンメータに再配置される。デバイスの電源は 3 段階でオンになっています。すなわち、USB充電器を接続し、左マルチメータをAC電圧測定に切り替え、2つ目のマルチメーターをマイクロアンペアに切り替える。注意してください、その交流電流は明示的に選択する必要があります。この例では、トランスウェルフィルターシステム全体の潜在的な落下は約25ミリボルトとして測定され、37.1マイクロアンペアの電流を記録します。オームの法則によれば、電気インピーダンスは674オームで簡単に計算でき、680の参照値に非常に近い。測定値はゼロから1.8キロポームまでの範囲で信頼できるということを示しました。したがって、記載されたボルト・アンメーターは、初期実験およびさらなる研究の両方に使用することができる。ただし、結果が公表された場合は、それぞれの細胞層全体で分子フラックスを測定することで、データを常にサポートしたいと思うかもしれません。

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Biology

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