細菌、酵母、ヒト細胞における一過性形成分子シャペロンアセンブリのモニタリング
September 2nd, 2019
コグネートJドメインタンパク質はHsp70シャペロンと協力して、タンパク質の折りたたみから分解に至るまで、無数の生物学的プロセスを支援します。ここでは、細菌、酵母およびヒト細胞におけるこれらの一時的に形成されたシャペロン機械のモニタリングを可能にする、その場近近性ライゲーションアッセイについて説明する。
この方法は、細菌や酵母などの生物や異なる細胞タイプの一過性タンパク質相互作用を捕捉します。ここでは、細胞プロテオスタシスに関与する一過性に形成された特異的シャペロン複合体を監視します。この技術の主な利点は、原核細胞および真核細胞におけるタンパク質集合体のダイナミクスおよび細胞下局在化に関する情報を生成する能力である。
細菌や酵母のような単細胞生物におけるこの技術の適応は、研究者が微生物感染に関連する疾患を調査するための強力なツールとしてそれを使用することを可能にする。この技術は、プロトコルのサンプル調製段階で条件を変更するだけで、ほぼすべての生物のタンパク質相互作用を分析するために使用される可能性があります。免疫組織化学、免疫蛍光、ELISA、または免疫沈降のいずれかに特異的かつ試験された良質の抗体を選択することが重要です。
ポリL-リジンで10ウェル診断スライドを事前に処理することで始めます。100マイクロリットルの無菌を加え、各ウェルに0.0001%ポリL-リジンを濾過し、無菌層流れフードで30分間スライドをインキュベートします。次に、50マイクロリットルの無菌水でそれぞれをよく洗い、余分なポリL-リジンを除去します。
細胞の種類に応じてウェルあたり約15,000個の細胞を添加し、5%の二酸化炭素を60〜80%の合流度で摂氏37度で無菌湿気の培養器で細胞を成長させます。24時間後、各ウェルの端にティッシュペーパーを置くことによって成長培地を取り除き、50マイクロリットルのPBSで細胞を3回洗浄した。次に、PBSに50マイクロリットルの新鮮な4%パラホルムアルデヒドを各ウェルに加え、室温で10分間インキュベートして細胞を固定します。
固定後、スライド染色瓶にPBSを入れ、スライドを3回洗います。取り付けられた細胞の膜を透過するには、スライドをPBSで0.5%トリトン-X100の100ミリリットルに沈め、室温で10分間細胞をインキュベートする。その後、TBS-Tで3回スライドを洗浄します。
最後の洗浄後、ティッシュペーパーで余分なバッファーを取り除きます。原稿の方向に従ってS.cerevisiae細胞を増殖して希釈し、50ミリリットルの遠心分離管とペレットに移し、665倍gで665倍の遠心分離を行います。上清を取り除き、新鮮な培地の5ミリリットルで細胞を再懸濁します。
その後、550マイクロリットルのホルムアルデヒドを加えて4%の最終濃度を得て、室温で培養を15分間インキュベートして細胞を固定します。インキュベーション後、ペレット細胞を、上清を除去し、洗浄バッファーに調製したての4%パラホルムアルデヒドの1ミリリットルでペレットを再懸濁した。室温で細胞を45分間インキュベートする。
一方、0.0001%ポリL-リジン溶液の100マイクロリットルを各ウェルに加え、室温で30分間インキュベートすることで、診断スライドを準備します。その後、超純水で余分なポリL-リジンを洗い流し、スライドを空気乾燥させます。インキュベーションステップの後、遠心分離により1ミリリットルの洗浄バッファーで細胞を2回洗浄する。
上清を取り除き、洗浄バッファー内の細胞を再び懸濁します。最後の洗浄後に細胞をペレットにし、上清を除去し、1.2モルソルビトールを含む洗浄緩衝液の1ミリリットルで細胞を再懸濁した。細胞壁を消化するために、細胞を再びペレット化し、250マイクロリットルの新たに調製したLyticase溶液中の細胞を再懸濁させた。
穏やかな揺れで15分間摂氏30度で細胞をインキュベートします。消化工程後、細胞を洗浄バッファーで3回洗浄し、1.2モルソルビトールを含む洗浄バッファーの250マイクロリットルで細胞を再懸濁する。各ポリL-リジンコーティングウェルに再懸濁細胞の20マイクロリットルを追加し、固定および透過細胞を30分間取り付けます。
50マイクロリットルの洗浄バッファーでウェルを3回洗浄し、非接着細胞を除去し、近接ライゲーションアッセイを進めます。近接ライゲーションアッセイ、またはPLAプロトコルを各ウェルにブロッキングバッファーの滴を加えることによって開始し、37°Cで30分間湿度の高いチャンバーにスライドをインキュベートします。各ウェルの端にティッシュペーパーを置いてブロッキングバッファーを取り除き、100ミリリットルの洗浄バッファーAで細胞を2回洗浄し、各ウェルに40マイクロリットルの一次抗体溶液を加え、湿度の高いチャンバーで37°Cで60分間スライドをインキュベートします。
一次抗体溶液を取り出し、洗浄バッファーAでスライドを2回洗浄します。その後、溶液を取り出し、洗浄バッファーAでスライドを2回洗浄し、コネクタオリゴヌクレオチドとDNAリガーゼを含むDNAライゲーション混合物を40マイクロリットル加え、各ウェルに加え、37°Cの湿度チャンバーにスライドを30分間インキュベートします。インキュベーション後、ライゲーション混合物を取り除き、洗浄バッファーA.各ウェルにDNAポリメラーゼと蛍光標識オリゴヌクレオチドを含む40マイクロリットルのDNA増幅混合物を加え、加えて37°Cの湿潤チャンバーで100分間インキュベートします。
増幅混合物を取り除き、1回の洗浄バッファーBを100ミリリットルで洗浄します。その後、100ミリリットルの洗浄バッファーBでスライドを洗い、超純水で1~100に希釈します。DAPI含有取り付け媒体を井戸ごとに20マイクロリットル追加します。
カバースリップでスライドの井戸を覆い、マニキュアで密封します。このプロトコルは、HeLa、S.cerevisiae、および大腸菌細胞の異なるJドメインタンパク質とHsp70シャペロンおよびJドメインタンパク質の間に形成された一過性シャペロン集合体の監視に成功しました。ヒトクラスAおよびクラスBJドメインタンパク質は、非常に特異的な一次抗体を標的とした。
赤い蛍光性の各々は、HeLa細胞における2つの異なるJドメインタンパク質の間に形成されたタンパク質複合体を表す。同様の混合クラスのJドメインタンパク質複合体は、単細胞真核生物S.cerevisiae、またはベーカー酵母でも観察される。PLAから発生する蛍光語の一部は、細胞サイズが小さいため、個々の病巣として解決することがより困難であった。
クラスAとBJドメインタンパク質の間の複雑な形成は、精製タンパク質で行われた生化学的研究と一致する大腸菌細胞では認められなかった。しかし、Jドメインタンパク質とHsp70シャペロンを含む他のシャペロンアセンブリは、PLAプロトコルを使用して捕獲された。それ以外の完全なPLA反応における相互作用するJドメインタンパク質またはシャペロンのいずれかに対する一次抗体を欠いた技術的制御は、細胞内で蛍光白熱形成をほとんどまたは全く示さなかったことを示し、偽陽性シグナル増幅の欠如を示した。
近接ライゲーションアッセイを用いて信頼できる結果を得るには、使用する抗体が十分な品質であることを事前に確認してください。さらに、細胞壁を含む細胞の過剰消化を避けるには、注意を要する。
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概要
この研究は、Hsp70シャペロンと結合するコグネートJドメインタンパク質が様々な生物学的プロセスを促進する役割を調査します。In situ近接リガーゼアッセイを利用し、研究は細菌、酵母、およびヒト細胞における一時的なシャペロン複合体をモニターし、細胞のタンパク質ホメオスタシスに光を当てています。
主要な研究要素
研究領域
- 細胞のタンパク質ホメオスタシス
- タンパク質の相互作用と複合体
- 微生物感染における生物学的意義
背景
- タンパク質ダイナミクスにおけるシャペロン機構の重要性
- 細胞生物学における一時的相互作用の関連性
- 疾病研究における潜在的応用
使用した方法
- In situ近接リガーゼアッセイ（PLA）
- 原核生物（E. coli）および真核生物（HeLa、S. cerevisiae）の細胞モデル
- 免疫蛍光および特異的抗体技術
主な結果
- JドメインおよびHsp70シャペロン相互作用の成功的なモニタリング
- タンパク質集合体の細胞内局在の可視化
- 様々な生物への方法の適応可能性
結論
- この研究は、タンパク質の折りたたみと分解におけるJドメインタンパク質の重要な関与を示しています。
- この方法は、様々な生物学的システムにおけるタンパク質ダイナミクスの理解を大幅に深めることができます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Monitoring transient protein interactions in prokaryotic and eukaryotic systems enables mechanistic de-risking of chaperone-mediated proteostasis pathways relevant to neurodegenerative and infectious disease targets. The proximity ligation assay (PLA) provides quantitative, subcellular resolution of transient chaperone assemblies, supporting target validation and assay development in early discovery. This cross-species applicability enhances predictive confidence in lead identification by capturing dynamic protein quality control networks in disease-relevant systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of transient J-domain protein heterocomplexes that fine-tune Hsp70-mediated disaggregase activity.
- Operational Value: Provides subcellular localization data to clarify functional relevance of chaperone interactions in stress response pathways.
- Predictive Value: Supports biological de-risking by capturing dynamic assemblies linked to protein quality control under acute/chronic stress conditions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative fluorescent readouts proportional to transient chaperone complex formation in fixed cells.
- Operational Value: Delivers reproducible, amplification-based signal detection compatible with high-content imaging workflows.
- Assay Readiness: Adapted to bacterial, yeast, and human cell models, enabling platform reuse across prokaryotic and eukaryotic systems.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Connects chaperone complex dynamics to proteostasis failure in models of protein aggregation and microbial infection.
- Operational Value: Enables cross-species comparison of J-domain protein interactions to assess conservation of disaggregase mechanisms.
- Translational Continuity: Supports mechanistic de-risking by linking transient complex formation to functional outcomes in disease-relevant systems.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by providing dynamic interaction data that informs target confidence prior to lead identification and preclinical validation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of chaperone co-complex formation in subcellular compartments under stress-inducing conditions.
- Screening: Enables assay standardization through quantitative PLA signal measurement across bacterial, yeast, and mammalian cell platforms.
- Analytics: Delivers puncta-based readouts that correlate with transient complex abundance, facilitating condition comparison and pathway modulation studies.
- Translational Research: Links chaperone assembly dynamics to proteostasis capacity in models relevant to neurodegenerative and infectious disease mechanisms.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized PLA protocol adaptable to diverse organisms via sample preparation adjustments, reducing redevelopment effort.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target validation confidence by resolving transient, subcellular chaperone interactions invisible to bulk biochemical methods.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized fixation, permeabilization, and antibody validation steps across cell types.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing mechanistic insight into chaperone network functionality under disease-relevant stress.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on chaperone-mediated disaggregase activity and complex conservation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in immunofluorescence, antibody validation, and proximity ligation assay optimization.
- Dependent on high-quality primary antibodies validated for immunohistochemistry, immunofluorescence, ELISA, or immunoprecipitation.
- Necessitates standardized wash buffers, blocking agents, and humid chamber incubation for consistent signal amplification.
- Requires optimization of cell wall digestion (e.g., lyticase for yeast) to prevent over-digestion and maintain epitope accessibility.
- Practical limitation: Signal resolution may be challenged in small cells (e.g., yeast) where fluorescent puncti overlap, necessitating super-resolution imaging for precise quantification.
