Name: 細菌、酵母、ヒト細胞における一過性形成分子シャペロンアセンブリのモニタリング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 s
Description: 学ぶ 細菌、酵母、ヒト細胞における一過性シャペロン複合体のモニタリング手法。in situ近接結合アッセイを用いてJドメインタンパク質とHsp70の相互作用を可視化し、細胞内プロテオスタシスの動態解明に貢献します。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

NBNは、ビクトリア州政府とオーストラリア政府からの資金援助を受けて、モナッシュ大学医学部の特別募集助成金によって支援されています。ベルント・ブカウ(ZMBH、ハイデルベルク大学、ドイツ)とハーム・H・カンピングガ(オランダ・フローニンゲン大学生物医学科)の貴重な支援と試薬の共有に感謝します。イメージング施設、ハイデルベルク大学、ドイツ)は、共焦点顕微鏡と画像処理をサポートし、原稿の批判的な読み取りのためのクレア・ハースト(ARMI、モナッシュ大学、オーストラリア)。

1. HeLa細胞製剤
<ol><li>次の材料を準備する: PBS (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4,1.8 mM KH2PO4),pH 7.4;DMEM, 10% FCS と 1% ペンストレップを補充;PBSで4%パラホルムアルデヒド;0.5% PBS でトリトン X100;TBS-T (150 mM NaCl, 20 mM トリス, 0.05% ツエン), pH 7.4;0.0001% 無菌ポリ-リジン溶液;10ウェル診断スライド。湿気の多い部屋;ティッシュペーパー;そしてコプリンのスライド染色の瓶。 注:最適な固定効率を確保するために、パラホルムアルデヒド溶液は、すべての実験の前に新鮮に準備する必要があります。</li>
	<li>湿ったティッシュで閉じた箱の底を覆うことによって湿気の多い部屋を準備する。実験を開始する前に湿度の高いチャンバーを37°Cに置き、酵素反応をインキュベートしながらチャンバ温度が37°Cであることを確認します。</li>
	<li>T25フラスコにおける培養HeLa細胞は、DMEMの5mL(高グルコース、グルタミン酸ナトリウムおよびピルビン酸ナトリウム補充)で10%FCSおよび1%ペンストレップを補充し、5%CO2を含む37°C CO2インキュベーター中に含まれる。 0.05%トリプシン-EDTAを用いて付着細胞を解離する。解離した細胞に新鮮なDMEMを添加した後、細胞計数室を使用して細胞をカウントし、湿度の高いチャンバー内の診断スライド上で成長する。</li>
	<li>無菌細胞培養フードにUV照射により診断スライドを30分間殺菌します。</li>
	<li>実験に必要な各ウェルに100 μLの滅菌濾過0.0001%ポリL-リジンを加えます。30分間インキュベートし、50 μLの超純水で各ウェル3倍を洗浄することにより、余分なポリL-リジンを洗い流します。</li>
	<li>HeLa細胞をトリプシン化し、各ウェルに約15,000個の細胞を追加します。必要に応じて、ウェル当たりのDMEMの少なくとも30〜50 μLに細胞を希釈する。</li>
	<li>約24時間の37°C5%CO2インキュベーター内の湿気のあるチャンバー内で細胞を成長させる細胞は、PLAを開始する前に60%〜80%のコンフルエントでなければなりません。 注:合流率が高すぎると試薬の吸収が減少し、プロトコルの終わりに得られた信号が減少します。</li>
	<li>ウェルの端にティッシュペーパーを置いて培地を取り除きます。PBSの50 μLでウェルを3倍洗います。 注:細胞は、液体が過酷に添加されると、切り離さの対象となります。これは、新しい液体を追加する前に井戸を完全に乾燥させないようにし、井戸の端に穏やかに新しい液体を追加することによって防ぐことができます。</li>
	<li>PBSに50μLの新たに調製した4%パラホルムアルデヒドを各ウェルに加えて細胞を固定します。室温で10分間インキュベートします。</li>
	<li>PBSでスライドを3倍洗います。100mLのPBSを含むコプリンスライド染色瓶で洗い流す。洗浄ごとに、揺れることなく室温で5分間インキュベートします。</li>
	<li>コプリンスライド染色瓶にPBSで0.5%トリトン-X100の100 mLのスライドを浸すことによって細胞膜を透過化する。揺れることなく室温で10分間インキュベートします。</li>
	<li>TBS-Tでスライドを3倍洗います。TBS-Tの100mLを含むコプリンスライド染色瓶で洗い流す。洗浄ごとに、揺れることなく室温で5分間インキュベートします。</li>
	<li>最後の洗浄後、ティッシュペーパーで余分なバッファーを取り除きます。この時点で、細胞はセクション4で議論される近接性ライゲーションアッセイプロトコルの準備ができています。</li>
</ol>2. S. セレビシエ細胞製剤
<ol><li>次の材料を準備する: 100mM KPO 4, pH 6.5, ウォッシュバッファーと呼ばれる;37% ホルムアルデヒド;4% 100 mM KPO4でパラホルムアルデヒド, pH 6.5;1.2 Mソルビトール 100 mMKPO 4, pH 6.5;リチケース溶液(500 μg/mLリチケース、20 mM β-メルカプトエタノール、100 mMKPO 4、pH 6.5);0.0001% ポリ-リジン溶液;1% 100 mM KPO4でトリトン X100, pH 6.5;10ウェル診断スライド。湿気の多い部屋(ステップ1.2のように調製);ティッシュペーパー;そしてコプリンのスライド染色の瓶。 注:最適な固定効率を確保するために、パラホルムアルデヒド溶液は、すべての実験の前に新鮮に準備する必要があります。</li>
	<li>振りながら30°Cで非選択的酵母エキス、ペプトンおよびデキストロース(YPD)培地で一晩培養を成長させる。 注:実験要件に応じてS.セレビシエ細胞は、代わりに合成コンプリート(SC)培地または選択的合成最小(SM)培地で増殖させることができる。</li>
	<li>静止培養を20mL培地で0.1のOD600に希釈する。OD 600が0.5に達するまで振りながら30°Cで細胞を成長させる。</li>
	<li>20 mL 培養を 50 mL 遠心分離管に移します。665 x gで3分間遠心分離によって細胞をペレットし、上清を取り除く。新鮮な培地の5 mLで細胞を再中断する。</li>
	<li>培養に37%ホルムアルデヒドの550 μLを添加して細胞を固定します。室温で15分間インキュベートします。</li>
	<li>665 x gで3分間遠心分離によって細胞をペレットし、上清を取り除く。ウォッシュバッファーで作成した4%パラホルムアルデヒドの1mLでペレットを再中断します。室温で45分間インキュベートします。</li>
	<li>インキュベーション中に、各ウェルに0.01%ポリL-リジン溶液の100 μLを加えて診断スライドを調製します。室温で30分間スライドをインキュベートします。</li>
	<li>30分後、余分なポリL-リジンを超純水で洗い流し、スライドの空気を乾燥させます。乾燥したスライドは使用の準備ができている。</li>
	<li>洗浄バッファーの1 mLで細胞を2回洗浄します。665 x gで3分間の細胞の遠心分離による洗浄を行い、上清を取り出し、ウォッシュバッファー内の細胞を再中断します。</li>
	<li>665 x gで3分間遠心分離によって細胞をペレットし、上清を取り除く。洗浄バッファー内の1.2 Mソルビトールの1mLで細胞を再中断します。</li>
	<li>665 x gで3分間遠心分離によって細胞をペレットし、上清を取り除く。細胞壁を消化するために、新たに調製されたLyticase溶液の250 μLでペレットを再中断します。揺れながら30°Cで15分間Lyticase溶液中の細胞をインキュベートする。</li>
	<li>消化後、665 x gで遠心分離で細胞を3倍に洗浄し、上清を除去する。洗浄バッファー内の1.2 Mソルビトールの250 μLで細胞を再中断します。 注:細胞は細胞壁の消化後に壊れやすいので、細胞を損傷しないように非常に慎重に再中断します。</li>
	<li>ポリLリジンコーティングされたスライドに再懸濁細胞の20 μLを追加します。50 μLの洗浄バッファーでウェルを3倍に洗い流し、非付着細胞を30分間スライドに取り付けます。</li>
	<li>洗浄バッファーで1%トリトン-Xの50 μLで3倍を洗浄することにより、細胞膜を透過化します。 注:この時点で、細胞はセクション4で議論される近接ライゲーションアッセイプロトコルの準備ができている。</li>
</ol>3.大腸菌細胞製剤
<ol><li>次の材料を準備する: PBS-T (140 mM NaCl, 2 mM KCl, 8 mM K2HPO4,1.5 mM KH2PO4,0.05% Tween-20), pH 7.4;リソザイム溶液 (2 mg/mL リソザイム, 25 mM トリス-HCl pH 8.0, 50 mM ブドウ糖, 10 mM EDTA);0.0001% ポリ-リジン溶液;99% 氷冷メタノール;99% 室温メタノール;99% アセトン;10ウェル診断スライド。湿気の多い部屋(ステップ1.1.1のように調製);ティッシュペーパー;そしてコプリンのスライド染色の瓶。</li>
	<li>揺れながら30°Cでルリア・ベルタニ(LB)培地で一晩培養する。</li>
	<li>静止培養を新鮮なLB培地で0.02のOD600に希釈する。OD 600が対数相細胞の0.4に達するまで振りながら30°Cで細胞を成長させる。</li>
	<li>細胞が0.4のOD600に達する約15分前に、各ウェルに0.0001%ポリL-リジンの100 μLを加えてポリL-リジンコーティングスライドを調製する。室温で30分間スライドをインキュベートします。</li>
	<li>30分後、超純水で余分なポリL-リジンを洗い流し、空気を乾燥させます。乾燥したスライドは使用の準備ができている。</li>
	<li>細胞が0.4のOD600に達すると、2分間2,650 x gで無菌マイクロ遠心管およびペレット細胞に培養の1 mLを移移す。</li>
	<li>LB培地の50μLで細胞を再中断する。</li>
	<li>氷冷99%メタノールの1 mLを加えて細胞を固定します。手で非常に穏やかに混ぜます。-20°Cで30分間細胞をインキュベートする。</li>
	<li>固定後、ポリL-リジンコーティングスライドに20 μLの細胞を追加します。スライドの空気を30分間乾燥させます。</li>
	<li>作りたてのリソザイム溶液を50μLのリソザイム溶液を各ウェルに加え、細胞壁を消化します。湿度の高いチャンバーで25°Cで30分間インキュベートします。</li>
	<li>ウェルの端にティッシュペーパーを追加して、ウェルからリザイム溶液を取り除きます。PBS-Tの100 mLでスライド3xを洗浄します。コプリンのスライド染色瓶で30sの各洗浄を行い、揺れることなく行います。</li>
	<li>ティッシュペーパーのスライドをタップして、スライドから洗浄バッファを取り外します。</li>
	<li>各ウェルに99%メタノールの50 μLを添加して細胞膜を透過化する。室温で1分間インキュベートします。</li>
	<li>ウェルの端にティッシュペーパーを置くことによってメタノールを取り除きます。</li>
	<li>各ウェルに99%のアセトンの50 μLを追加します。1分間インキュベートします。</li>
	<li>ウェルの端にティッシュペーパーを置くことによって余分なアセトンを取り除きます。スライドを空気乾燥させます。この時点で、細胞はセクション4で議論される近接ライゲーションアッセイプロトコルの準備ができている。</li>
</ol>4. 近接リゲーションアッセイ
<ol><li>次の資料を準備する: バッファをブロックします。抗体希釈バッファー;ウォッシュバッファー 'A' – (10 mM トリス, 150 mM NaCl, 0.05% Tween-20) pH 7.4;ウォッシュバッファ 'B' – (200 mMトリス, 100 mM NaCl) pH 7.4;抗ウサギ二次抗体プラス;抗マウス二次抗体 MINUS;5xライゲーションバッファ;リゲス;5x増幅バッファー(オレンジ: λex 554 nm; λem 576 nm);ポリメラーゼ;超純水;DAPIを含む取り付け媒体。 注:PLA検出試薬は、変種グリーン(λex 495 nm;λem 527 nm)、レッド(λex 594 nm;λem 624 nm)、ファルレッド(λex 644 nm;λem 669 nm)またはブライトフィールド(ホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP))でも利用可能です。共役)。</li>
	<li>各ウェルにブロックバッファのドロップを追加してセルをブロックします。湿気の多い部屋で37°Cで30分間インキュベートします。</li>
	<li>抗体希釈バッファー内のストック抗体を希釈することにより抗体溶液を調作する。各ウェルに対して40μLの抗体溶液が必要である。</li>
	<li>ウェルの端にティッシュペーパーを置くことによってブロッキングバッファを削除します。抗体希釈バッファーで希釈した抗体の40μLを各ウェルに添加する。湿度の高いチャンバーで60分間インキュベートし、37°Cまたは4°Cで一晩インキュベートします。</li>
	<li>ウェルの端にティッシュペーパーを置くことによって、ウェルから抗体溶液を取り除きます。コプリンスライド染色瓶の洗浄バッファー'A'の100 mLで2xを5分間、揺れることなく洗います。</li>
	<li>洗浄工程中、希釈5x二次抗体プローブ、抗ウサギPLUS&抗マウスMINUS(プローブの種特異性は使用される一次抗体に依存する)、抗体希釈バッファー内。ウェル当たり40μLの抗体溶液を調剤する。</li>
	<li>各ウェルに40μLの二次抗体溶液を添加する。湿気の多い部屋で37°Cで60分間インキュベートします。</li>
	<li>ウェルの端にティッシュペーパーを置くことによって、ウェルから二次抗体溶液を取り除きます。コプリンスライド染色瓶の洗浄バッファー'A'の100 mLで2xを5分間、揺れることなく洗います。</li>
	<li>洗い流しの間に、ウェル当たり40μLのライゲーション混合物を調作し、5xライゲーションバッファーの8μL、31μLの超純水および1μLのリガーゼを混合する。</li>
	<li>各ウェルに40μLのライゲーション混合物を加えます。湿気の多い部屋で37°Cで30分間インキュベートします。</li>
	<li>ウェルの端にティッシュペーパーを置くことによって、井戸からライゲーション混合物を除去します。コプリンスライド染色瓶の洗浄バッファー'A'の100 mLで2xを揺らさずに2分間洗浄します。</li>
	<li>洗い流しの間に、ウェル当たり40μLの増幅混合物を調作し、5倍増幅溶液の8μL、31.5μLの超純水、および0.5μLのポリメラーゼを混合する。 注:5x増幅には蛍光プローブが含まれています。この混合物を光から保護します。また、次の各手順でスライドをライトから保護します。半透明のコプリンスライド染色瓶と湿度の高いチャンバーを使用する場合は、アルミ箔でそれらを包みます。</li>
	<li>ウェルあたり40μLの増幅混合物を加えます。湿度の高い部屋で37°Cで100分間インキュベートします。</li>
	<li>ウェルから増幅混合物を除去します。コプリンスライド染色瓶の洗浄バッファー'B'の100 mLで2xを揺らさずに10分間洗浄します。</li>
	<li>洗浄バッファー'B'の100 mLでスライドを洗浄し、30sのコプリンスライド染色瓶で超純水で1:100を希釈します。</li>
	<li>井戸あたりの取り付け媒体を含むDAPIの20 μLをスライドに追加します。カバースリップでスライドを閉じ、マニキュアでスライドをシールします。</li>
	<li>イメージングの場合は、光から保護しながら、10~15分間、取り付け媒体を含むDAPIを直ちにインキュベートする。そうでない場合は、光から保護された最大1週間-20°Cでスライドを保管してください。</li>
</ol>5. 検出
<ol><li>共焦点顕微鏡検査を使用して、20x/0.8 NA、63x/1.4 NA、100x/1.4 NAプランアポクロマットの目標を持つHeLa、S.セレビシエおよび大腸菌細胞の画像を取得します。405 nmパルスダイオードレーザーでDNA染色DAPIを励起します。PLA信号(この研究用)の場合は、561nmの固体レーザーで励起します。</li>
</ol>

<ol><li>Soderberg, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+observation+of+individual+endogenous+protein+complexes+in+situ+by+proximity+ligation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation.</a> Nature Methods. 3 (12), 995-1000 (2006).</li>
<li>Weibrecht, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proximity+ligation+assays%3A+a+recent+addition+to+the+proteomics+toolbox%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+of+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Proximity ligation assays: a recent addition to the proteomics toolbox.</a> Expert Review of Proteomics. 7 (3), 401-409 (2010).</li>
<li>Mayer, M. P., Gierasch, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+the+structural+and+mechanistic+aspects+of+Hsp70+molecular+chaperones%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Recent advances in the structural and mechanistic aspects of Hsp70 molecular chaperones.</a> Journal of Biological Chemistry. 294 (6), 2085-2097 (2019).</li>
<li>Kampinga, H. H., Craig, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+HSP70+chaperone+machinery%3A+J+proteins+as+drivers+of+functional+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The HSP70 chaperone machinery: J proteins as drivers of functional specificity.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11 (8), 579-592 (2010).</li>
<li>Nillegoda, N. B., Bukau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metazoan+Hsp70-based+protein+disaggregases%3A+emergence+and+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Biosciences%22%5BJournal%5D)">Metazoan Hsp70-based protein disaggregases: emergence and mechanisms.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 2, (2015).</li>
<li>Bracher, A., Verghese, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nucleotide+exchange+factors+of+Hsp70+molecular+chaperones%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Biosciences%22%5BJournal%5D)">The nucleotide exchange factors of Hsp70 molecular chaperones.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 2, (2015).</li>
<li>Nillegoda, N. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crucial+HSP70+co-chaperone+complex+unlocks+metazoan+protein+disaggregation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Crucial HSP70 co-chaperone complex unlocks metazoan protein disaggregation.</a> Nature. 524 (7564), 247-251 (2015).</li>
<li>Nillegoda, N. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+an+intricate+J-protein+network+driving+protein+disaggregation+in+eukaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Evolution of an intricate J-protein network driving protein disaggregation in eukaryotes.</a> Elife. 6, (2017).</li>
<li>Kirstein, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+properties+of+the+disaggregase+function+of+J-proteins+and+Hsc70+in+Caenorhabditis+elegans+stress+and+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">In vivo properties of the disaggregase function of J-proteins and Hsc70 in Caenorhabditis elegans stress and aging.</a> Aging Cell. 16 (6), 1414-1424 (2017).</li>
<li>Nillegoda, N. B., Wentink, A. S., Bukau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+Disaggregation+in+multicellular+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Protein Disaggregation in multicellular organisms.</a> Trends in Biochemical Sciences. 43 (4), 285-300 (2018).</li>
<li>Chae, C., Sharma, S., Hoskins, J. R., Wickner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CbpA%2C+a+DnaJ+homolog%2C+is+a+DnaK+co-chaperone%2C+and+its+activity+is+modulated+by+CbpM%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">CbpA, a DnaJ homolog, is a DnaK co-chaperone, and its activity is modulated by CbpM.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (32), 33147-33153 (2004).</li>
<li>Kityk, R., Kopp, J., Mayer, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Mechanism+of+J-domain-Triggered+ATP+Hydrolysis+by+Hsp70+Chaperones%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular Mechanism of J-domain-Triggered ATP Hydrolysis by Hsp70 Chaperones.</a> Molecular Cell. 69 (2), 227-237 (2018).</li>
<li>Söderberg, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+proteins+and+their+interactions+in+cells+and+tissues+using+the+in+situ+proximity+ligation+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Characterizing proteins and their interactions in cells and tissues using the in situ proximity ligation assay.</a> Methods. 45 (3), 227-232 (2008).</li>
<li>Benschop, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+consensus+of+core+protein+complex+compositions+for+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">A consensus of core protein complex compositions for Saccharomyces cerevisiae.</a> Molecular Cell. 38 (6), 916-928 (2010).</li>
<li>Jung, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+RNA-protein+interactions+in+situ+using+modified-MTRIPs+and+proximity+ligation%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Quantifying RNA-protein interactions in situ using modified-MTRIPs and proximity ligation.</a> Nucleic Acids Research. 41 (1), (2013).</li>
<li>Mocanu, M. M., Váradi, T., Szöllosi, J., Nagy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+fluorescence+resonance+energy+transfer+%28FRET%29+and+proximity+ligation+assay+%28PLA%29%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of fluorescence resonance energy transfer (FRET) and proximity ligation assay (PLA).</a> Proteomics. 11 (10), 2063-2070 (2011).</li>
<li>Sekar, R. B., Periasamy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+resonance+energy+transfer+%28FRET%29+microscopy+imaging+of+live+cell+protein+localizations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Fluorescence resonance energy transfer (FRET) microscopy imaging of live cell protein localizations.</a> Journal of Cell Biology. 160 (5), 629-633 (2003).</li>
<li>Deriziotis, P., Graham, S. A., Estruch, S. B., Fisher, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+protein-protein+interactions+in+live+cells+using+bioluminescence+resonance+energy+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Investigating protein-protein interactions in live cells using bioluminescence resonance energy transfer.</a> Journal of Visualized Experiments. 87, (2014).</li>
<li>Nagy, P., Szöllosi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proximity+or+no+proximity%3A+that+is+the+question+%E2%80%93+but+the+answer+is+more+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Proximity or no proximity: that is the question – but the answer is more complex.</a> Cytometry. 75 (10), 813-815 (2009).</li>
<li>Hoetelmans, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+acetone%2C+methanol%2C+or+paraformaldehyde+on+cellular+structure%2C+visualized+by+reflection+contrast+microscopy+and+transmission+and+scanning+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Immunohistochemistry+%26+Molecular+Morphology%22%5BJournal%5D)">Effects of acetone, methanol, or paraformaldehyde on cellular structure, visualized by reflection contrast microscopy and transmission and scanning electron microscopy.</a> Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 9 (4), 346-351 (2001).</li>
<li>Schnell, U., Dijk, F., Sjollema, K. A., Giepmans, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunolabeling+artifacts+and+the+need+for+live-cell+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Immunolabeling artifacts and the need for live-cell imaging.</a> Nature Methods. 9 (2), 152-158 (2012).</li>
<li>Stadler, C., Skogs, M., Brismar, H., Uhlen, M., Lundberg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+fixation+protocol+for+proteome-wide+immunofluorescence+localization+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteomics%22%5BJournal%5D)">A single fixation protocol for proteome-wide immunofluorescence localization studies.</a> Journal of Proteomics. 73 (6), 1067-1078 (2010).</li>
<li>Goldenthal, K. L., Hedman, K., Chen, J. W., August, J. T., Willingham, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postfixation+detergent+treatment+for+immunofluorescence+suppresses+localization+of+some+integral+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+%26+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Postfixation detergent treatment for immunofluorescence suppresses localization of some integral membrane proteins.</a> Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 33 (8), 813-820 (1985).</li>
<li>Schrader, M., Almeida, M., Grille, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postfixation+detergent+treatment+liberates+the+membrane+modelling+protein+Pex11beta+from+peroxisomal+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry+%26+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Postfixation detergent treatment liberates the membrane modelling protein Pex11beta from peroxisomal membranes.</a> Histochemistry & Cell Biology. 138 (3), 541-547 (2012).</li>
<li>Willingham, M. C., Yamada, S. S., Pastan, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructural+antibody+localization+of+alpha2-macroglobulin+in+membrane-limited+vesicles+in+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Ultrastructural antibody localization of alpha2-macroglobulin in membrane-limited vesicles in cultured cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 75 (9), 4359-4363 (1978).</li>
<li>Aguilar-Uscanga, B., Francois, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+study+of+the+yeast+cell+wall+composition+and+structure+in+response+to+growth+conditions+and+mode+of+cultivation%5BTitle%5D)+AND+%22Letters+in+Applied+Microbiology%22%5BJournal%5D)">A study of the yeast cell wall composition and structure in response to growth conditions and mode of cultivation.</a> Letters in Applied Microbiology. 37 (3), 268-274 (2003).</li>
<li>Romaniuk, J. A., Cegelski, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+cell+wall+composition+and+the+influence+of+antibiotics+by+cell-wall+and+whole-cell+NMR%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+Transactions+of+the+Royal+Society+of+London.+Series+B%2C+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Bacterial cell wall composition and the influence of antibiotics by cell-wall and whole-cell NMR.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 370, 1679(2015).</li>
<li>Salazar, O., Asenjo, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+lysis+of+microbial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Letters%22%5BJournal%5D)">Enzymatic lysis of microbial cells.</a> Biotechnology Letters. 29 (7), 985-994 (2007).</li>
<li>Cunningham, A. F., Spreadbury, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycobacterial+stationary+phase+induced+by+low+oxygen+tension%3A+cell+wall+thickening+and+localization+of+the+16-kilodalton+alpha-crystallin+homolog%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Mycobacterial stationary phase induced by low oxygen tension: cell wall thickening and localization of the 16-kilodalton alpha-crystallin homolog.</a> Journal of Bacteriology. 180 (4), 801-808 (1998).</li>
<li>Werner-Washburne, M., Braun, E., Johnston, G. C., Singer, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stationary+phase+in+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Stationary phase in the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Microbiological Reviews. 57 (2), 383-401 (1993).</li>
</ol>

著者は何も開示していない。

共免疫沈殿および共局在化ベースのアプローチは、タンパク質集合を特徴付ける長年の方法として使用されてきた。一過性に形成された特定のシャペロン錯体の検出は、このような従来の方法では大きな課題であり、その結果、以前の所見は主に定性的解釈に限定される。細胞リシスベースの共免疫沈殿技術は、多くの場合、タンパク質とタンパク質の相互作用を安定させるために架橋を必要とします。細胞リシスは、一過性に形成されたシャペロン複合体を破壊するリスクを増加させる一方、架橋は、特にほとんどのシャペロンの固有の「粘着性」によって駆動される非ネイティブ相互作用を導入する可能性がある。共免疫沈殿を用いてHsp70シャペロン系を解析する場合、潜在的なアーティファクトは(a)シャペロンの高い発現レベルおよび(b)膜またはタンパク質凝集結合シャペロン機械に関する溶解性の問題から生じる可能性がある。また、共免疫沈殿ベースの技術は、捕捉されたタンパク質アセンブリの細胞局在化に関する情報を提供しない。共免疫沈殿技術を使用する欠点は、タンパク質の局在性情報を保存する共局在ベースのアプローチでは幾分減少します。しかし、2つ以上のタンパク質の共局在は、細胞内の同じマイクロドメインへのタンパ...

膨大な量のゲノム情報は、細胞相互作用の我々の不完全な理解のために解釈できないままである。従来のタンパク質とタンパク質の相互作用検出方法は、化学的架橋およびタンパク質の共局在化を伴うタンパク質共免疫沈殿などの方法論であるが、広く使用されているが、様々な欠点を提起する。主な欠点のいくつかは、相互作用の定量化が不十分であり、非ネイティブ結合イベントの潜在的な導入が含まれます。これに対し、新しい近接ベースの技術は、細胞内のタンパク質相互作用を捕捉するための代替的かつ強力なアプローチを提供します。近接ライゲーションアッセイ(PLA)1は、現在独自のキットとして利用可能であり、相互作用するサブユニットの近接性に基づいてタンパク質複合体を特異的に標的とする抗体を採用している。
PLAは、標的タンパク質複合体の表面に小さなDNAタグ(PLAプローブ)を持つ一次および二次抗体からなる足場の形成によって開始される(図1、ステップ1-3)。次に、DNAタグの近接性によって決定され、コネクタオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションを介して円形DNA分子が生成される(図1、ステップ4)。円形DNAの形成は、DNAライゲーション工程によって完了する。新たに形成されたDNAの円形片は、共役オリゴヌクレオチドタグの1つによってプライミングされた後続の転がり円増幅(RCA)ベースのポリメラーゼ連鎖反応(PCR)のテンプレートとして機能する。これにより、抗体足場を介してタンパク質複合体に付着した一本鎖連結DNA分子が生成される(図1、ステップ6)。連結DNA分子は、増幅されたDNAに散在する複数のユニークな配列にハイブリダイズする蛍光標識オリゴヌクレオチドを用いて可視化される(図1、ステップ7)2)生成されたPLAシグナルは、蛍光ドット(図1、ステップ7)として現れ、細胞内の標的タンパク質複合体の位置に対応する。その結果、アッセイは高い空間精度でタンパク質複合体を検出することができました。この技術は、単にタンパク質相互作用を捕捉するだけではなく、高感度1、2のタンパク質上の単一分子またはタンパク質修飾を検出するためにも利用することができる。
Hsp70は、ハウスキーピングおよびストレス関連機能の配列に参加することにより、細胞タンパク質恒常性を維持するために根本的に重要な非常に汎用性の高いシャペロンシステムを形成する。Hsp70シャペロンシステムのハウスキーピング活動には、デノボタンパク質折りたたみ、細胞膜間のタンパク質転移、タンパク質複合体の組み立ておよび分解、タンパク質活性の調節および異なるタンパク質折りたたみ/リンクが含まれます。品質管理機械3.同じシャペロンシステムはまた、誤った折り畳み/展開されたタンパク質を折りたたみ、タンパク質凝集を防止し、タンパク質の分解を促進し、細胞プロテアーゼと協力して、末端に誤った折り畳み/損傷を受けたタンパク質を分解し、細胞修復を容易にします。プロテオトキシックストレス4,5.この機能的多様性を達成するために、Hsp70シャペロンは、Hsp70のATP依存性アロステリック制御を微調整するJDPファミリーとヌクレオチド交換因子(NEF)のパートナーシップコシャペロンに依存し、基質結合および放出3、 6.さらに、JDPコシャペロンは、この汎用性の高いシャペロンシステムの基板選定において重要な役割を果たします。このファミリーのメンバーは、プロトタイプJDP、大腸菌DnaJに対する構造相同性に基づいて3つのクラス(A、BおよびC)に細分化される。クラスA JGPは、Hsp70と相互作用するN末端Jドメイン、グリシンフェニルアラニン豊富な領域、亜鉛指様領域(ZFLR)と2つのβバレルドメインからなる基質結合領域、およびC末端二量化ドメインを含む。N末端Jドメインおよびグリシンフェニルアラニンが豊富な領域を有するJGPは、ZFLRを欠いているが、クラスBに分類される。一般に、これら 2 つのクラスのメンバは、チャペロン関数に関与しています。Jドメイン4のみを共有するJGPを含むキャッチオールクラスCに該当するメンバーは、Hsp70sを募集して様々な非チャペロン機能を実行します。Hsp70システムの交換可能な基板認識「アダプター」としてのJDPの重要な役割は、進化中の家族の拡大によって反映される。たとえば、人間には 42 を超える異なる JDP メンバー4があります。これらのJDFは、モノマー、ホモダイマーおよび/またはホモ/ヘテロオリゴマー4、5として機能します。近年、クラスA間の一過性複合体形成による機能的協力(例えば、H.サピエンスDNAJA2;S. セレビシエYdj1) とクラス B (例えば, H.サピエンスDNAJB1;S.セレビシエSis1)真核生物JDPは、インビトロ7,8における非晶質タンパク質凝集体の効率的な認識を促進することが報告された。これらの混合クラスJDP複合体は、おそらくHsp70-およびHsp70+Hsp100ベースのタンパク質分解ガス7、8、9の形成を容易にするために凝集タンパク質の表面に集合する10.真核細胞におけるこれらの一過性形成混合クラスJDP複合体の存在を支持する重要な証拠をPLA8で提供した。
PLAは、主に哺乳動物細胞におけるメタゾアにおけるタンパク質相互作用の評価にますます採用されています。ここでは、真核生物および原核生物単細胞生物(発芽酵母S.セレビシエおよび細菌大腸菌)において一過性に形成されたシャペロン複合体をモニタリングするこの技術の拡大に成功したと報告する。重要なことに、この拡張は、ヒトおよび動物細胞に感染する微生物を検出および分析する際のPLAの潜在的な使用を強調している。

<table><tbody><tr><td>37% ホルムアルデヒド</td><td>メルク</td><td>103999</td><td></td></tr><tr><td>アセトン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>32201</td><td></td></tr><tr><td>抗 DNAJA2 抗体</td><td>Abcam</td><td>ab157216</td><td></td></tr><tr><td>抗 DNAJB1 抗体</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>ADI-SPA-450</td><td></td></tr><tr><td>抗 DnaK 抗体</td><td>社内</td><td></td><td></td></tr><tr><td>抗 mCherry 抗体</td><td>Abcam</td><td>ab125096</td><td></td></tr><tr><td>抗 Sis1 抗体</td><td>Cosmo Bio Corp</td><td>COP-080051</td><td></td></tr><tr><td>抗 Ydj1 抗体</td><td>StressMarq Biosciences</td><td>&nbsp;SMC-150、</td><td></td></tr><tr><td>抗YFP抗体</td><td>社内</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coplin スライド染色ジャー</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5516</td><td></td></tr><tr><td>診断スライド</td><td>マリエンフェルト</td><td>1216530</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>サーモフィッシャー</td><td>31966021</td><td></td></tr><tr><td>DuoLink In Situ 検出試薬 オレンジ</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO92007</td><td></td></tr><tr><td>DuoLink In封入剤 + DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO82040</td><td></td></tr><tr><td>DuoLink In Situ PLA プローブ 抗マウス MINUS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO92004</td><td></td></tr><tr><td>DuoLink In Situ PLA プローブ Anti-Rabbit PLUS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO92002</td><td></td></tr><tr><td>DuoLink In Situ 洗浄バッファー、蛍光</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO82049</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Calf Serum</td><td>Thermo-Fischer</td><td>10082147</td><td></td></tr><tr><td>リゾチーム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>62971</td><td></td></tr>メタ<tr><td>ノール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>32213</td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr>ペ<tr><td>ニシリン/ストレプトマイシン</td><td>サーモフィッシャー</td><td>15070063</td><td></td></tr><tr><td>ポリ-L-リジン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P47-07</td><td></td></tr><tr><td>ソルビトール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7547</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X100</td><td>メルク</td><td>108643</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン</td><td>サーモフィッシャー</td><td>25300096</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>ジモラーゼ 100T / / Lyticase</td><td>米国 バイオロジカル</td><td>Z1004</td><td></td></tr></tbody></table>

細菌、酵母、ヒト細胞における一過性形成分子シャペロンアセンブリのモニタリング

In Situ Monitoring of Transiently Formed Molecular Chaperone Assemblies in Bacteria, Yeast, and Human Cells

Jドメインタンパク質(JGP)は、真核細胞において最大かつ最も多様なコシャペロンファミリーを形成します。最近の知見は、JDPファミリーの特定のメンバーが真核生物の一過性ヘテロ複合体を形成し、70 kDaヒートショックタンパク質(Hsp70)シャペロンベースのタンパク質分解物の基質選択を微調整できることを示している。JDP複合体は、急性/慢性ストレス誘発凝集タンパク質を標的とし、タンパク質凝集体の表面に複数のHsp70sをリクルートすることにより、逆凝縮物を組み立てるのに役立つ可能性があります。これらの物理的に相互作用するJDPによって形成されるタンパク質品質管理(PQC)ネットワークの程度は、生体内ではほとんど特徴付けられていないままである。ここでは、近接ライゲーションアッセイ(PLA)と名付けられたその中の顕微鏡ベースのタンパク質相互作用アッセイについて説明し、真核細胞の異なる細胞区画においてこれらの一時的に形成されたシャペロン錯体を強く捕捉することができる。我々の研究は、PLAの雇用をヒト細胞から酵母(サッカロマイセス・セレビシエ)および細菌(エシェリヒア・コリ)に拡大し、両方で一過性に形成されたタンパク質アセンブリのダイナミクスを監視する重要なツールを提供する。原核生物および真核細胞。

精製タンパク質を用いたインビトロ研究では、ヒトクラスAとクラスB JDPのサブセットが一時的な混合クラスJDP複合体を形成し、広範囲の凝集タンパク質を効率的に標的化し、Hsp70ベースの組み立てを容易にすることを明らかにした。タンパク質の分解性7.PLAを用いて、ヒト子宮頸癌細胞(HeLa)に混合クラス(A+B)JDP複合体が生じるかどうかを判定した。ヒトJGP DNAJA2(クラスA)およびDNAJB1(クラスB)を、高特異的一次抗体および二次PLAプローブで標的とした(図2A-C)。赤色蛍光穿刺の出現は、HeLa細胞における混合クラスDNAJA2およびDNAJB1複合体の存在を示した(図2C)。.各穿クトは、HeLa細胞サイトゾル/核における個々のタンパク質相互作用イベントを表す。
フェルスター共鳴エネルギー伝達(FRET)から得ら...

コグネートJドメインタンパク質はHsp70シャペロンと協力して、タンパク質の折りたたみから分解に至るまで、無数の生物学的プロセスを支援します。ここでは、細菌、酵母およびヒト細胞におけるこれらの一時的に形成されたシャペロン機械のモニタリングを可能にする、その場近近性ライゲーションアッセイについて説明する。

J-domain proteins (JDPs) form the largest and the most diverse co-chaperone family in eukaryotic cells. Recent findings show that specific members of the ...

この方法は、細菌や酵母などの生物や異なる細胞タイプの一過性タンパク質相互作用を捕捉します。ここでは、細胞プロテオスタシスに関与する一過性に形成された特異的シャペロン複合体を監視します。この技術の主な利点は、原核細胞および真核細胞におけるタンパク質集合体のダイナミクスおよび細胞下局在化に関する情報を生成する能力である。細菌や酵母のような単細胞生物におけるこの技術の適応は、研究者が微生物感染に関連する疾患を調査するための強力なツールとしてそれを使用することを可能にする。この技術は、プロトコルのサンプル調製段階で条件を変更するだけで、ほぼすべての生物のタンパク質相互作用を分析するために使用される可能性があります。免疫組織化学、免疫蛍光、ELISA、または免疫沈降のいずれかに特異的かつ試験された良質の抗体を選択することが重要です。ポリL-リジンで10ウェル診断スライドを事前に処理することで始めます。100マイクロリットルの無菌を加え、各ウェルに0.0001%ポリL-リジンを濾過し、無菌層流れフードで30分間スライドをインキュベートします。次に、50マイクロリットルの無菌水でそれぞれをよく洗い、余分なポリL-リジンを除去します。細胞の種類に応じてウェルあたり約15,000個の細胞を添加し、5%の二酸化炭素を60〜80%の合流度で摂氏37度で無菌湿気の培養器で細胞を成長させます。24時間後、各ウェルの端にティッシュペーパーを置くことによって成長培地を取り除き、50マイクロリットルのPBSで細胞を3回洗浄した。次に、PBSに50マイクロリットルの新鮮な4%パラホルムアルデヒドを各ウェルに加え、室温で10分間インキュベートして細胞を固定します。固定後、スライド染色瓶にPBSを入れ、スライドを3回洗います。取り付けられた細胞の膜を透過するには、スライドをPBSで0.5%トリトン-X100の100ミリリットルに沈め、室温で10分間細胞をインキュベートする。その後、TBS-Tで3回スライドを洗浄します。最後の洗浄後、ティッシュペーパーで余分なバッファーを取り除きます。原稿の方向に従ってS.cerevisiae細胞を増殖して希釈し、50ミリリットルの遠心分離管とペレットに移し、665倍gで665倍の遠心分離を行います。上清を取り除き、新鮮な培地の5ミリリットルで細胞を再懸濁します。その後、550マイクロリットルのホルムアルデヒドを加えて4%の最終濃度を得て、室温で培養を15分間インキュベートして細胞を固定します。インキュベーション後、ペレット細胞を、上清を除去し、洗浄バッファーに調製したての4%パラホルムアルデヒドの1ミリリットルでペレットを再懸濁した。室温で細胞を45分間インキュベートする。一方、0.0001%ポリL-リジン溶液の100マイクロリットルを各ウェルに加え、室温で30

in-situ-monitoring-transiently-formed-molecular-chaperone-assemblies

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

このプロトコルでは熱ショック後に細胞内タンパク質のリフォールディングを測定する方法が記載されている。このメソッドは、その活性に影響を与えることができる分子シャペロンとその補因子または化合物のようなfoldasesを研究するために使用することができます。ホタルルシフェラーゼ活性は、シャペロンのリフォールディング活性を測定するためのレポーターとして使用されます。...

細胞内のリフォールディングアッセイ

出典: Dahl, J. ほか。 大 腸菌 シャペロンHdeBのpH依存活性の検出 in vitro および in vivo。 J. Vis. Exp.

モデルタンパク質の熱展開による細菌シャペロン活性の評価

細胞の生存率は、タンパク質のミスフォールディングのタイムリーかつ効率的な管理に依存します。包有物中のフォールディング、劣化、または隔離：ここでは、ミスフォールドタンパク質の異なる潜在的運命を可視化するための方法を説明します。我々はUbc9、折り畳みセンサーの使用方法を示してい...

生細胞中のタンパク質凝集の4Dイメージング

この資料は、調査するホタルルシフェラーゼ-GFP融合タンパク質の使用を記載...

のリフォールディング監視タンパク質を結合アッセイ<em&gt;サッカロミセス·セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）</em

この記事では、目的のタンパク質と大腸菌の他の因子との間の相互作用を監視するために、パルスチェイス無線標識と部位特異的なフォトクロスリンクを組み合わせて使用する方法を示します。従来の化学的架橋法とは異なり、このアプローチは、生細胞内の秩序あるアセンブリ経路の高解像度の「スナップショット」を生成します。...

部位特異的架橋法を用いた分泌細菌病原性因子の集合体のモニタリング

この研究は、酸性pH条件下で大腸菌 HdeBのシャペロン活性を特徴づけるために、生物物理学的生化学的および分子技術を説明しています。これらのメソッドは、成功し、このようなHdeAなどの他の酸保護シャペロンに適用されており、他のシャペロンとストレス条件のために働くように修正することができます。...

のpH依存性活性の検出<em&gt;エシェリヒア・コリ</em&gt;シャペロンHdeB<em&gt;インビトロ</em&gt;と<em&gt;インビボ</em

私たちは、細胞の完全性とタンパク質の恒常性を維持する枯渇救済実験の方法を説明しています。アデノフェクションは、有糸分裂細胞分裂や筋形成など、アクチンベースの微細なダイナミクスに依存する生物学的プロセス内のタンパク質を単一細胞レベルで機能解析することを可能にします。...

Adenofection：枯渇-レスキュー実験によって細胞Morphodynamicsにおける分子シャペロンの役割を研究するための方法

生物がその有効期間中に発生する最も困難なストレス条件の 1 つは酸化物質の蓄積を含みます。酸化ストレス時に細胞は分子シャペロンに大きく依存します。HDX MS...

Hsp33 の酸化還元規制シャペロン活性を定義および水素重水素交換質量分析法による Hsp33 の構造変化をマッピング

cDNAの速度論的架橋と解析は、生細胞におけるタンパク質-RNA相互作用のダイナミクスを高い時間分解能で調べることができる方法です。ここでは、酵母細胞の増殖、UV架橋、収穫、タンパク質精製、次世代シーケンシングライブラリ調製ステップなど、プロトコルについて詳しく説明します。...

χCRACを用いたin vivoでのタンパク質-RNA相互作用ダイナミクスの高時間分解能モニタリング

シャペロン-シャペロンとシャペロン基質相互作用を研究するために、我々は、軽度の突然変異またはシャペロンの過剰発現と組み合わせてRNA干渉を使用して カエノハブディティス・エレガンス...

カエノハブディティス・エレガンスを使用して組織特異的シャペロン相互作用をスクリーニングする

このプロトコルは、グルタチオン結合ドナービーズとGST融合TPR-モチーフコシャペロンおよびアクセプタービーズとHsp90由来ペプチドを結合してタンパク質とタンパク質相互作用を調べるための技術を提示する。この技術を用いて、Hsp90-FKBP51またはHsp90-FkbP52相互作用を破壊する小分子をスクリーニングし、強力で選択的なHsp90-FKBP51相互作用阻害剤を同定しました。...

均質ビーズベースアッセイを用いたシャペロンコカペロン相互作用の研究

学ぶ 細菌、酵母、ヒト細胞における一過性シャペロン複合体のモニタリング手法。in situ近接結合アッセイを用いてJドメインタンパク質とHsp70の相互作用を可視化し、細胞内プロテオスタシスの動態解明に貢献します。

細菌、酵母、ヒト細胞における一過性形成分子シャペロンアセンブリのモニタリング

さらに動画を探す