Name: 細胞および組織におけるコエンザイムAの定量 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 51 s
Description: 学ぶコエンザイムAの定量法。培養細胞や動物組織からのサンプル調製、抽出、高性能液体クロマトグラフィーによる検出を含む。代謝研究や神経変性疾患の研究に有用です。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

著者らは、BridgeBio LLCの子会社であるCoAセラピューティクス社、国立衛生研究所補助金GM34496、およびアメリカのレバノン・シリア関連慈善団体が提供する研究に対する資金提供を認めている。

このプロトコルで言及された動物の手順は、プロトコル323および556に従って行われ、特にセントジュード小児研究病院機関動物ケアおよび使用委員会によって承認されました。
1. ソリューションの準備
注:すべての溶液に対して、および手順に記載されている場合は、超純水を使用してください。
<ol><li>水中に水酸化カリウム(KOH)1mを調調します。</li>
	<li>水に0.25 M KOHを準備します。</li>
	<li>水中で1 M Trizma-HClを準備し、pH 8.0に調整します。</li>
	<li>アセトニトリル(オプティマグレード)で100mMモノブロブロビマン(mBBr)を調調します。mBBrのストック溶液は、光への暴露がビマネ26にモノブロボビマンを光線化することができるので、暗闇の中で保たれれば、何ヶ月も-20°Cで安定している。</li>
	<li>固相抽出(SPE)カラム用洗浄バッファーを調味する:50%メタノール(オプティマグレード)+2%酢酸。</li>
	<li>SPEカラム用溶出バッファーを調用:50mMアンモニウムを含む95%エタノール(HPLCグレード)。</li>
</ol>2. CoA-ビマネ規格の作成
<ol><li>評判の良いソース(例えば、アバンティ極性脂質社)から高品質のCoA規格を購入します。</li>
	<li>20 mMトリス、pH 8でCoAの高濃度ストック溶液を調調します。高濃度ストック中のCoAの量はλ260nm(μ=16,800 M-1∙cm-1)の分光光光度で決定または確認される。mBBrの4倍モル過剰を追加します。10sの高い渦。たとえば、バッファー内の 10 mM CoA の場合は、40 mM mBBr を追加します。mBBr は、すべての CoA が派生していることを確認するために過剰に追加されます。</li>
	<li>mBBrでCoAを誘導するために揺れることなく、暗闇の中で4時間室温でインキュベートする。mBBrはCoAのチオール基と反応し、pHおよび温度依存性27である。mBBrの添加は、CoAを水溶性蛍光(または紫外線吸収剤)CoA-ビマネ(CoA-ビマネ)に変換します。図 2)</li>
	<li>100 μL 酢酸と渦を10sの高さで加えて反応を止める。</li>
	<li>2,000 x gで15分間遠心分離機を使用して、沈殿物を除去します。</li>
	<li>SPEカラムを使用して上清をクリーンアップし、未反応のmBBrを除去する(後述)。SPEカラムクリーンアップ後の溶出物の濾過および遠心分離は必要ありません(セクション5.8)。</li>
	<li>予め計量されたチューブにCoA-bimaneを含むSPEカラムから溶出液を収集し、窒素ガスの下で乾燥し、重量を量り、CoA-bimaneの既知の量で標準的な校正曲線を構築します。<ol>
<li>hPLCによる純度のCoA-bimane規格(下記参照)は、λ260(アデニン部分参照)とλ393(ビマネ部分)の両方で吸光度検出を行い、クロマトグラムの両方のピークの一致を確認してください。</li>
		<li>高濃度ストックにおけるCoA-ビマネ規格の量を確認する (λ = 16,800 M-1∙cm-1)。</li>
	</ol>
</li>
	<li>CoA-ビマネ規格を使用して実験サンプルでCoA-bimaneを同定するためのHPLC保持時間を登録します。</li>
	<li>光から保護され、最大2年間-20°Cで保存されたCoA-bimane規格の高濃度ストックのアリコートを保存します。解凍を繰り返し、凍結を繰り返さないようにしてください。</li>
</ol>3. 培養細胞におけるCoAの抽出と誘導体化
<ol><li>後期サブコンフルエント密度に近づくと培養中の付着細胞を収穫する。例えば、ヒトHepG2/C3A細胞は、6-8 x 106の密度に成長するか、またはHEK 293T細胞は100mm皿当たり〜1.3 x 107の密度に成長する。<ol>
<li>CoA 判定には、重複カルチャまたは三部培養を日常的に使用します。サンプル細胞培養と並行して別々の培養皿をインキュベートし、生存可能な細胞数を決定する。HPLC精製後の106-107細胞当たりのCoA量を算出する。</li>
	</ol>
</li>
	<li>料理から培養媒体を吸引する。冷たいリン酸緩衝生理食べ物(PBS)で皿の上の細胞を素早く洗い流し、残留培地を取り除き、皿からPBSを吸引します。氷冷水で細胞を素早く洗い、残留PBSを除去し、皿から水を素早く吸引します。PBSまたは水を添加する際に付着細胞を乱さないようにしてください。</li>
	<li>培養皿に氷冷水1mLを加えます。皿の冷たい水に細胞をこすり、0.25 M KOHの400 μLおよび1.5 mLの水を含むガラス試験管に細胞懸濁液を移す。<ol>
<li>10秒間、渦で激しく懸濁液を混ぜます。その後、パラフィンフィルムでしっかりと覆い、水風呂で振ることなく1時間55°Cでインキュベートします。試料のpHは≥12でなければなりません。高pHはCoAチオエステルを加水分解するために重要であり、必要に応じてKOHの追加のアリコートで調整することができる。</li>
	</ol>
</li>
	<li>低速で遠心分離により懸濁液中で増殖する培養細胞:4°Cで6分間136xg。 氷冷PBSで一度洗い、冷たい水でもう一度洗い直し、最後に2.5 mLの冷たい水と400 μL 0.25 M KOHで再度再水を行います。上述したように、強く混合し、55 °Cでインキュベートします。</li>
	<li>1 M Trizma-HCl の 160 μL と 100 mM mBBr の 10 μL を加え、高い渦で 10 s を混合します。これにより、pHは約8にをもたらし、自由CoAでmBBr反応を支持する。mBBrがCoAのチオールと反応するために、暗闇の中で2時間室温でサンプルをカバーし、インキュベートします。</li>
	<li>酢酸の100 μLを追加し、反応を停止するために10sの高い渦で混合</li>
	<li>2,000 x gで15分間遠心分離機を使用して、沈殿した細胞の破片を除去します。</li>
	<li>以下に説明する SPE カラムクリーンアップ用のガラス試験管に上清を取り外して保存します。</li>
</ol>4. 組織におけるCoAの抽出と誘導化
<ol><li>動物の組織片を直径約0.5cm以下で解剖し、吸収性紙上で一時的に(1-2秒)ブロットし、液体窒素中でフラッシュ凍結し、処理するまで-80°Cで保存します。組織内のCoAは、フラッシュ凍結しない場合、加水分解またはチオエステルに変換されます。このステップは、組織におけるCoAの最大収率を得るために重要である。</li>
	<li>分析を開始する前に、凍結組織片(5~60mg)を素早く計量し、各サンプルの重量を記録します。この湿量決定は、HPLC精製後のCoA含有量の計算に使用されます。組織片の完全な解凍を避けてください。</li>
	<li>プローブの挿入とロータステータホモジナイザーによる組織破壊のために運命づけられたガラス試験管に1mM KOHの2 mLを追加します。使用するまでチューブを氷の上に置いてください。これは、サンプルが低温で均質化され、均質化時に発生する熱によってCoAが破壊されないようにするために行われます。</li>
	<li>30 s.組織の完全な解凍を避けるために、ガラス試験管(冷たい1 mM KOHを含む)に組織(30 - 40 mg)を移送し、均質化します。</li>
	<li>0.25 M KOHの500 μLを加えます。渦は10sの高さにあり、すべてのサンプルが均質化されるまで氷の上に保つ。これは、12以上のサンプルのpHをもたらし、CoAチオエステルを加水分解して合計CoA(無料CoA+加水分解CoAチオエステスター)を得る。</li>
	<li>加水分解をサポートするために振ることなく、水浴中で55°Cで2時間サンプルをインキュベートします。</li>
	<li>1 M Trizma-HCl の 150 μL と 100 mM mBBr の 10 μL を追加します。渦は10秒間高く上がった。これにより、pHを約8にし、遊自由CoAでmBBr反応を支持する。</li>
	<li>すべてのCoAがmBBrで導出されることを保障するために暗闇の中で2時間の室温でサンプルをインキュベートする。</li>
	<li>100 μL の酢酸と渦を10sの高さで加えて反応を止める。</li>
	<li>ペレット沈殿細胞破片に15分間2,000 x gで遠心分離機。</li>
	<li>SPEカラムクリーンアップ用のガラス試験管に上清を取り外して保存します(後述)。</li>
</ol>5. 固相抽出(SPE)カラムを使用したサンプルクリーンアップ
<ol><li>室温で、各使い捨て2-ピリジル-エチルシリカゲルカラム(1mLサイズ)を1mLのウォッシュバッファーで平衡化し、ピリジル機能基がプロトン化され、アニオン交換器として機能することを確認します。2-(2-ピリジル)-エチルシリカゲルは、塩基pHでCoA-ビマネに最適な弱いアニオン交換器です。2-(2-ピリジル)-エチルシリカゲルは6のpKaを有し、溶出はpH≥7を行う。</li>
	<li>カラムにサンプル上清(ステップ4.11)を追加し、溶出物を収集します。</li>
	<li>1 mLの洗浄バッファーでカラムを2回洗浄し、保持されていない種を除去します。</li>
	<li>1mLの水でコラムを1回洗います。</li>
	<li>1 mLの溶出バッファーでカラムを別のガラス試験管(12mm x 75mm)に2回洗浄し、CoA-bimaneを回収します。</li>
	<li>窒素ガス下のチューブ中のCoA-bimaneサンプルを乾燥させます。乾燥した試料は、さらに使用するまで室温で安定しています。シールし、チューブとストアを完全にカバーします。</li>
	<li>HPLC分析の準備ができたら、300 μLの水でサンプルを再中断し、10秒間高い渦で激しく混合します。</li>
	<li>再懸濁サンプルを遠心管フィルター(0.22 μmセルロース酢酸塩、2 mLサイズ)に移し、遠心分離機を10分間5,000 x gで10分間取り除き、沈殿物を除去します。</li>
	<li>HPLC注入に適したガラスバイアルに濾過されたサンプルを移す。</li>
</ol>6. CoA-ビマネのHPLC精製と測定
<ol><li>バッファーを準備します。バッファ A: 50 mM KH2PO4,pH 4.6;バッファB:アセトニトリル(オプティマグレード)。</li>
	<li>HPLC システムの電源を入れします。 注:私たちの実験室のHPLCシステムは2489紫外線可視(UV-Vis)吸光器およびEmpower 3ソフトウェアによって制御される2475蛍光検出器が装備されているウォーターズe2695分離モジュールである。システムに自動化されたサンプル注入器がある。</li>
	<li>Gemini C18、3 μm 100 Å、4.6 mm x 150 mm カラムの各サンプルを0.5 mL/minの流量で表1に注入します。カラム温度は25°Cです。λ393 nmでのUV/可視検出器の吸光度を測定し、λex = 393 nm、λem = 470 nmで蛍光検出を測定します。保持時間は、サンプルの各セットの前にCoA-bimane標準曲線を実行することによって決定されます。</li>
	<li>各サンプルの CoA-ビマネピークの下の領域を記録し、標準曲線と比較して、HPLC カラムに注入された CoA-ビマネの pmol を計算します。CoA-ビマネ吸光度標準曲線は組織サンプルに使用され、CoA-ビマネ蛍光標準曲線は組織培養サンプルに使用されます。</li>
	<li>CoA-ビマネ値は各サンプルのCoAの合計を表すので、培養サンプルの生存細胞数を正規化するか、組織試料に対してmg湿潤重量を測定する(図6)。または、各サンプルの DNA またはタンパク質含有量に正規化した後の CoA 値の合計を計算します。DNAまたはタンパク質含有量は、KOH添加前に試料調製中に除去されるサンプルアリコートを用いて別々に決定することができる。</li>
</ol>

<ol><li>Abiko, Y. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAbiko%2C+Y+%22Metabolic+Pathways%22">Metabolic Pathways</a>. Greenburg, D. M. 7, Academic Press, Inc. Ch. 7 1-25 (1975).</li>
<li>Leonardi, R., Zhang, Y. -M., Rock, C. O., Jackowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coenzyme+A%3A+Back+in+action%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Coenzyme A: Back in action.</a> Progress in Lipid Research. 44, 125-153 (2005).</li>
<li>Jackowski, S., Rock, C. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+coenzyme+A+biosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Regulation of coenzyme A biosynthesis.</a> Journal of Bacteriology. 148, 926-932 (1981).</li>
<li>Robishaw, J. D., Berkich, D. A., Neely, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rate-limiting+step+and+control+of+coenzyme+A+synthesis+in+cardiac+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Rate-limiting step and control of coenzyme A synthesis in cardiac muscle.</a> Journal of Biological Chemistry. 257, 10967-10972 (1982).</li>
<li>Di Meo, I., Carecchio, M., Tiranti, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inborn+errors+of+coenzyme+A+metabolism+and+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Inherited+Metabolic+Disease%22%5BJournal%5D)">Inborn errors of coenzyme A metabolism and neurodegeneration.</a> Journal of Inherited Metabolic Disease. 42, 49-56 (2019).</li>
<li>Zhou, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+pantothenate+kinase+gene+%28PANK2%29+is+defective+in+Hallervorden-Spatz+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">A novel pantothenate kinase gene (PANK2) is defective in Hallervorden-Spatz syndrome.</a> Nature Genetics. 28, 345-349 (2001).</li>
<li>Dusi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exome+sequence+reveals+mutations+in+CoA+synthase+as+a+cause+of+neurodegeneration+with+brain+iron+accumulation%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">Exome sequence reveals mutations in CoA synthase as a cause of neurodegeneration with brain iron accumulation.</a> American Journal of Human Genetics. 94, 11-22 (2014).</li>
<li>Dansie, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+roles+of+the+pantothenate+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Society+Transactions%22%5BJournal%5D)">Physiological roles of the pantothenate kinases.</a> Biochemical Society Transactions. 42, 1033-1036 (2014).</li>
<li>Leonardi, R., Rehg, J. E., Rock, C. O., Jackowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pantothenate+kinase+1+is+required+to+support+the+metabolic+transition+from+the+fed+to+the+fasted+state%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Pantothenate kinase 1 is required to support the metabolic transition from the fed to the fasted state.</a> PLoS ONE. 5, 11107(2015).</li>
<li>Leonardi, R., Rock, C. O., Jackowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pank1+deletion+in+leptin-deficient+mice+reduces+hyperglycaemia+and+hyperinsulinaemia+and+modifies+global+metabolism+without+affecting+insulin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Pank1 deletion in leptin-deficient mice reduces hyperglycaemia and hyperinsulinaemia and modifies global metabolism without affecting insulin resistance.</a> Diabetologia. 57, 1466-1475 (2014).</li>
<li>Israel, B. C., Smith, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+acute+and+chronic+ethanol+ingestion+on+pantothenate+and+CoA+status+of+rats%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Nutrition%22%5BJournal%5D)">Effects of acute and chronic ethanol ingestion on pantothenate and CoA status of rats.</a> The Journal of Nutrition. 117, 443-451 (1987).</li>
<li>Garcia, M., Leonardi, R., Zhang, Y. M., Rehg, J. E., Jackowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germline+deletion+of+pantothenate+kinases+1+and+2+reveals+the+key+roles+for+CoA+in+postnatal+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Germline deletion of pantothenate kinases 1 and 2 reveals the key roles for CoA in postnatal metabolism.</a> PLoS One. 7, 40871(2012).</li>
<li>Corbin, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excess+coenzyme+A+reduces+skeletal+muscle+performance+and+strength+in+mice+overexpressing+human+PANK2%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Genetics+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Excess coenzyme A reduces skeletal muscle performance and strength in mice overexpressing human PANK2.</a> Molecular Genetics and Metabolism. 120, 350-362 (2017).</li>
<li>Shumar, S. A., Kerr, E. W., Fagone, P., Infante, A. M., Leonardi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+Nudt7+decreases+bile+acid+levels+and+peroxisomal+fatty+acid+oxidation+in+the+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Overexpression of Nudt7 decreases bile acid levels and peroxisomal fatty acid oxidation in the liver.</a> Journal of Lipid Research. 60, 1005-1019 (2019).</li>
<li>Shumar, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+neuron-specific+degradation+of+Coenzyme+A+models+pantothenate+kinase-associated+neurodegeneration+by+reducing+motor+coordination+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Induction of neuron-specific degradation of Coenzyme A models pantothenate kinase-associated neurodegeneration by reducing motor coordination in mice.</a> PLoS ONE. 10, 0130013(2015).</li>
<li>Zano, S. P., Pate, C., Frank, M., Rock, C. O., Jackowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correction+of+a+genetic+deficiency+in+pantothenate+kinase+1+using+phosphopantothenate+replacement+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Genetics+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Correction of a genetic deficiency in pantothenate kinase 1 using phosphopantothenate replacement therapy.</a> Molecular Genetics and Metabolism. 16, 281-288 (2015).</li>
<li>Sharma, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+therapeutic+approach+to+pantothenate+kinase+associated+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">A therapeutic approach to pantothenate kinase associated neurodegeneration.</a> Nature Communications. 9, 4399(2018).</li>
<li>Alvarez-Cordoba, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pantothenate+Rescues+Iron+Accumulation+in+Pantothenate+Kinase-Associated+Neurodegeneration+Depending+on+the+Type+of+Mutation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Pantothenate Rescues Iron Accumulation in Pantothenate Kinase-Associated Neurodegeneration Depending on the Type of Mutation.</a> Molecular Neurobiology. 56, 3638-3656 (2019).</li>
<li>Arber, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iPSC-derived+neuronal+models+of+PANK2-associated+neurodegeneration+reveal+mitochondrial+dysfunction+contributing+to+early+disease%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">iPSC-derived neuronal models of PANK2-associated neurodegeneration reveal mitochondrial dysfunction contributing to early disease.</a> PLoS One. 12, 0184104(2017).</li>
<li>Di Meo, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acetyl-4%27-phosphopantetheine+is+stable+in+serum+and+prevents+phenotypes+induced+by+pantothenate+kinase+deficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Acetyl-4'-phosphopantetheine is stable in serum and prevents phenotypes induced by pantothenate kinase deficiency.</a> Scientific Reports. 7, 11260(2017).</li>
<li>Nishikawa, T., Edelstein, D., Brownlee, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+missing+link%3A+a+single+unifying+mechanism+for+diabetic+complications%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International+Supplements%22%5BJournal%5D)">The missing link: a single unifying mechanism for diabetic complications.</a> Kidney International Supplements. 77, 26-30 (2000).</li>
<li>Tsuchiya, Y., Pham, U., Gout, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+measuring+CoA+and+CoA+derivatives+in+biological+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Society+Transactions%22%5BJournal%5D)">Methods for measuring CoA and CoA derivatives in biological samples.</a> Biochemical Society Transactions. 42, 1107-1111 (2014).</li>
<li>Demoz, A., Netteland, B., Svardal, A., Mansoor, M. A., Berge, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+and+Detection+of+Tissue+Coash+and+Long-Chain+Acyl-Coa+by+Reversed-Phase+High-Performance+Liquid-Chromatography+after+Precolumn+Derivatization+with+Monobromobimane%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography%22%5BJournal%5D)">Separation and Detection of Tissue Coash and Long-Chain Acyl-Coa by Reversed-Phase High-Performance Liquid-Chromatography after Precolumn Derivatization with Monobromobimane.</a> Journal of Chromatography. 635, 251-256 (1993).</li>
<li>Shimada, K., Mitamura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivatization+of+Thiol-Containing+Compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography+B%22%5BJournal%5D)">Derivatization of Thiol-Containing Compounds.</a> Journal of Chromatography B. 659, 227-241 (1994).</li>
<li>Minkler, P. E., Kerner, J., Ingalls, S. T., Hoppel, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+isolation+procedure+for+short-%2C+medium-%2C+and+long-chain+acyl-coenzyme+A+esters+from+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Novel isolation procedure for short-, medium-, and long-chain acyl-coenzyme A esters from tissue.</a> Analytical Biochemistry. 376, 275-276 (2008).</li>
<li>Newton, G. L., Fahey, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+biothiols+by+bromobimane+labeling+and+high-performance+liquid+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Determination of biothiols by bromobimane labeling and high-performance liquid chromatography.</a> Methods in Enzymology. 251, 148-166 (1995).</li>
<li>Radkowsky, A. E., Kosower, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bimanes+.17.+%28Haloalkyl%29-1%2C5-Diazabicyclo%5B3.3.0%5DOctadienediones+%28Halo-9%2C10-Dioxabimanes%29+-+Reactivity+toward+the+Tripeptide+Thiol%2C+Glutathione%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Bimanes .17. (Haloalkyl)-1,5-Diazabicyclo[3.3.0]Octadienediones (Halo-9,10-Dioxabimanes) - Reactivity toward the Tripeptide Thiol, Glutathione.</a> Journal of the American Chemical Society. 108, 4527-4531 (1986).</li>
<li>Zhang, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+knockout+of+pantothenate+kinase+reveals+the+metabolic+and+genetic+program+responsible+for+hepatic+coenzyme+A+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry+%26+Biology%22%5BJournal%5D)">Chemical knockout of pantothenate kinase reveals the metabolic and genetic program responsible for hepatic coenzyme A homeostasis.</a> Chemistry & Biology. 14, 291-302 (2007).</li>
<li>Tokutake, Y., Onizawa, N., Katoh, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toyoda+A%2CChohnan+S.+Coenzyme+A+and+its+thioester+pools+in+fasted+and+fed+rat+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Toyoda A,Chohnan S. Coenzyme A and its thioester pools in fasted and fed rat tissues.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 402, 158-162 (2010).</li>
<li>Shibata, K., Nakai, T., Fukuwatari, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+high-performance+liquid+chromatography+determination+of+coenzyme+A%2C+dephospho-coenzyme+A%2C+and+acetyl-coenzyme+A+in+normal+and+pantothenic+acid-deficient+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Simultaneous high-performance liquid chromatography determination of coenzyme A, dephospho-coenzyme A, and acetyl-coenzyme A in normal and pantothenic acid-deficient rats.</a> Analytical Biochemistry. 430, 151-155 (2012).</li>
<li>Chohnan, S., Takamura, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+micromethod+for+measurement+of+CoASH+and+its+use+in+measuring+the+intracellular+levles+of+CoASH+and+short+chain+acyl-CoAs+in+Escherichia+coli+K12+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Agricultural+and+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A simple micromethod for measurement of CoASH and its use in measuring the intracellular levles of CoASH and short chain acyl-CoAs in Escherichia coli K12 cells.</a> Agricultural and Biological Chemistry. 55, 87-94 (1991).</li>
</ol>

MWF、CS、SJは論文を書き、MWFとCSはデータと数字を提供し、CORは実験を設計し、原稿を批判的にレビューしました。SJとCORは、この記事で参照されているPZ-2891化合物をカバーするセントジュード小児研究病院が保有する特許出願中の特許出願(PCT/US17/39037)「パントテネートキナーゼの小分子変調器」の発明者です。

ここでは、吸光度または蛍光出力検出器を備えたHPLCを持つ多くのラボでアクセス可能な幅広い線形検出を持つ細胞および動物組織の全CoAを定量するための信頼性の高いステップバイステップの手順を示します。あるいは、質量分析はCoAおよびCoAチオエステルを評価するための一般的な技術であるが、計測器のコストとデータの方法論および解釈の開発に必要な専門知識のために広く利用できない。質量分析における自由CoAの定量化のための内部標準として使用するのに適した同位体標識CoAは市販されていない、と自由CoAは、アセチルCoAなどのCoAチオエステルと同じ感度を持つ器具によって検出されません。したがって、自由なCoAレベルは、出力データがCoA標準キャリブレーション曲線と比較されない限り、質量分析によって大きく過小評価されることがよくあります。
我々は、以前に私たちの研究室で使用された別の方法でここに記載された方法を比較し、マウス肝臓からのより大きなCoA回復を発見しました, 123.4 ± 7.9 pmol/mg湿式重量, この現在の方法は、酵素アッセイを使用して〜80 pmol/mg湿式重量と比...

コエンザイムA(CoA)は、すべての生物に不可欠な共因子であり、パントテン酸(パントテン酸の塩)またはビタミンB5とも呼ばれるパントテン酸から合成されます。CoAは、酢酸やコハク酸などの短鎖酸を含む有機酸の主要な細胞内担体であり、プロピオン酸やメチルマロン酸などの分岐鎖酸、パルミテートやオレエートなどの長鎖脂肪酸、非常に長鎖脂肪酸等多価不飽和脂肪酸、及びバルプロ酸などの異生物製剤。有機酸は、中間代謝1における100以上の反応における基質としての使用を可能にするために、CoAと酵素的にチオスターリンケージを形成する。CoAチオエステルはまた、アロステリックレギュレータおよび転写活性化剤である。細胞全体のCoA供給が3、4を規制されていることは今では2を評価されています。したがって、CoAの利用可能性は制限され、CoAの欠乏は、CoA生合成5に影響を与える遺伝的障害によって例示されるように、壊滅的なことができます。パントテナテキナーゼは、CoA生合成(図1)およびパントテナテキナーゼ関連神経変性、PKANと呼ばれる、PANK2遺伝子6の突然変異によって引き起こされる第一歩を触媒する。COASYN遺伝子によってコードされるCoA合成酵素は、CoA生合成(図1)およびCOASYタンパク質関連神経変性(CoPAN)の最後の2つのステップを触媒し、COASYN遺伝子7の突然変異によって引き起こされる。PKANとCoPANの両方は、脳内の鉄蓄積に関連する神経変性疾患とCoA欠乏症の下で疾患病理の下に継承されています。
全CoAの細胞レベルは組織8によって異なり、全CoAは様々な生理学的、病理学的および薬理学的状態の下で増加または減少することができる。肝臓CoAは、給餌状態から断食状態9への燃料切り替え中に増加し、レプチン欠損肥満マウス10では肝臓CoAレベルが異常に高い。肝臓CoAは、慢性エタノール摂取に応答して減少する 11.Pank2ノックアウトマウスモデルにおける脳CoAレベルは周産期中にうつ病化されるが、成人期の後の脳CoA含有量は野生型レベルと同等であり、開発12の間に適応的CoA応答を示す。トランスジェネシスまたは遺伝子送達法による組織CoA含有量の操作は、代謝および神経機能に影響を与える13,14,15.PKANまたはCoPANのための潜在的な治療法の前臨床開発は、有効性の指標として細胞または組織CoA測定を含む16,17,18,19,20.これらすべての条件とその代謝または機能的結果の評価には、CoA全体の測定のための定量的方法が必要です。
生物学的サンプル中のCoAを測定するための正確で信頼性の高いアッセイは、多くのラボで技術的な課題です。残念ながら、無傷の細胞におけるCoAまたはCoAチオエステルを評価または定量化するためのプローブはないが、天然CoAチオエステルの類似体は、酵素21を利用したCoAエステルの研究において機械的プローブとして広く用いられている。CoAの変換は、遊離スルフヒドリル(-SH)部分を用いて、CoAチオエステル(またはその逆)に対して、異なる環境への転移中および細胞リシス中に細胞または動物組織において急速である。多数のアシルCoA合成酵素およびアシル-CoAチオエステラーゼは、CoAプール内の相互変換を仲介し、CoAチオエステルを基質として利用する追加の酵素は、化学的または物理的に消毒されるまで生物学的サンプルにおいて活性を維持する。手段。アシルトランスフェラーゼによるCoAからカルニチンへのアシル基のオフロードは、CoA/CoAチオエステル分布を変化させることができる反応のネットワーク内の一例です。放射性トレーサーは、細胞内のCoA合成率を測定するために使用することができます。生体試料中のCoAおよびCoA誘導体を測定するための現在の方法は22を検討され、結合酵素分光光アッセイ、高圧液体クロマトグラフィーおよび質量分析ベースの手順が含まれる。しかし、これらの方法は、多くの場合、特定のCoA分子種に焦点を当てており、全CoAプールの変動に盲目である。結合された酵素アッセイは、一般に、検出感度が低いため、より大量の入力材料を必要とし、線形性の範囲が限られています。
当研究室では、培養細胞および動物組織におけるCoA全体の定量化に関する信頼性の高い手順を開発しました。この戦略には、CoA種のスペクトル全体を維持および分析する努力をするのではなく、サンプル調製中に無料のCoAのみを得るために、すべてのCoAチオエステルの加水分解が含まれます。この手順は、高圧液体クロマトグラフィー(HPLC)に続くサンプル調製、CoA誘導体化、精製および同定、および吸収性による導出CoAの定量化のための個々の公開方法をまとめたものである。蛍光検出23,24,25.この手順を用いて得られたCoAの決定は、CoA規則の理解とCoA欠陥の治療のための治療アプローチの開発を可能にしました。

<table><tbody><tr><td>2-(2-ピリジル)-エチルシリカゲルSPEカラム</td><td>Millipore-Sigma</td><td>54127-U</td><td></td></tr><tr><td>補酵素A</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>870700</td><td></td></tr><tr><td>Gemini C18 3 &mu;m 100 & アリング;HPLCカラム</td><td>Phenomenex</td><td>00F-4439-E0</td><td></td></tr><tr><td>モノブロモビマン</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>M-1378</td><td></td></tr><tr><td>Omni-Tip プローブ 組織破壊器</td><td>Omni International</td><td>32750H</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Fisher</td><td>S37440</td><td></td></tr><tr><td>PowerGen 125 電動ローター ステーター ホモジナイザー</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>NC0530997</td><td></td></tr><tr><td>Spin-X遠心分離管フィルター</td><td>CoStar</td><td>8161</td><td></td></tr><tr><td>Trizma-HCl</td><td>フィッシャー</td><td>T395-1</td><td></td></tr><tr><td>ウォーターズ 2475 蛍光検出器</td><td>ウォーターズ</td><td>2475</td><td></td></tr><tr><td>ウォーターズ 2489 UV-Vis検出器</td><td>ウォーターズ</td><td>2489</td><td></td></tr><tr><td>ウォーターズ e2695 分離モジュール</td><td>ウォーターズ</td><td>e2695</td><td></td></tr></tbody></table>

細胞および組織におけるコエンザイムaの定量

Quantification of Coenzyme A in Cells and Tissues

新しい研究は、細胞補酵素A(CoA)供給が成長、代謝および生存に有害な影響で制限されることができることを明らかにしました。細胞CoAの測定は、その比較的低い存在量と、順番に、多数の代謝反応に関与するCoAチオエステルへの自由CoAの動的変換による課題です。サンプル調製中に潜在的な落とし穴をナビゲートし、多くの生物医学研究室での使用に適した幅広い線形検出でアッセイを得る方法が記載されています。

培養細胞および組織における全CoAの検出のための比較的高速かつ信頼性の高い方法は、mBBrを用いてCoAのチオールを蛍光剤に誘導し、その後、逆相HPLCを用いて誘導体化CoA-バイマンを精製することによって開発された。標準曲線が最初に生成され、CoA-bimane標準の既知および増加量が個別に注入され、CoA-bimaneクロマトグラムのピーク下の領域が入力CoA-bimaneの関数としてプロットされます(図4)。CoA-bimaneはλ393 nMで吸光度最大を有し、代表的なHPLCプロファイルは、表1の溶出プログラムを使用してC18 HPLCカラム(図3)上のCoA-bimane規格の保持時間を示しています。吸光度または蛍光単位を測定することによって検出されたCoA-bimaneの代表的な標準曲線を、それぞれ図4Aおよび図4B<s...

この方法は、培養細胞および動物組織からのサンプル調製、試料中のコエンザイムAの抽出および誘導体化、続いて誘導体化されたコエンザイムAの精製および定量のための高圧液体クロマトグラフィーを記載する。吸光度または蛍光検出。

細胞および組織におけるコエンザイムAの定量

Emerging research has revealed that the cellular coenzyme A (CoA) supply can become limiting with a detrimental impact on growth, metabolism and survival. ...

コエンザイムAは、略してCoAと呼ばれ、細胞代謝の重要な補因子です。定量的測定は、動物モデルの栄養状態とホルモン状態で起こる変化を明らかにします。この方法は、CoA誘導体およびフリーCoAを含むセルラーCoAの総量を、簡単で信頼性の高い方法で定量化します。脳鉄蓄積を伴う神経変性のいくつかのタイプは、CoA生合成経路の遺伝子の突然変異に関連している。すべての生物は生存、成長、および機能のためにCoAを必要とするので、この方法は、任意の生物学的システムに適用することができます。初めての研究者は、サンプルを絶対に冷たく保ち、すぐに水酸化カリウムに移す必要があるサンプル調製の最初のステップに苦労するかもしれません。水酸化カリウムに移す前にバッチ内のサンプル数を制限し、実験サンプルを操作する前に転送を練習します。多くの研究者は、後の生化学的分析のための生物学的サンプルの調製において固相抽出に精通していない。まず、培養皿を並行してインキュベートし、生化学的分析用に2つ、生存可能な細胞数を決定するための1つをインキュベートする。培養が後期サブコンフルエント密度に近づくと、例えば、ヒトHepG2/C3A細胞は6〜8倍の密度に成長し、6個またはHEK 293T細胞が100ミリメートル皿当たり約1.3倍の密度に成長し、培養中の接着細胞を収穫する。その後、同じ培養皿に氷冷水を1ミリリットル加えます。皿の中の冷たい水に細胞を削り、400マイクロリットルの0.25モル水酸化カリウムと1.5ミリリットルの水を含むガラス試験管に細胞懸濁液を移し、pHを12以上に持ち込みます。サスペンションを高く10秒間ボルテックスして激しく混ぜます。その後、パラフィンフィルムでしっかりと覆い、水浴で振ることなく1時間摂氏55度でインキュベートします。次に、1モルトリズマ塩酸塩溶液160マイクロリットルと100ミリモルmBBrの10マイクロリットルを加えます。高い渦を10秒間混ぜます。これにより、pHは約8にして、フリーCoAでmBBr反応をサポートします。チューブをパラフィンフィルムで覆い、MBBrがCoAのチオールと反応するように暗闇の中で室温で2時間インキュベートします。2時間後、100マイクロリットルの酢酸を加え、10秒間ボルテックスで混ぜて反応を止めます。沈殿はチューブに形成されます。次に、2,000回gで遠心分離機を15分間用いた。沈殿した細胞の破片を除去するには、固体相抽出カラムのクリーンアップのためにガラス試験管に上清を移して保存する。分析を開始する前に、ローター・ステータ・ホモジナイザーによるプローブの挿入と組織破壊用に設計されたガラス試験管に、水酸化1ミリモルの2ミリリットルを加えます。チューブは使用するまで氷の上に置いてください。凍結した組織片を素早く秤量し、サンプルごとに湿った重量を記録します。ガラス管に組織を移し、30秒間組織を均質化する。組織の完全な解凍を避けてください。0.25モルの水酸化カリウムを500マイクロリットル加えます。10秒間高い渦を、氷の上に保ちます。これにより、12以上のサンプルのpHを加水分解してCoAチオエステルを加水分解し、合計CoAを生成します。パラフィンフィルムでチューブを覆います。培養細胞の調製および組織の調製は、この手順の中で最も重要なステップである。CoAの分解を防ぐために、高水酸化カリウムを迅速に添加することが重要です。加水分解を支持するために振ることなく、水浴で2時間摂氏55度でサンプルをインキュベートします。次に、1モルのトリズマ塩酸塩150マイクロリットルと100ミリモルmBBrの10マイクロリットルを加え、無料CoAでmBBr反応を支持するためにpHを約8に持ち込む。10秒間高い渦。チューブをパラフィンフィルムで覆い、暗い状態で室温で2時間インキュベートし、すべてのCoAがmBBrで誘導体化されるようにします。その後、100マイクロリットルの酢酸を加え、渦を10秒間高く加えて反応を止めます。遠心分離機を15分間15分間gの2,000回でペレットにし、上澄み物をガラス試験管に移して固相抽出カラムをクリーンアップする。室温では、1ミリリットルの使い捨て2-2-ピリジルエチルシリカゲルカラムを1ミリリットルの洗浄バッファーで平衡化し、ピリジル官能基がプロトン化され、アニオン交換体として機能することを確認します。次いで、試料上清をカラムにピペットし、溶出物を回収する。カラムを1ミリリットルの洗浄バッファーで2回、1ミリリットルの水で1回洗浄して、未留保種を除去します。次に、別のガラス試験管に、CoA-bimaneを回収するために1ミリリットルの溶出バッファーでカラムを2回洗浄する。窒素ガスの下でチューブ内のCoA-ビマネサンプルを乾燥させます。シールは、完全にチューブをカバーし、マイナス20度で保存します。HPLC分析の準備ができたら、300マイクロリットルの水でサンプルを再懸濁し、高い渦を10秒間ボルテックスして激しく混ぜます。再懸濁したサンプルを遠心分離管フィルターに移し、遠心分離機を5,000回gで10分間移動して沈殿物を除去します。次いで、ろ過したサンプルを、HPLC注入に適したガラスバイアルに移す。本研究では、代表的なHPLCプロファイルは、C18 HPLCカラム上のCoA-バイマネ標準の保持時間を示す。CoA-ビマネ標準の増加量を個別に注入し、CoA-ビマネクロマトグラムのピーク下の領域を入力CoA-bimaneの関数としてプロットした。標準曲線は、393ナノメートルの波長でCoA-ビマネの吸光度の大きさを反射した。CoA-bimaneの蛍光は、393ナノメートルの励起波長と470ナノメートルの発光波長でも反射した。マウス肝臓またはヒト培養C3A細胞の後のHPLC分離および典型的な検出プロファイルは、ここでは、溶出プログラムを使用して11〜12分間の保持時間を有する赤色のピークによって示される。mBBrとの反応が検出可能な結果を得られない場合、Trizma-HClの量はpHを約8に下げるために調整する必要がある。それは、バイマネ誘導体としてスルヒドリルまたはチオエステル部分を含む追加の細胞分子を検出することが可能です。例えば、グルタチオンビマネは、HPLC法で検出することができる。この技術は、他の研究者が2型糖尿病の動物モデルなどの代謝不均衡に関連するCoA機能不全の潜在的な役割を調査することを可能にする。研究者は、固相抽出に使用される有機溶媒を扱う際に、個人用保護具を使用する必要があります。

quantification-of-coenzyme-a-in-cells-and-tissues

Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

このビデオは、14個のC放射性標識基板を使用して、基板酸化中に放出されるCO2の定量化技術を示しています。放出された14CO2をアルカリ溶液に閉じ込め、シンチレーションカウンターで定量化します。異なる基質の酸化は組織間で異なり、組織の病態生理学的状態を反映しています。...

培養細胞における基質酸化アッセイ:トラップされたCO2からの放射性シグナルを測定することにより、細胞内の基質酸化を定量化するIn Vitroアッセイ

このビデオは、複雑な食品源における鉄のバイオアベイラビリティを評価するためのin...

Caco-2細胞バイオアッセイ:複雑な食品源における鉄バイオアベイラビリティを測定するためのIn vitro法

細胞内ヘムレベルの変化は、癌などの一般的な病気と関連しています。そのため、多様な細胞におけるヘムの生合成レベルを測定する必要があります。このプロトコールの目標は、異なる細胞におけるヘム合成のレベルを測定および比較するための迅速で高感度な方法を提供することです。...

哺乳動物細胞におけるヘム合成レベルの測定

ここでは、単離されたヒト血小板は私がロテノンを阻害複雑に応じて代謝適応を研究するためにアクセス可能なex vivoでのモデルとして使用できることを示します。このアプローチは、液体クロマトグラフィー - 質量分析法によって同位体トレースおよび相対的定量化を使用し、研究デザインの多様に適用することができます。...

ミトコンドリア代謝を研究するためのプラットフォームとしてのヒト血小板のLC-MS分析

脂肪酸β酸化は、肝細胞を含む多くの異なる細胞型においてエネルギーを生成する役割を担う必須代謝経路である。ここでは、...

単離したてのマウス肝細胞の懸濁液中の脂肪酸β酸化の測定

このプロトコールは、部分的にセグメント化された機能的CoQプールの存在を研究するために、Na+の存在または非存在下でのミトコンドリア複合体活性CI+ CIIIおよびCII +...

Na+ に対するミトコンドリア内膜感受性が部分的にセグメント化された機能的CoQプールを明らかにする

鉄(Fe)バイオアベイラビリティに関するCaco-2細胞バイオアッセイは、食品、食品、サプリメント、食事、さらには食事療法からのFeバイオアベイラビリティを評価するための費用効果が高く汎用性の高いアプローチです。ヒトの研究に対して徹底的に検証されており、Feバイオアベイラビリティの研究のための最先端を表しています。...

食品鉄バイオアベイラビリティ測定のためのCaco-2細胞バイオアッセイ

多細胞3D腫瘍スフェロイドを肺腺癌細胞、線維芽細胞、および単球を用いて調製し、続いてこれらのスフェロイドから癌関連線維芽細胞(CAF)を単離した。単離されたCAFを正常な線維芽細胞と比較し、ミトコンドリアの膜貫通電位、活性酸素種、および酵素活性を研究することにより、ミトコンドリアの健康状態を評価しました。...

3D多細胞肺腫瘍スフェロイドから分離された癌関連線維芽細胞におけるミトコンドリアの健康評価

ヒト網膜色素上皮細胞(H-RPE)の代謝状態は、その健康と機能を反映しています。ここでは、高解像度の呼吸測定を使用してH-RPEのリアルタイムの代謝フラックスを調べるための最適化されたプロトコルを紹介します。...

高分解能肺活量測定法を用いた初代ヒト網膜色素上皮細胞における生体エネルギーのリアルタイム解析

このプロトコルは、長鎖および超長鎖飽和脂肪酸のBODIPY-C12およびBODIPY-C16蛍光類似体による刺激時に内皮細胞における細胞脂質取り込みを測定するためのin...

蛍光脂肪酸類似体を用いた内皮脂肪酸取り込みの定量化

学ぶコエンザイムAの定量法。培養細胞や動物組織からのサンプル調製、抽出、高性能液体クロマトグラフィーによる検出を含む。代謝研究や神経変性疾患の研究に有用です。

細胞および組織におけるコエンザイムAの定量

さらに動画を探す