Name: 造血幹細胞とT細胞におけるミトコンドリア質量と膜電位の測定 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-12-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 57 s
Description: 学ぶ 造血幹細胞とT細胞におけるミトコンドリア質量と膜電位の測定法。フローサイトメトリーと蛍光染色を用い、少量細胞での代謝プロファイリングが可能。骨髄移植や免疫回復研究に応用できる。

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UNILフローサイトメトリーコア施設は、特にロマン・ベデル博士の支援に感謝します。この作品は、クリスチャン・ゲルハルト・ジェブセン財団がN.VとO.N.に助成金を受け取りました。

原稿に記載されているすべての実験は、当社の機関のガイドラインに従い、動物実験(認証:VD3194)およびヒトサンプルを含む研究のためのスイスの法律に従って行われました(プロトコル:235/14;CER-VD 2017-00490)
1. 造血幹細胞抽出
<ol><li>野生型C57BL6/Jマウスを購入し、輸送関連のストレスを軽減するために、少なくとも1週間動物の家に保管してください。</li>
	<li>実験当日、CO2窒息を用いてマウスを安楽死させる。</li>
	<li>70%エタノールでマウスをスプレーし、毛皮を殺菌し、切除ハサミや鉗子などの標準的な外科用具を使用して腹でマウスを切り開き、後ろ足から大腿骨と脛骨の骨を切断します。</li>
	<li>柔らかいペーパータオルを使って大腿骨、脛骨、骨盤に付着した筋肉を取り除き、1mM EDTA(緩衝液)のPBSを含む50mLチューブに洗浄された骨を氷の上に置きます。</li>
	<li>70%エタノールでモルタルと害虫をスプレーし、細胞培養フードに入れ。30分間UVで殺菌し、後の殺菌は、エタノールの痕跡を除去するために、緩衝液でモルタルと害虫をすすす。</li>
	<li>きれいな骨を緩衝液(約10mL)でモルタルに入れ、やさしくつぶして骨を懸濁液で出します。ここで、細胞懸濁液を収集し、70 μmのセルストレーナーを通して50 mLチューブに渡し、単一のセル懸濁液を得ます。</li>
	<li>すべての骨髄が抽出され、骨の破片が白くなるまで、手順 1.6 を繰り返します。</li>
	<li>骨髄単細胞懸濁液を含む50mLチューブを遠心分離機に置きます。遠心分離機を300 x gで4°Cで10分間実行し、細胞をペレットにします。</li>
	<li>一方、オートクレーブ蒸留水中に1x RBCリシス緩衝液の10mLを調製する。0.22μmフィルターで溶液をろ過します。</li>
	<li>遠心分離機からサンプルチューブを収集し、上清をデカントします。細胞ペレット上の1x RBCリシスバッファー(材料の表)をピペット。ペレットを外し、数回上下にピペットをして均質な溶液を調製します。RBCリシスが発生するために、チューブを室温で1~2分間使用できるようにします。チューブをバッファーで満たすことによって、lysisプロセスを停止します。</li>
	<li>遠心分離機の上にチューブを置き、300 x gで回転し、4 °Cで5分間回転させます。遠心分離機からチューブを収集し、上清をデカントします。10 mLのバッファーを加えてペレットを再懸濁し、70μmの細胞ストレーナーを介して溶液を新しい50 mLチューブにフィルター処理し、RBC溶解による破片を除去します。</li>
	<li>チューブを300 x gで遠心分離し、4°Cで5分間。遠心分離機からチューブを収集し、上清をデカントします。ペレットを500°Lのバッファで再サスペンドします。</li>
	<li>100 μL アリコートを取り出し、別の 1.5 mL チューブに入れておいてください。前駆体濃縮キット(材料表)から50μLのビオチン系統破壊抗体カクテルを、残りの450μLの細胞懸濁液に加えます。シェーカーで4°Cで15分間インキュベートします。</li>
	<li>15 mLの緩衝液を加え、チューブを300 x gで遠心分離し、4°Cで5分間分。遠心分離機からチューブを収集し、上清をデカントします。ペレットを460°Lのバッファで再サスペンドします。10 μL アリコートを取り出し、別の 1.5 mL チューブに入れておいてください。</li>
	<li>前駆体濃縮キット(材料表)からストレプトアビジン磁気ビーズを50μLを残りの450μL細胞懸濁液に加えます。シェーカーで4°Cで15分間インキュベートします。</li>
	<li>15 mLの緩衝液を加え、チューブを300 x gで遠心分離し、4°Cで5分間分。遠心分離機からチューブを収集し、上清をデカントします。ペレットを5mLの緩衝液で再サスペンドし、溶液を15mLチューブに移します。</li>
	<li>チューブを自動セルセパレータ(材料の表)に持って行きます。洗浄プログラムを実行して、細胞分離器のチューブをすすいでプライムします。サンプルと2本の回収管をチューブホルダーに置きます。"枯渇" プログラムを使用して分離を実行します。実行が終了したら、自動セル区切り文字から正の分数と負の分数を収集します。 注:自動セルセパレータがない場合、ユーザーは手動磁気カラムと対応する磁石をユーザーマニュアルに従って使用できます。ユーザーは、手動による分離のプロセスが自動化されたプロセスよりも遅いことを念頭に置く必要があります。また、手動列は目詰まりが起こりやすくなります。したがって、サンプルをゆっくりと希釈し、列に読み込むようにお勧めします。</li>
	<li>正の分数を破棄します。負の分数チューブをバッファで埋めます。チューブを300 x gで遠心分離し、4°Cで5分間。</li>
	<li>一方、材料表及び表1に記載の最終体積溶液の200μLにおける最終体積溶液と単色制御の1mLで抗体ミックスを調製する。 注:TMRMと緑色蛍光ミトコンドリア染色を幹細胞マーカー染色と組み合わせる場合は、CD150-PEをCD150-PEcy5、ストレプトアビジン-Txをストレプトアビジン-パックオレンジと交換してください。</li>
	<li>遠心分離機からサンプルチューブを収集し、上清をデカントします。抗体ミックスの1 mLでペレットを再サスペンドします。各単色制御管(系統を除く)に10μLのセル(ステップ1.13から)を加えます。系統単色チューブに10μLのセル(ステップ1.14から)を加えます。</li>
	<li>45分間シェーカーでサンプルと単色のコントロールチューブを4°Cでインキュベートし、氷のバケツを蓋またはアルミ箔で覆います。</li>
	<li>すべてのチューブに緩衝液を充填し、4°Cで5分間300 x gで遠心分離機を充填します。上清を破棄し、200°Lのバッファで1mLのバッファとシングルカラーコントロールでサンプルを再サスペンドします。</li>
	<li>サンプルとシングルカラーコントロールを5 mLフィルタートップFACSチューブに転送します。</li>
	<li>チューブを選別機に持ち込み、400μLの幹細胞膨張培地を含む1.5mLチューブにHSC集団(図1Aのゲーティング戦略)を選別します。</li>
</ol>2. 造血幹細胞のEx Vivo培養
<ol><li>ソートされた細胞を含むチューブを収集します(細胞抽出についてはセクション1を参照してください)。チューブを300 x gで遠心分離し、4°Cで5分間。ペレットを外さずに上清の大部分を軽く取り除き、細胞ペレットの上に50~80μLを残します。これにより、セルの損失を最小限に抑えることができます。</li>
	<li>幹細胞膨張培地中の細胞ペレットを、試験する条件の数に応じて最終体積に再サスペンドする(培養の井戸/状態当たり100°Lのカウント)。</li>
	<li>幹細胞膨張培地、幹細胞因子(200ng/mL)、FLT3リガンド(4ng/mL)、ペンストレップ系抗生物質(1%)を含む2倍培養培地を調製(2x基底媒体;材料表)。</li>
	<li>96 U底井戸プレート(材料表)を処理した無菌組織培養物を取り、細胞が培養される井戸を特定する(図1Bのプレート設計)。 注:彼らは蒸発の影響を受けやすいので、ユーザーは、限界井戸を避けることをお勧めします。</li>
	<li>これらの井戸に、ステップ2.3で調製した2x基底媒体の100μLを入れます。NRでよくマークされた100x NR溶液の2°Lを追加します(材料の表)。24 時間ごとに NR を補充します。 注:補充は NR に固有です。他の代謝調節剤は補充を必要とするかもしれないし、必要ないかもしれない。</li>
	<li>2x基底培地を含むウェルの上にステップ2.2で調製した細胞の種子100μL。この実験では、ウェル当たりのHSCシード数は800~1,000細胞であった。</li>
	<li>2x基礎培地を含む5つの余分な井戸を準備します。これらのそれぞれに100,000個の全骨髄細胞(ステップ1.13から)を加え、100μLの幹細胞膨張培地に再懸濁し、培養後のサイトメトリー分析の染色制御として使用する。 注:ユーザーが培養後の分析のために幹細胞マーカーとミトコンドリアマーカーを組み合わせる場合は、前駆者集団(Ckit+細胞またはLKSCD150-細胞のいずれか)をさらにソートすることをお勧めします。これらの選別前駆者を染色制御ウェルに播種し、培養後サイトメトリー分析を行う。単一の染色色ごとに1ウェルを準備します。</li>
	<li>周囲のすべての井戸に200μLのオートクレーブ水を入れ、細胞を含む井戸からの蒸発を減らします。培養期間(72時間)の間、37°Cと5%CO2のインキュベーターにプレートを乱さずにおきます。プレートを取り外して24時間ごとにNRを補充し、インキュベーターに戻します。</li>
</ol>3. ミトコンドリア質量と膜電位の測定
<ol><li>培養期間の終わりに、幹細胞増殖培地(材料表)にTMRM(20μM)とミトトラッカーグリーン(10μM)(緑色蛍光染色)の100x溶液を調製する。</li>
	<li>各試験ウェルに100x TMRM溶液2μL、100x緑色蛍光染色液2μLを加えます。TMRMコントロールウェルに100x TMRMの2 μLを追加します。ミトトラッカーコントロールに100x緑色蛍光染色の2μLを加えます。プレートを37°Cのインキュベーターに戻し、5%CO2を45分間置き、プレートの上部をアルミホイルで覆います。 注:ベラパミル(ABCポンプ阻害剤)による追加のコントロールは、ABCポンプ媒介色素流出をテストする必要がある場合に調製することができる。このために、TMRMおよび緑色蛍光染色の染色前に、試験井戸1時間の1つに50μMベラパミルを加えます。</li>
	<li>インキュベーターからプレートを取り出し、300 x gで5分間遠心分離します。標準FACSバッファ(PBS-1 mM EDTA-P/S-2%FBS)を200μL加え、300 x gでプレートを遠心分離し、上清を取り除きます。この洗浄ステップ3xを繰り返します。ユーザーは、直接光への露出を最小限に抑えるために、プレートが常に箔で覆われていることを確認する必要があります。 注:ユーザーがミトコンドリア染色と幹細胞染色を組み合わせる必要がある場合、サンプルはすべての幹細胞マーカーの抗体ミックスでインキュベートする必要があり、単色コントロールは30〜45分間4°Cで個別の抗体で別々に染色する必要があります。 注:すべてのステップで、ユーザーはアルミニウム箔で覆われたプレートを維持する必要があります。ユーザーは、この追加の染色ステップとその後の洗浄ステップは、追加の細胞損失につながる可能性があることに注意する必要があります。</li>
	<li>FACSバッファーの200°Lで細胞を再サスペンドし、FACSチューブに転送します。</li>
	<li>フローサイトメーターでサンプルを実行します(図1を参照)。WBMを含む単色チューブは次のとおりです: (1) 未染色;(2) DAPI;(3) TMRM (PE);(4) 緑色蛍光染色 (FITC);(5) 完全な汚れ(PEおよびFITC)。</li>
	<li>まず、マシンをセットアップするための単色コントロールを取得します。マシン上で実行中のソフトウェアを使用して、補正を計算します。補正が適用されたら、HSC サンプルを取得し、できるだけ多くのイベントを記録します。 注:幹細胞とミトコンドリアマーカーを組み合わせる場合、ユーザーはTMRM(PE)、CD150(PE-Cy5)、およびSca-1(APC)間の補償に特に注意する必要があります。また、サンプルは、染色後すぐに実行する必要があります。</li>
	<li>サイトメーターから FACS ファイルをエクスポートし、解析ソフトウェア上のデータを分析します (材料表) 。<ol>
<li>分析のために、分析ソフトウェアでファイルを開きます。FSC-AおよびSSC-Aゲーティングを使用して、細胞集団を同定する。DAPI 負の分数 (生細胞) をプロットする前に、次のゲートで単一の部分を識別します。ライブセルゲートでは、TMRMと緑色蛍光染色チャネルで等高線プロットを作成し、それぞれΔΔmと質量を測定します(図2A)。ライブセルゲート内のこれら2チャンネルの平均蛍光強度(MFI)をエクスポートします。</li>
		<li>TMRM 低ゲートは、TMRM チャネルの肩の人口に基づいて設定されます。TMRMシングルカラーコントロールを使用して、この肩の母集団を識別してゲートを設定できます。TMRMローゲート内のセルの生の比率をコントロールにエクスポートし、プロット用の検定サンプルを作成します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Busch, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fundamental+properties+of+unperturbed+haematopoiesis+from+stem+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Fundamental properties of unperturbed haematopoiesis from stem cells in vivo.</a> Nature. 518 (7540), 542-546 (2015).</li>
<li>Simsek, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+distinct+metabolic+profile+of+hematopoietic+stem+cells+reflects+their+location+in+a+hypoxic+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">The distinct metabolic profile of hematopoietic stem cells reflects their location in a hypoxic niche.</a> Cell Stem Cell. 7 (3), 380-390 (2010).</li>
<li>Takubo, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+glycolysis+by+Pdk+functions+as+a+metabolic+checkpoint+for+cell+cycle+quiescence+in+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Regulation of glycolysis by Pdk functions as a metabolic checkpoint for cell cycle quiescence in hematopoietic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 12 (1), 49-61 (2013).</li>
<li>Yu, W. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+regulation+by+the+mitochondrial+phosphatase+PTPMT1+is+required+for+hematopoietic+stem+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Metabolic regulation by the mitochondrial phosphatase PTPMT1 is required for hematopoietic stem cell differentiation.</a> Cell Stem Cell. 12 (1), 62-74 (2013).</li>
<li>Chen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TSC-mTOR+maintains+quiescence+and+function+of+hematopoietic+stem+cells+by+repressing+mitochondrial+biogenesis+and+reactive+oxygen+species%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">TSC-mTOR maintains quiescence and function of hematopoietic stem cells by repressing mitochondrial biogenesis and reactive oxygen species.</a> Journal of Experimental Medicine. 205 (10), 2397-2408 (2008).</li>
<li>Ito, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+oxidative+stress+by+ATM+is+required+for+self-renewal+of+haematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Regulation of oxidative stress by ATM is required for self-renewal of haematopoietic stem cells.</a> Nature. 431 (7011), 997-1002 (2004).</li>
<li>Ito, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+oxygen+species+act+through+p38+MAPK+to+limit+the+lifespan+of+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Reactive oxygen species act through p38 MAPK to limit the lifespan of hematopoietic stem cells.</a> Nature Medicine. 12 (4), 446-451 (2006).</li>
<li>Tothova, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FoxOs+are+critical+mediators+of+hematopoietic+stem+cell+resistance+to+physiologic+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">FoxOs are critical mediators of hematopoietic stem cell resistance to physiologic oxidative stress.</a> Cell. 128 (2), 325-339 (2007).</li>
<li>Vannini, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specification+of+haematopoietic+stem+cell+fate+via+modulation+of+mitochondrial+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Specification of haematopoietic stem cell fate via modulation of mitochondrial activity.</a> Nature Communications. 7, (2016).</li>
<li>Vannini, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+NAD-Booster+Nicotinamide+Riboside+Potently+Stimulates+Hematopoiesis+through+Increased+Mitochondrial+Clearance%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">The NAD-Booster Nicotinamide Riboside Potently Stimulates Hematopoiesis through Increased Mitochondrial Clearance.</a> Cell Stem Cell. 24 (3), 405(2019).</li>
<li>Gratwohl, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Risk+score+for+outcome+after+allogeneic+hematopoietic+stem+cell+transplantation%3A+a+retrospective+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">Risk score for outcome after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation: a retrospective analysis.</a> Cancer. 115 (20), 4715-4726 (2009).</li>
<li>Gooley, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+Mortality+after+Allogeneic+Hematopoietic-Cell+Transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Reduced Mortality after Allogeneic Hematopoietic-Cell Transplantation.</a> New England Journal of Medicine. 363 (22), 2091-2101 (2010).</li>
<li>Rosenberg, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Durable+complete+responses+in+heavily+pretreated+patients+with+metastatic+melanoma+using+T+cell+transfer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Durable complete responses in heavily pretreated patients with metastatic melanoma using T cell transfer immunotherapy.</a> Clinical Cancer Research. 17 (13), 4550-4557 (2011).</li>
<li>Aranda, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trial+Watch%3A+Adoptive+cell+transfer+for+anticancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Oncoimmunology%22%5BJournal%5D)">Trial Watch: Adoptive cell transfer for anticancer immunotherapy.</a> Oncoimmunology. 3, 28344(2014).</li>
<li>Wherry, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+exhaustion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">T cell exhaustion.</a> Nature Immunology. 12 (6), 492-499 (2011).</li>
<li>Ho, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphoenolpyruvate+Is+a+Metabolic+Checkpoint+of+Anti-tumor+T+Cell+Responses%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Phosphoenolpyruvate Is a Metabolic Checkpoint of Anti-tumor T Cell Responses.</a> Cell. 162 (6), 1217-1228 (2015).</li>
<li>Chang, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+Competition+in+the+Tumor+Microenvironment+Is+a+Driver+of+Cancer+Progression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Metabolic Competition in the Tumor Microenvironment Is a Driver of Cancer Progression.</a> Cell. 162 (6), 1229-1241 (2015).</li>
<li>van der Waart, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+Akt+signaling+promotes+the+generation+of+superior+tumor-reactive+T+cells+for+adoptive+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Inhibition of Akt signaling promotes the generation of superior tumor-reactive T cells for adoptive immunotherapy.</a> Blood. 124 (23), 3490-3500 (2014).</li>
<li>Crompton, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Akt+inhibition+enhances+expansion+of+potent+tumor-specific+lymphocytes+with+memory+cell+characteristics%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Akt inhibition enhances expansion of potent tumor-specific lymphocytes with memory cell characteristics.</a> Cancer Research. 75 (2), 296-305 (2015).</li>
<li>de Almeida, M. J., Luchsinger, L. L., Corrigan, D. J., Williams, L. J., Snoeck, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dye-Independent+Methods+Reveal+Elevated+Mitochondrial+Mass+in+Hematopoietic+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Dye-Independent Methods Reveal Elevated Mitochondrial Mass in Hematopoietic Stem Cells.</a> Cell Stem Cell. 21 (6), 725-729 (2017).</li>
<li>Abe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+Conditional+Reporter+Mouse+Lines+at+ROSA26+Locus+For+Live+Cell+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Establishment of Conditional Reporter Mouse Lines at ROSA26 Locus For Live Cell Imaging.</a> Genesis. 49 (7), 579-590 (2011).</li>
<li>Sukumar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+Membrane+Potential+Identifies+Cells+with+Enhanced+Stemness+for+Cellular+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial Membrane Potential Identifies Cells with Enhanced Stemness for Cellular Therapy.</a> Cell Metabolism. 23 (1), 63-76 (2016).</li>
<li>Sukumar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibiting+glycolytic+metabolism+enhances+CD8%2B+T+cell+memory+and+antitumor+function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Inhibiting glycolytic metabolism enhances CD8+ T cell memory and antitumor function.</a> Journal of Clinical Investigation. 123 (10), 4479-4488 (2013).</li>
</ol>

この作品の一部の要素は、欧州特許庁にP1828EP00の出願として提出されています。

HSC機能の厳しい調節は、生物の生涯の間に安定した造馬を維持するために重要である。体内の様々な他の細胞タイプと同様に、HSC機能の調節に寄与する重要な成分は細胞代謝である。私たちの研究室9および他の2、3からの以前の研究は、HSCにおける明確な代謝状態を維持する上でミトコンドリアの重要性を含んでいた。マウス骨髄から分離されたHSCの数が非常に少いため、標準的な代謝アッセイ(例えば、SeaHorseによる酸素消費量)を介してそれらを分析することは困難である。前回の研究に基づき、ミトコンドリア質量と膜電位(活性の間接読み出し)を少数の細胞(すなわちHSC)で確実に測定する簡単なフローサイトメトリーアッセイを標準化しました。このアッセイは、生存率9を損なうことなく生きている細胞の測定を可能にし、ユーザーが実行したい可能性のある下流の機能アッセイ(CfUsや骨髄移植など)で利用できるようにします。このアッセイがスクリーニング実験に用い...

造血幹細胞(HSC)は、生物の生涯を通じて血液産生と恒常性を確保する骨髄に存在する細胞の小さな集団である。HSCは、末端分化した成熟血系統を数ラウンドの細胞分裂および十分に調整された分化ステップ1を介して末端分化した成熟血統を生成する前駆体を生じさせることによって、このプロセスを仲介する。重要なことに、HSCは嫌気性糖分析を介してエネルギーを生成します。対照的に、よりコミットされ、活性造血前駆者は、ミトコンドリア代謝2、3、4に向けて代謝を切り替える。この明確な代謝状態は、活性ミトコンドリアによって産生される活性酸素種(ROS)によって生じた細胞損傷からHSCを保護すると考えられており、それによって、その長期インビボ機能5、6、7、8を維持する。HSC代謝状態の直接測定は困難であり、多くの場合、その限られた数のために低スループットです。ここでは、HSCにおける緑色蛍光ミトコンドリア染色(ミトトラッカーグリーン)を用いたテトラメチルロウダミンメチルエステル(TMRM)蛍光を用いたミトコンドリア膜電位(ΔΔμm)の堅牢測定のためのフローサイトメトリー系アッセイとミトコンドリア塊について説明する。我々は、低ΔΔmが高度に精製されたHSC9のボナフィード機能マーカーであり、ΔΔmを下げることができる代謝モジュレーターがHSC機能9、10を増強することを以前に実証した。ここでは、HSCの長期血液再構成電位を向上させることができる新規分子を同定する戦略として、HSCミトコンドリアプロファイリングに関する手法の利用を提案する。
一例として、このアッセイは、ビタミンB3アナログニコチンアミドリボシド(NR)への曝露時にHSC ΔΔΜmの低下を確実に測定することを実証した。従って、最近発表された研究では、造血幹および前駆体機能10を直接改善することにより、NRがマウスとヒト化マウスシステムの両方で血液回収後移植を強く改善することを実証した。このような代謝調節剤の能力は、25%の死亡率が移植後の患者11、12における血液および免疫回復の遅延に関連していることを考慮すると、大きな臨床的価値がある。
さらに、この方法論がヒトT細胞の代謝プロファイルおよび機能の特徴付けに適用され得る証拠を提供する。近年、自己腫瘍浸潤リンパ球(TI)を用いた養子細胞療法(ACT)の開発は、非常に不利な予後を有する特定のタイプの進行癌に対して最も効果的なアプローチとなっている(例えば、転移性黒色腫、患者の50%が治療に反応し、患者の24%が完全に退行している)13。しかしながら、十分な抗腫瘍活性を有するTLSは14を生成することが困難である。ex vivo膨張の間にTLSが受ける広範な増殖および刺激は、T細胞抗腫瘍応答15を劇的に損なうT細胞の枯渇および老化を引き起こす。重要なことに、TLSの抗腫瘍能は、それらの代謝16、17と密接に関連しており、PI3K/Akt経路の阻害を介して代謝を調節することを目的としたアプローチは、励ましの結果18、19を生み出している。このため、末梢血単核細胞(PBMC)および患者由来TCAL由来のT細胞のΔΔmを比較し、末端分化TLと比較してPBMC由来T細胞の分化が少ないΔΔmおよびミトコンドリア質量が低いことを示しています。
このアッセイは、ΔΔmの変調を介してHSCおよびT細胞機能を改善する新規代謝モジュレーターを同定するために使用できることを想定しています。

<table><tbody><tr><td>5 mL FACSチューブ</td><td>ファルコン</td><td>352235</td><td>サンプル調製</td></tr><tr><td>96-Uボトムプレート</td><td>コーニング</td><td>3799</td><td>細胞培養</td></tr><tr><td>AutoMACS pro セパレーター</td><td>Miltenyi Biotec</td><td></td><td>自動細胞分離</td></tr><tr><td>BD FACS AriaIII</td><td>ベクトンとディキンソン</td><td></td><td>細胞選別</td></tr><tr><td>BD IMagマウス造血前駆細胞濃縮キット</td><td>BD</td><td>558451</td><td>系統の枯渇</td></tr><tr><td>BD LSRII</td><td>ベクトン&ディキンソン</td><td></td><td>FACS取得装置</td></tr><tr><td>BD-DIVA</td><td>ベクトン&ディキンソン</td><td></td><td>取得ソフト</td></tr><tr><td>CD150 PE</td><td>バイオレジェンド</td><td>115904</td><td>抗体染色ミックス</td></tr><tr><td>CD150 PE-Cy5</td><td>バイオレジェンド</td><td>115912</td><td>抗体染色ミックス</td></tr><tr><td>CD48 PB</td><td>バイオレジェンド</td><td>103418</td><td>抗体染色ミックス</td></tr><tr><td>遠心分離機 - 5810R</td><td>エッペンドルフ</td><td></td><td>遠心分離</td></tr><tr><td>機Ckit PeCy7</td><td>Biolegend</td><td>105814</td><td>抗体染色ミックス</td></tr><tr><td>Flow jo</td><td>FlowJo LLC</td><td></td><td>FACS 分析ソフトウェア</td></tr><tr><td>GraphPad-Prism</td><td>GraphPad</td><td></td><td>データをグラフにプロット</td></tr><tr><td>Mitotracker Green</td><td>Invitrogen</td><td>M7514</td><td>ミトコンドリア質量を測定するための緑色蛍光マイトコンドリア染色。作業濃度= 100 nM;ストック濃度 = 1 mM</td></tr><tr><td>ニコチンアミドリボシド (NR)</td><td>カスタム合成 社内</td><td></td><td>代謝調節剤; 作業濃度 = 500 & マイクロ;M;ストック濃度 = 50 mM</td></tr><tr><td>PBS</td><td>CHUV</td><td></td> 1000324 <td>バッファー調製; 使用濃度 = 1x; ストック濃度 = 1x</td></tr><tr><td>Pen-Strep (P/S)</td><td>Life technologies</td><td>15140122</td><td>Ex vivo culture; 使用濃度 = 1x; ストック濃度 = 1x</td></tr><tr><td>RBC 溶解バッファー</td><td>Biolegend</td><td>420301</td><td>Lysing Red blood cells; 使用濃度 = 1x; ストック濃度 = 10x</td></tr><tr><td>組換えマウスFlt-3リガンド(FLT3)</td><td>RnD</td><td>427-FL-005/CF</td><td>Ex vivo培養;使用濃度 = 2 ng/mL; ストック濃度 = 10 & マイクロ;g/mL</td></tr><tr><td>組換えマウス幹細胞因子 (SCF)</td><td>RnD</td><td>455-MC-010/CF</td><td>Ex vivo培養; 使用濃度 = 100 ng/mL; ストック濃度 = 50 & micro;g/mL</td></tr><tr><td>Sca1 APC</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>17-5981-82</td><td>抗体染色ミックス</td></tr><tr><td>StemlineII 造血幹細胞増殖培地</td><td>SIGMA</td><td>S0192</td><td>Ex vivo培養</td></tr><tr><td>Streptavidin Pac orange</td><td>Life Technologies</td><td>S32365</td><td>抗体染色ミックス</td></tr><tr><td>Streptavidin Tx red</td><td>Life Technologies</td><td>S872</td><td>抗体染色ミックス</td></tr><tr><td>TMRM</td><td>Invitrogen</td><td>T668</td><td>Staining mitochondrial membrane potential; working concentration = 200 nM; stock concentration = 10 mM</td></tr><tr><td>Ultra pure EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>15575-038</td><td>Buffer preparation; working concentration = 0.5 M; stock concentration = 1 mM</td></tr></tbody></table>

造血幹細胞とt細胞におけるミトコンドリア質量と膜電位の測定

Measurement of Mitochondrial Mass and Membrane Potential in Hematopoietic Stem Cells and T-cells by Flow Cytometry

静止、自己再生、分化の微妙なバランスは、造血幹細胞(HSC)プールを維持し、すべての成熟した血液細胞の生涯産生を維持するための鍵です。近年、細胞代謝はHSC機能と運命の重要な調節装置として浮上している。ミトコンドリア代謝の変調がHSCの運命に影響を与えることを以前に実証しました。具体的には、電子輸送鎖を化学的に結合させることで、通常は急速な分化を誘発する培養条件下でHSC機能を維持することができた。しかし、HSC数を制限すると、多くの場合、HSC代謝を測定するために標準アッセイを使用することを妨げ、したがって、その機能を予測します。ここでは、HSCなどの希少細胞におけるミトコンドリア膜電位とミトコンドリア質量の信頼性の高い測定を可能にする簡単なフローサイトメトリーアッセイを報告する。マウス骨髄からのHSCの分離とミトコンドリア質量および膜電位ポストex vivo培養の測定について議論する。一例として、代謝モジュレーターによる治療を介してHSCにおけるこれらのパラメータの変調を示す。さらに、ヒト末梢血由来T細胞およびヒト腫瘍浸潤リンパ球(TI)に対するこの方法論の適用を拡張し、ミトコンドリアプロファイルに劇的な違いを示し、異なるT細胞を反映している可能性がある機能。このアッセイは、様々な細胞型のミトコンドリア代謝の調節剤を異なる文脈で同定するスクリーニングに用いることができると考えています。

図1では、マウス骨髄からの造血幹細胞の分離と、そのex生体内培養のためのプレートのレイアウトに対するゲーティング戦略を示す。図1Aは、SSC-A/FSC-Aプロットにおけるリンパ球画分の同定を示す。ダブレットはシングルトゲートで除去され、続いてDAPIシグナルの不在による生細胞の同定を行った。系統-Sca1+cKit+によって定義されるLKS集団を同定した。この集団は、幹細胞および前駆細胞を含することが知られている。HSCはLKS集団の細胞の約5〜10%を形成し、CD150+CD48-集団のゲーティングによって同定された。図1Bは、エクスビボ培養用の96ウェルプレートのレイアウトを表す。ソートされたHSCは、異なる培養条件でめっきされた:この場合、制御およびNR補足培養条件。全骨髄細胞はまた、プロトコルに記...

ここでは、生体内培養造血幹細胞およびT細胞におけるミトコンドリア質量および膜電位を測定する信頼性の高い方法について説明する。

造血幹細胞とT細胞におけるミトコンドリア質量と膜電位の測定

A fine balance of quiescence, self-renewal, and differentiation is key to preserve the hematopoietic stem cell (HSC) pool and maintain lifelong production ...

このプロトコルは、生細胞におけるミトコンドリア膜電位およびミトコンドリア質量の測定を可能にする単純なフローサイトメトリーベースのアッセイである。標準的な代謝アッセイは、造血幹細胞などの稀な集団で働くときに失敗する。この方法により、細胞数が少ない場合にミトコンドリア膜プロファイリングを行い、HSCなどの細胞の新規代謝モジュレーターを決定することができます。また、骨髄移植やコロニー形成アッセイなどの下流機能アッセイと組み合わせて、培養後の細胞の機能性を決定することができます。我々の技術は、骨髄移植およびアブレーション療法後の造血免疫回復の文脈においてHSC機能を改善することができる新しい分子の同定に利用することができる。我々のプロトコルで述べたように、我々の方法は免疫T細胞の代謝適合性を評価するために使用することができる。細胞が染色後に光への暴露を最小限に抑えることを非常に重要です。また、ポンプエフラックスの寄与を評価するためにポンプ阻害剤ベラパミルの使用を含める必要がある。しかし、ユーザーは、ベラパミルがイオン平衡を深く摂動し、ミトコンドリア膜電位に対する代謝変調器の効果を評価するために使用できないことを認識する必要があります。この方法の視覚的なデモンストレーションは、セル数が少ない場合に注意が必要な重要な手順がいくつかあり、ユーザーが PubMed で読む通常の文書では、これらの手順が非常に多く欠けているため、非常に重要です。FAC分類の場合、LKS集団は、リネージュネガティブ、Sca1陽性、cKit陽性によって定義される。LKS集団の約5〜10%の造血幹細胞は、HSCとして標識されたCD150陽性、CD48陰性集団の格言によって同定される。造血幹細胞の選別後、摂氏4度で5分間300倍gのチューブを遠心分離する。ペレットを外さずに上清の大部分を静かに取り除き、細胞ペレットの上に50〜80マイクロリットルを残します。幹細胞拡張培地中の細胞ペレットを200マイクロリットルの最終体積まで再懸濁する。96 U-底ウェルプレートを処理した滅菌組織培養を準備し、細胞が培養されるウェルを特定します。これらのウェルであらかじめ調製した2倍基底培地の100マイクロリットルを移す。よくマークされたNRで、100xニコチンアミドリボシド溶液の2マイクロリットルを追加します。2x基底培地100マイクロリットルを染色制御用のウェルに移します。2x基底培地を含むウェルの上に調製された造血幹細胞の種子100マイクロリットル。染色制御としてマークされた井戸の全体骨髄細胞の種子100マイクロリットル。細胞を含む井戸からの蒸発を減らすために、すべての周囲の井戸に200マイクロリットルのオートクレーブ水を加えます。プレートをインキュベーターに37°Cの2酸化炭素5%で72時間放置します。プレートを取り出して24時間ごとにニコチンアミドリボシドを補充し、インキュベーターに戻します。培養期間の終わりに、100x TMRM溶液の2マイクロリットルと100x緑色蛍光染色液の2マイクロリットルを各試験井戸に加えます。TMRM染色制御に100x TMRMの2マイクロリットルを加えます。MitoTracker染色制御によく100x緑色蛍光染色の2マイクロリットルを加えます。プレートの上部にアルミホイルを覆います。プレートを5%の二酸化炭素で摂氏37度のインキュベーターに45分間戻します。インキュベーターからプレートを取り出し、5分間300回gで遠心分離します。プレートを反転して上清を除去し、200マイクロリットルの標準FACSバッファを追加して再中断します。プレートをホイルで覆います。プレートを300回gで5分間遠心します。この洗浄工程を3回繰り返します。FACSバッファーの200マイクロリットルで細胞を再懸濁し、FACSチューブに移します。フローサイトメーターでサンプルを実行するには、まず単一のカラーコントロールをマシンにロードし、各イベントに少なくとも5,000個のイベントを1つずつ記録します。ソフトウェアで、ダッシュボードの取得と記録を押して、単一のカラーコントロールを取得して記録します。[報酬の設定] を押し、[報酬の計算] をクリックして報酬を計算します。補償が適用されたら、造血幹細胞サンプルを取得し、できるだけ多くのイベントを記録します。サイトメーターからFACSファイルをエクスポートし、解析ソフトウェア上のファイルを開きます。FlowJo では、前方散乱と側面散布のゲージを使用して、細胞の母集団を識別します。次のゲートでシングルを識別し、ライブセルを表すDAPI負の分数をプロットします。生細胞ゲートでは、TMRMと緑色蛍光染色チャネルで輪郭プロットを行い、それぞれミトコンドリア膜電位と質量を測定します。ライブセルゲート内のこれら2つのチャネルの平均蛍光強度をエクスポートします。次に、TMRM 低ゲート内のセルの割合をすべてのサンプルにエクスポートします。ニコチンアミドリボシド治療は、TMRM低集団の明らかな増加を示した。また、TMRM低ゲートにおける細胞の割合を有意に増加させ、TMRM蛍光強度の著しい低下を示した。ミトコンドリア質量はニコチンアミドリボシド補充時に変化しなかった。さらに、幹細胞マーカー染色をミトコンドリア染色ポスト培養と組み合わせた。造血幹細胞を同定するゲーティング戦略では、ニコチンアミドリボシドへの曝露は、TMRMの低集団の有意な増加およびゲート化されたHSCにおけるTMRM蛍光強度の有意な減少を示した。緑色蛍光ミトコンドリア染色グリーンシグナルは、2つの条件で変化しないままであった。染色したサンプルへの光の露出を最小限に抑えるために、染色板をアルミ箔で覆うことが重要です。この方法は、骨髄移植やコロニー形成アッセイなどの下流アッセイと組み合わせて、幹細胞の機能を決定することができます。したがって、この技術は、HSCの新規代謝変調器の同定のための簡単なスクリーニング方法を可能にする。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

このビデオでは、ミトコンドリア呼吸鎖複合体、ミトコンドリアDNA関連タンパク質、ミトコンドリア外膜タンパク質に対する抗体でニューロン細胞を標識し、その後、フローサイトメトリーでそれらのレベルを定量化する方法を示します。...

フローサイトメトリーを用いたニューロンにおける複数のミトコンドリアパラメータの測定

ここで説明するフローサイトメトリーによりげっ歯類組織分析から単離されたミトコンドリアの免疫標識によってミトコンドリア外膜タンパク質を検出および定量するための方法である。この方法は、ミトコンドリア亜​​集団の機能的側面を評価するために拡張することができる。...

単離されたミトコンドリアのフローサイトメトリーによる外膜タンパク質の免疫検出

ここでは、JC 1 染料を使用して保護エージェントの有無を低酸素/再酸素化にさらされた後細胞のミトコンドリア膜電位を評価するプロトコルを提案する.

低酸素/再酸素化後心筋細胞におけるミトコンドリア膜電位を測定するためのフロー フローサイトメトリーを用いたアッセイ

この記事は、ミトコンドリアや細胞内のリソソームを定量化する強力な方法を示しています。リソソームやミトコンドリア固有染料表面マーカー蛍光に活用された抗体との組み合わせにより、初代培養細胞を用いた組織サンプルから収穫のような混合細胞集団におけるこれらのオルガネラの定量化フローサイトメトリー マルチ...

ミトコンドリア、リソソーム T 細胞のマルチカラー フロー フローサイトメトリーを用いた定量化

急性骨髄性白血病(AML)のマウスモデルから、マウスの健康な造血幹細胞および前駆細胞(HSPC)におけるミトコンドリア活性酸素種(ROS)を検出するために多パラメータフローサイトメトリーを用いる方法について説明する。MLL-AF9.

マウス造血幹細胞および前駆細胞およびMLL-AF9駆動白血病におけるミトコンドリア活性酸素種のフローサイトメトリック解析

ゼノバイオティック流出ポンプは造血幹細胞および前駆細胞(HSPC)において非常に活性であり、ミトコンドリア膜電位蛍光色素であるTMRMの押し出しを引き起こす。ここでは、流出ポンプ阻害剤であるベラパミルの存在下でTMRMによるHSPCにおけるミトコンドリア膜電位を正確に測定するプロトコルを提示する。...

流出ポンプの阻害による造血幹細胞および前駆細胞におけるミトコンドリア膜電位の流れ細胞測定評価の精度向上

代謝適応は、分化、持続性、および細胞毒性を決定するため、T細胞にとって基本的である。ここでは、サイトカイン分化型ヒト初代T細胞の エクスビボ でミトコンドリア呼吸をモニタリングするための最適化されたプロトコールが提示される。...

サイトカイン分化型ヒト初代T細胞におけるミトコンドリア呼吸のリアルタイムモニタリング

この研究では、フローサイトメトリーと2つの蛍光レポーターまたは抗体による二重染色に基づいて複数のミトコンドリア機能パラメーターを測定し、ミトコンドリア体積、ミトコンドリア膜電位、活性酸素種レベル、ミトコンドリア呼吸鎖組成、およびミトコンドリアDNAの変化を検出する新しいアプローチを報告しています。...

ヒト人工多能性幹細胞における複数のミトコンドリアパラメータとその神経およびグリア誘導体のフローサイトメトリー解析

免疫細胞の生理学的に関連する基質濃度の下でミトコンドリアの生体エネルギーを研究する方法は限られています。私たちは、高分解能蛍光肺活量測定法を使用して、ヒトT細胞、単球、および末梢単核細胞のエネルギー需要に対するミトコンドリア膜電位の応答の変化を評価する詳細なプロトコルを提供します。...

ヒト免疫細胞におけるミトコンドリア膜電位の動的変化を評価するための高分解能蛍光スパイロメトリー

造血幹細胞の分離と移植（造血幹細胞）

学ぶ 造血幹細胞とT細胞におけるミトコンドリア質量と膜電位の測定法。フローサイトメトリーと蛍光染色を用い、少量細胞での代謝プロファイリングが可能。骨髄移植や免疫回復研究に応用できる。

造血幹細胞とT細胞におけるミトコンドリア質量と膜電位の測定

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