Name: 微小血管系におけるフィールドワイズフローの空間時間解析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: 学ぶ STAFFソフトウェアを用いた微小血管系のフィールドワイズフロー連続定量法。TrakEM2で血管ネットワークを定義し、カラー空間マップで可視化することで、従来数か月かかる解析を数時間で完了させる効率的な手法です。

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ここで提示された研究は、国立衛生研究所(NIH U01 GM111243およびNIH NIDDK P30 DK079312)からの資金提供によって支えられました。インディアナ生物顕微鏡センターでバイタル内顕微鏡研究を行いました。マルゴルザータ・カモッカ博士の顕微鏡検査の技術支援に感謝します。

<ol><li>Shen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subclinical+Vascular+Dysfunction+Associated+with+Metabolic+Syndrome+in+African+Americans+and+Whites%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+clinical+Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Subclinical Vascular Dysfunction Associated with Metabolic Syndrome in African Americans and Whites.</a> The Journal of clinical Endocrinology and Metabolism. 100 (11), 4231-4239 (2015).</li>
<li>Sherman, I. A., Pappas, S. C., Fisher, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatic+microvascular+changes+associated+with+development+of+liver+fibrosis+and+cirrhosis%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Hepatic microvascular changes associated with development of liver fibrosis and cirrhosis.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 258 (2), 460-465 (1990).</li>
<li>Zafrani, L., Ince, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microcirculation+in+Acute+and+Chronic+Kidney+Diseases%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Kidney+Diseases%22%5BJournal%5D)">Microcirculation in Acute and Chronic Kidney Diseases.</a> American Journal of Kidney Diseases. 66 (6), 1083-1094 (2015).</li>
<li>Nielsen, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capillary+dysfunction+is+associated+with+symptom+severity+and+neurodegeneration+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Alzheimer%27s+%26+Dementia%22%5BJournal%5D)">Capillary dysfunction is associated with symptom severity and neurodegeneration in Alzheimer's disease.</a> Alzheimer's & Dementia. 13 (10), 1143-1153 (2017).</li>
<li>Houben, A. J. H. M., Martens, R. J. H., Stehouwer, C. D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+Microvascular+Function+in+Humans+from+a+Chronic+Disease+Perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Assessing Microvascular Function in Humans from a Chronic Disease Perspective.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 28 (12), 3461-3472 (2017).</li>
<li>Clemens, M., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+Sinusoidal+Perfusion%3A+In+Vivo+Methodology+and+Control+by+Endothelins%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Liver+Disease%22%5BJournal%5D)">Regulation of Sinusoidal Perfusion: In Vivo Methodology and Control by Endothelins.</a> Seminars in Liver Disease. 19 (04), 383-396 (1999).</li>
<li>Uhlmann, S., Uhlmann, D., Spiegel, H. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+hepatic+microcirculation+by+in+vivo+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+investigative+surgery+%3A+the+official+journal+of+the+Academy+of+Surgical+Research%22%5BJournal%5D)">Evaluation of hepatic microcirculation by in vivo microscopy.</a> Journal of investigative surgery : the official journal of the Academy of Surgical Research. 12 (4), 179-193 (1999).</li>
<li>Dunn, K. W., Sutton, T. A., Sandoval, R. M. Live-animal imaging of renal function by multiphoton microscopy. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDunn%2C+KW+%22Current+protocols+in+cytometry%22">Current protocols in cytometry</a>. , Chapter 12, Unit12.9 (2012).</li>
<li>von Diezmann, A., Shechtman, Y., Moerner, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-Dimensional+Localization+of+Single+Molecules+for+Super-Resolution+Imaging+and+Single-Particle+Tracking%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Three-Dimensional Localization of Single Molecules for Super-Resolution Imaging and Single-Particle Tracking.</a> Chemical Reviews. 117 (11), 7244-7275 (2017).</li>
<li>Huang, Z. -L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization-based+super-resolution+microscopy+with+an+sCMOS+camera%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Localization-based super-resolution microscopy with an sCMOS camera.</a> Optics Express. 19 (20), 19156(2011).</li>
<li>Clendenon, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+automated+method+for+continuous+fieldwise+measurement+of+microvascular+hemodynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Microvascular+Research%22%5BJournal%5D)">A simple automated method for continuous fieldwise measurement of microvascular hemodynamics.</a> Microvascular Research. 123, 7-13 (2019).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Liu, Z. -Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scale+space+approach+to+directional+analysis+of+images%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Optics%22%5BJournal%5D)">Scale space approach to directional analysis of images.</a> Applied Optics. 30 (11), 1369(1991).</li>
<li>Linkert, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metadata+matters%3A+access+to+image+data+in+the+real+world%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Metadata matters: access to image data in the real world.</a> The Journal of cell biology. 189 (5), 777-782 (2010).</li>
<li>Sherman, I. A., Pappas, S. C., Fisher, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatic+microvascular+changes+associated+with+development+of+liver+fibrosis+and+cirrhosis%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Hepatic microvascular changes associated with development of liver fibrosis and cirrhosis.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 258 (2), 460-465 (1990).</li>
<li>Babbey, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+intravital+microscopy+of+hepatic+transport%5BTitle%5D)+AND+%22IntraVital%22%5BJournal%5D)">Quantitative intravital microscopy of hepatic transport.</a> IntraVital. 1 (1), 44-53 (2012).</li>
<li>Dunn, K. W., Ryan, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+quantitative+intravital+multiphoton+microscopy+to+dissect+hepatic+transport+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Using quantitative intravital multiphoton microscopy to dissect hepatic transport in rats.</a> Methods. 128, 40-51 (2017).</li>
<li>Ryan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+Multiphoton+Microscopy+with+Fluorescent+Bile+Salts+in+Rats+as+an+In+Vivo+Biomarker+for+Hepatobiliary+Transport+Inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+metabolism+and+disposition%3A+the+biological+fate+of+chemicals%22%5BJournal%5D)">Intravital Multiphoton Microscopy with Fluorescent Bile Salts in Rats as an In Vivo Biomarker for Hepatobiliary Transport Inhibition.</a> Drug metabolism and disposition: the biological fate of chemicals. 46 (5), 704-718 (2018).</li>
<li>Sandoval, R. M., Molitoris, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+Glomerular+Permeability+of+Fluorescent+Macromolecules+Using+2-Photon+Microscopy+in+Munich+Wistar+Rats%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Quantifying Glomerular Permeability of Fluorescent Macromolecules Using 2-Photon Microscopy in Munich Wistar Rats.</a> Journal of Visualized Experiments. (74), e50052(2013).</li>
<li>Chhatbar, P. Y., Kara, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+blood+velocity+measurements+with+a+hybrid+image+filtering+and+iterative+Radon+transform+algorithm%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Improved blood velocity measurements with a hybrid image filtering and iterative Radon transform algorithm.</a> Frontiers in Neuroscience. 7, 106(2013).</li>
<li>Drew, P. J., Blinder, P., Cauwenberghs, G., Shih, A. Y., Kleinfeld, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+determination+of+particle+velocity+from+space-time+images+using+the+Radon+transform%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+computational+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Rapid determination of particle velocity from space-time images using the Radon transform.</a> Journal of computational neuroscience. 29 (1-2), 5-11 (2010).</li>
<li>Kleinfeld, D., Mitra, P. P., Helmchen, F., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluctuations+and+stimulus-induced+changes+in+blood+flow+observed+in+individual+capillaries+in+layers+2+through+4+of+rat+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Fluctuations and stimulus-induced changes in blood flow observed in individual capillaries in layers 2 through 4 of rat neocortex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (26), 15741-15746 (1998).</li>
<li>Dasari, S., Weber, P., Makhloufi, C., Lopez, E., Forestier, C. -L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+Microscopy+Imaging+of+the+Liver+following+Leishmania+Infection%3A+An+Assessment+of+Hepatic+Hemodynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Intravital Microscopy Imaging of the Liver following Leishmania Infection: An Assessment of Hepatic Hemodynamics.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (101), e52303(2015).</li>
<li>Hoshikawa, R., et al. Dynamic Flow Velocity Mapping from Fluorescent Dye Transit Times in the Brain Surface Microcirculation of Anesthetized Rats and Mice. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHoshikawa%2C+R+%22Microcirculation%22">Microcirculation</a>. 23 (6), New York, N.Y. 416-425 (2016).</li>
<li>Sironi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+flow+mapping+in+complex+vessel+networks+by+single+image+correlation%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+reports%22%5BJournal%5D)">In vivo flow mapping in complex vessel networks by single image correlation.</a> Scientific reports. 4 (1), 7341(2014).</li>
<li>Kamoun, W. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+measurement+of+RBC+velocity%2C+flux%2C+hematocrit+and+shear+rate+in+vascular+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Simultaneous measurement of RBC velocity, flux, hematocrit and shear rate in vascular networks.</a> Nature Methods. 7 (8), 655-660 (2010).</li>
</ol>

著者は競合する利害関係を報告しない。

このプロトコルには複数の重要な手順があります。まず、LIVERを用いた毛細管流解析に利用できる映画を生成するためには、肝臓の生態中イメージング中の運動の最小化が不可欠です。横隔膜の近接性のために、呼吸誘発運動の短い期間が発生し、各呼吸後に安全な肝臓が初期位置に戻る。ガーゼを用いてカバースリップ底皿に対して外科的に露出した肝臓を固定し、その後、逆顕微鏡を用いて下方からイメージングし、呼吸16、17、18、19の間で器官を固定化する役割を果たす。第2に、測定可能な流量は画像取得速度と流れを測定するセグメントの最小長11の関数であるため、100fpsの画像取得速度を強くお勧めします。第3に、高品質の骨格を作り出し、血管ネットワークの線画表現は、STAFFを用いて毛細管流速度を得る上で次の重要なステップである。スケルトンラインセグメントは、解析...

微小血管系は生理学において重要な役割を果たし、変化する条件下で組織の効果的な灌流を保証する。微小血管機能障害は、長期的な心血管罹患率および死亡率、認知症の発症、および肝臓と腎臓の両方の疾患を含む無数の状態に関連しており、したがって、広範な生物医学的調査における関心の重要な要因である1、2、3、4、5。組織灌流を評価するために複数の技術が用いられてきたが、生内顕微鏡によってのみ、個々の毛細血管のレベルで血流を特徴付けるために必要な時間的および空間的な分解能でデータ収集を可能にする。
微小血管流れは、蛍光微小球の動きまたは膜不浸透蛍光マーカーの背景に対する赤血球の動き(例えば、蛍光標識デキストランまたはアルブミン)6、7のいずれかによって蛍光顕微鏡で可視化することができる。微小血管の流れは、広視野顕微鏡を用いて表面的な細胞層で、または共焦点または多光子顕微鏡を用いて深さで画像化することができる。しかし、毛細管流量は、赤血球の通過が一般的に60フレーム/s未満の速度で捕捉することができないようなものである。ほとんどのレーザー走査共焦点顕微鏡および多光子顕微鏡は、フル画像フィールドをスキャンするために1〜5sを必要とするので、この速度は、一般的に視野を制限することによってのみ達成することができ、時には単一のスキャンライン8に。選択された毛細血管セグメント(1)に測定を制限するプロセスは、選択バイアスを導入する可能性があり、(2)毛細管血流の速度における空間的および時間的不均一性を捕捉することが不可能である。対照的に、キャピラリーネットワークの画像は、科学的相補金属酸化物半導体(sCMOS)カメラ9、10を搭載したワイドフィールドデジタル顕微鏡を使用して、100fpsを超える速度で収集することができる。これらの安価なシステムは、典型的な生物医学実験室で一般的であり、本質的に連続的に、2次元ネットワーク全体にわたる微小血管の流れを画像化することを可能にする。この問題は、高速ビデオ顕微鏡によって生成された膨大で複雑な画像データセットから有意義な定量データを抽出できる解析アプローチを見つける方法の1つになります。
全場流量データの解析を可能にするために、高速11で収集した画像系列の顕微鏡分野全体を通して微小血管流量を連続的に測定できる新規画像解析ソフトウェアSTAFFを開発しました。このアプローチは、様々な実験システムやイメージングモダリティと互換性があり、STAFF画像解析ソフトウェアはImageJ12のFIJI実装のためのマクロツールセットとして実装されています。微小血管の流れを可視化するためにここで使用される根本的な原理は、まず、毛細血管内の赤血球を画像化できるようにいくつかのコントラストを提供しなければならないということです。我々の研究では、コントラストは赤血球によって除外されるバルク蛍光プローブによって提供される。流れの速度は、生きている動物8から高速に収集された画像において蛍光標識プラズマ内に負の染色として現れる赤血球の変位から定量することができる。次に STAFF を使用して、キモグラフと呼ばれる複数の時間間隔で各キャピラリー セグメントに沿った距離のプロットを作成し、キモグラフ13に存在する勾配を検出し、それらの勾配から微小血管流量を計算します。このアプローチは、イメージングのためにアクセスできる任意の毛細血管ベッドから収集された画像に適用することができます。ここでは、肝臓の血流の研究にIVMとSTAFFの適用について説明します.

<table><tbody><tr><td>#5 鉗子</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>11251-20</td><td>デュモン #5 イノックス鉗子</td></tr><tr><td>C57BL/6 マウス</td><td>ジャクソン研究所</td><td></td><td>オス 9-12週齢</td></tr><tr><td>カニューレ</td><td>Instech</td><td>BTPE-10</td><td>ポリエチレンチューブ 0.011 x 0.024 インチ</td></tr><tr><td>CMOS カメラ</td><td>浜松</td><td>C11440-42U30</td><td>4.0LT 科学 CMOS</td></tr><tr><td>カバースリップ底皿</td><td>電子顕微鏡Sciences</td><td></td><td>WillCo Dish ガラス底 GWST5040</td></tr><tr><td>解剖ハサミ</td><td>Fine Science Tools</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fiji ImageJ 画像解析ソフトウェア</td><td></td><td></td><td>https://fiji.sc/ ; https://downloads.imagej.net/fiji/Life-Line/fiji-win64-20170530.zip</td></tr><tr><td>フルオレセインデキストラン</td><td>サーモフィッシャー, Invitrogen</td><td>D1822</td><td>デキストラン, フルオレセイン, 70,000 MW, アニオン性, リジン固定可能</td></tr><tr><td>ガーゼスポンジ</td><td>フィッシャー</td><td>22-415-504</td><td>2x2インチ Dukal 滅菌ガーゼスポンジ</td></tr><tr><td>加熱パッド</td><td>レプティサーム</td><td>RH-4</td><td>マウスとステージの間</td></tr><tr><td>加熱パッド</td><td>サンビーム</td><td>000732-500-000U</td><td>マウス以上</td></tr><tr><td>倒立落射蛍光顕微鏡</td><td>ニコン</td><td></td><td>TiE 倒立顕微鏡</td></tr><tr><td>アイシス げっ歯類 電気シェーバー</td><td>ブラウン Aesculap</td><td>GT420</td><td></td></tr><tr><td>イソフルオラン</td><td>Abbott GmbH</td><td>PZN4831850</td><td></td></tr><tr><td>ルアースタブアダプター</td><td>フィッシャー</td><td>14-826-19E</td><td>カテーテルアダプター</td></tr><tr><td>マイクロハサミ</td><td>カストロビエホ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡対物レンズ</td><td>ニコン</td><td></td><td>プラン フルーア 20x, NA 0.75 水浸</td></tr><tr><td>ニードル</td><td>フィッシャー</td><td></td><td>30 G x1/2インチ</td></tr> <tr><td>ニードルホルダー</td><td>オルセン・ヘガー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>オブジェクティブヒーター</td><td>バイオサイエンスツール</td><td>MTC-HLS-025</td><td>オブジェクティブヒーター付き温度調節器</td></tr><tr><td>直腸温度計</td><td>ブレインツリーサイエンティフィック、INC</td><td>TH-5A</td><td>マウス 体温モニタリング</td></tr><tr><td>スタッフマクロ</td><td></td><td></td><td>https://github.com/icbm-iupui/STAFF</td></tr><tr><td>縫合糸 ハーバー</td><td>ドバイオサイエンス</td><td>723288</td><td>シルク ブラック 縫合糸、6-0、スプール</td></tr></tbody></table>

微小血管系におけるフィールドワイズフローの空間時間解析

Spatial Temporal Analysis of Fieldwise Flow in Microvasculature

血流速度と分布の変化は、様々な細胞のニーズに応じて組織や臓器の灌流を維持するために不可欠です。また、微小循環における欠陥の出現は、複数の病理の発症における主要な指標であり得る。光学イメージングの進歩により、バイタル顕微鏡(IVM)は実用的なアプローチとなり、生きている動物の細胞および細胞下レベルでのイメージングを時間の経過とともに高速化しました。しかし、十分な組織灌流を維持することの重要性にもかかわらず、毛細管流における空間的および時間的変動はめったに文書化されていない。標準的なアプローチでは、限られた時間をかけてイメージングするために少数の毛細管セグメントが選択される。フィジーオープンソース画像解析ソフトウェアのマクロであるフィールドワイズフローの空間時間解析(STAFF)を開発し、公平な方法で毛細管の流れを総合的に定量化しました。毛細血管内の血流の完全なフィールドの高速画像シーケンスを使用して、STAFFは、すべての血管セグメントのための時間間隔ごとにキモグラフと呼ばれる時間の経過とともに動きを表す画像を生成します。KYmographs STAFFからは、赤血球が時間の経過とともに移動する距離から速度を計算し、定量分析のための視覚化と表形式出力のための色分けされた空間マップのシーケンスとして速度データを出力します。通常のマウス肝臓では、STAFF分析は、小葉の中のペリセントラル領域とペリポータル領域間の流速の深い差を定量化した。さらに予想外ののののは、並んで並んでいるシヌコイドと、個々の血管セグメント内で数秒にわたって見られる変動の間に見られる流速の違いです。STAFFは毛細管の流れの複雑な時空間ダイナミクスの測定を可能にすることによって新しい洞察を提供することができる強力な新しい用具である。

STAFF分析は、数秒から数分までの期間にわたって、顕微鏡分野全体にわたる微小血管速度の完全な国勢調査を生成します。代表的な結果を図1、図 2、図 3、および図 4に示します。図1は、マウスの肝臓におけるマイクロ血管ネットワークの時系列の例、微小血管流れの軸を定義するために使用される骨格化画像の生成、および定量のために同定された個々の血管セグメントのSTAFF生成マップを示す。次に STAFF は、スケルトン化されたイメージを使用してマイクロ血管ネットワークを個々のセグメントに分割し、各セグメントのキモグラフのイメージを生成します。これらの画像は、キモグラフ分析に使用する時間間隔を識別するためのツールと共に、ユーザーに提供されます (図 2)。次に STAFF は、スケルトンとユーザ...

高速キャピラリーフロー画像シーケンスから微小血管流れを定量化するために、STAFF(フィールドワイズフローの空間時間解析)ソフトウェアを開発しました。フルイメージフィールド全体および時間の経過とともに、STAFFはフロー速度を評価し、定量分析のための視覚化と表形式出力のための色分けされた空間マップのシーケンスを生成します。

Changes in blood flow velocity and distribution are vital in maintaining tissue and organ perfusion in response to varying cellular needs. Further, ...

微小血管の流れは毛細血管の間で変化し、数秒間で変化するため、フィールド全体の流れの連続的な定量化方法が必要です。スタッフは、手動で入手するには数ヶ月かかる顕微鏡フィールド全体の流速のほぼ連続的な測定を可能にします。これらの手順は簡単ですが、ビジュアルデモンストレーションは、新しいユーザーが初めてスタッフをナビゲートするのに大きく役立ちます。TrakEM2 を使用して血管ネットワークを定義するには、まずファイル、新規、および TrakEM2 Blank を選択して新しい空の TrakEM2 プロジェクトをセットアップし、ムービーの単一イメージを含む新しいフォルダーをプロジェクトフォルダーとして選択します。TrakEM2 ウィンドウが開きます。メイン作業領域を右クリックし、[イメージのインポートとインポート]を選択します。保存した単一の画像に移動し、イメージを選択します。メインワークエリアでもう一度右クリックし、[キャンバス/レイヤーセットの表示と自動サイズ変更]を選択します。次に、作業ウィンドウの左クリックします。画像が作業領域いっぱいになります。血管ネットワークを含む画像の領域を選択するには、小さな TrakEM2 ウィンドウでテンプレート[エニシング]を右クリックし、[新しい子とエリア リストの追加]を選択します。小さな TrakEM2 ウィンドウでテンプレート Anything を無題のプロジェクトオブジェクトにドラッグします。次に、テンプレート Anything、エリアリスト、プロジェクトオブジェクト、無題のプロジェクト、エニシングにドラッグします。[プロジェクト オブジェクト]の下の無題のプロジェクトで、[すべての領域]リストが表示されます。[Z スペース] タブの下のメインの TrakEM2 ウィンドウに、[エリア リスト] というラベルの付いたバーが作成されます。クリックしてリストを選択します。メインの TrakEM2 ウィンドウでペイントブラシ ツールを選択し、マウス ホイールを回転させながら Shift をクリックして、目的の脈管の直径よりも小さいペイントブラシのサイズを選択します。Control S を押してプロジェクトを保存します。ペイントブラシツールを使用して、焦点外の領域を除く血管ネットワークをペイントします。ラベルが完成したら、TrakEM2 のメイン ウィンドウを右クリックし、[ラベルとしてエクスポートおよびエリア リスト] を選択します。ポップアップ ウィンドウで[縮尺、100%]を選択し、すべてのエリア リストをエクスポートします。TrakEM2 ウィンドウを閉じ、[はい] を選択してプロジェクトを保存します。エリアリストの画像が開き、空白の黒い画像として表示される場合があります。フィジーのメイン メニューで、[画像]、[調整]、[明るさ/コントラスト] を選択します。[明るさとコントラスト]ウィンドウで、[自動]をクリックすると、[エリアリスト]が表示されます。フィジーのメイン メニューで、[イメージ]、[ルックアップ テーブル]、および [参照テーブルの反転] を選択します。白い背景に黒いラベルのこの画像を t-i-f ファイルとして保存し、イメージを閉じます。フィジーでラベルファイルを開き、プラグイン、スケルトン、スケルトンアイを選択します。次に、スケルトンアイズイメージを t-i-f ファイルとして保存します。新しいスタッフプロジェクトを作成するには、「プラグイン」「マクロ」「開く/プロジェクトを開く/作成」を選択し、プロンプトに従って構成ファイルを作成または更新します。[開く/作成]プロジェクトメニューから、プロジェクトディレクトリの入力ファイルフォルダ、入力ムービーファイル、スケルトンファイルに移動して選択します。[最大計測速度]、[最大速度マッピング]、[最小セグメント長]、[ピクセル サイズ]、および [フレーム レート] の値を入力します。画像の背景の輝度が周期的に点滅する場合は、[ちらつき補正]ボックスをオンにして、[OK]をクリックします。データの最適な視覚化に合わせてパラメーターを調整します。データがカラー スケールの全範囲にわたってマップされるように、[マップされた最大速度] を設定してデータの約 95% を含めます。スケルトンを分析するには、「プラグイン、マクロ」および「スケルトンの分析」を選択します。スケルトンファイルが開き、対象領域マネージャが開いて実行されます。[対象地域] マネージャーで、[すべて表示] と [ラベル] をクリックし、[OK] をクリックします。時間間隔を選択するには、「プラグイン、マクロ」、および「時間間隔の編集」を選択し、ムービーの合計時間にわたって 1 つのセグメントからキモグラフが生成されるのを待ちます。コントロールのプラスとマイナスのキーを使用して、必要に応じて、キモグラフのサイズを大きくし、四角形選択ツールを使用して、各時間間隔の周りに長方形を描画します。T キーを押すか、[追加] ボタンをクリックして[時間間隔]の選択を記録し、必要な時間間隔だけ選択を繰り返します。パラメータの選択を評価するには、3 ~ 4 時間間隔を選択し、その間隔の分析を完了します。時間間隔の選択が完了したら、[OK] をクリックします。選択した間隔がプロジェクト フォルダに保存されると、ポップアップ ウィンドウが表示されます。[OK] をクリックします。フローを分析するには、[プラグイン]、[マクロ]、[フローの分析] を選択します。[フロー パラメータの分析] ダイアログ ボックスが開き、[プロジェクトを開く/プロジェクトを作成]ステップで入力した値が表示されます。必要に応じてこれらの値を編集し、[OK] をクリックします。[出力ファイル名] ダイアログ ボックスが開き、[プロジェクトを開く/プロジェクトを作成] ステップで入力した名前が表示されます。必要に応じてこれらの名前を編集し、[OK]をクリックしてフロー解析を開始します。フローが解析されたことを示すダイアログボックスが表示されたら、[OK]をクリックして解析結果をCSVスプレッドシートファイルに保存します。空間マップを作成するには、[プラグイン]、[マクロ]、および [空間マップの作成] を選択します。[空間マップ パラメーター] ウィンドウが開き、[プロジェクトを開く/プロジェクトを作成] ステップで入力した値が表示されます。必要に応じてこれらの値を編集し、[OK]をクリックします。流速の空間マップのテンポラルシーケンスは、流速を示す各色で生成されます。生成された 1 つの画像のスタックを 1 つの間隔でスクロールして、フローの空間的および時間的な変動を視覚化し、ファイルをムービーとして共有する a-v-i ファイルとしてスタックを保存します。スタッフ分析は、数秒から数分に及ぶ時間の期間にわたって、顕微鏡フィールド全体にわたって微小血管速度の完全な国勢調査を生成します。例えば、マウスの肝臓におけるこの時系列の微小血管ネットワークの単一の画像を使用して、生成された骨格化された画像を使用して微小血管流の軸を定義し、Staffが生成した個々の血管セグメントの地図を、その後の流量定量のために同定することを可能にした。スケルトン化された画像から生成された個々の血管セグメントから、時間の経過に伴う各線分に沿った強度を表すキモグラフを生成することができる。スケルトンとユーザー供給の時間間隔を使用して、各セグメントのキモグラフを個々のセグメント時間間隔に分割できます。Staffは、各セグメントの時間間隔からカイモグラフの主な角度を識別し、計算された速度の測定値をCSVデータファイルとして提供します。スタッフCSV出力を使用して、全体的な速度分布を分析し、個々の血管セグメントの速度を時間の経過に従ってプロットすることができます。色分けされた速度マップ画像のスタックとして視覚化できます。Staff から得られた結果は、サンプルの安定性、フレームレート、解像度、および信号対雑音比に関して、画像シリーズの品質に依存することに注意してください。スタッフ速度マップ出力を使用すると、空間フローパターニングを直感的に探索でき、スタッフCSV出力では、処理グループ内および処理グループ間の流速の統計解析が可能になります。

spatial-temporal-analysis-of-fieldwise-flow-in-microvasculature

Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

軟膜微小循環の時間的空間的血行動態および炎症性イベントに追従するように生体顕微鏡。...

クローズ頭蓋窓を使用してマウス脳の微小循環の生体顕微鏡

マイクロ粒子画像流速（μPIV）が正確な速度プロファイルを与えるクロス相関である血流に播種したマイクロ粒子のペアのイメージを視覚化するために使用されます。臨床用途を有する各々が剪断速度、最大速度、速度プロファイルの形状、流量は、これらの測定値から導出することができる。...

マイクロ血流の速度プロファイル測定用マイクロ粒子画像流速

生体内顕微鏡検査は、動物で網膜血管の直径、血流速度、および総網膜血流を視覚化および測定するために使用できます。...

マウスの網膜血流の生体内ビデオ顕微鏡測定

バイオフィルムは、周囲の環境と複雑な相互作用を持っています。バイオフィルムと環境の相互作用を包括的に研究するために、バイオフィルム開発のための不均一な化学環境を作り出すための一連の方法、局所的な流速の定量化、およびバイオフィルムコロニー内および周囲の物質輸送を分析するための一連の方法を紹介します。...

バイオフィルムと生息地異質の共同開発を特徴付けるための方法

ここで透明な神経血管ファントムを作製し、そこに流れを特徴づけるの簡略化手法を提示します。我々...

体外メゾスケール粒子画像流速測定法研究神経血管の流れ

ここでは、マイクロ流体チップと、新生血管形成の初期微小環境を再現する、自動制御された高効率循環マイクロ流体システムを提供し、高い発光せん断応力、経経皮流の生理学的レベル、および様々な血管内皮成長因子(VEGF)分布によって内皮細胞(ECs)を同時に刺激することを可能にする。...

新血管新生初期事象を模倣する微発性モデル

我々は、二次元(2D)成長および創傷修復アッセイのタイムラプスイメージングのための一次マウス胚口蓋間葉細胞の単離および培養のためのプロトコルを提示する。また、タイムラプスイメージングデータの解析方法を提供し、細胞流の形成と指向運動性を決定します。...

集団運動属性を解析するためのマウス胚性口蓋前葉細胞の単離とタイムラプスイメージング

このプロトコルは、ライトシート蛍光顕微鏡を使用した定量的なホールマウント3次元血管イメージングの迅速な方法を導入します。この方法の有効性は、ニワトリ胚モデルの咽頭アーチ動脈系を使用して実証され、血行動態の力は計算流体力学 によって...

定量的研究のための小動物血管系の迅速なホールマウント高分解能イメージング

超音波局在顕微鏡 (ULM) は、最近開発された技術であり、 in vivo で微小血管系をイメージングする際に前例のないレベルの解像度を可能にします。この研究では、前臨床研究用に設計された標準化された機能的超音波イメージングプラットフォームを使用して、げっ歯類の脳微小血管系の超解像画像を取得する方法を詳細に説明します。...

げっ歯類の脳微小血管系の超解像マッピングのための超音波局在顕微鏡

光による小さなGTPase活性の時空間制御の方法が記載されている。このメソッドは、ラパマイシン誘発性FKBP-FRBのヘテロと写真ケージシステムに基づいています。光照射の最適化は、細胞内レベルでの低分子量GTPaseの時空間時間的制御の活性化を可能にします。...

生きた細胞の細胞内レベルでの秒のタイムスケールの上に小さなGTPase活性の時空間操作

学ぶ STAFFソフトウェアを用いた微小血管系のフィールドワイズフロー連続定量法。TrakEM2で血管ネットワークを定義し、カラー空間マップで可視化することで、従来数か月かかる解析を数時間で完了させる効率的な手法です。

微小血管系におけるフィールドワイズフローの空間時間解析

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