Name: 神経前駆細胞由来ニューロンを用いた神経突起増殖アッセイと神経毒性評価 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-06T15:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 41 s
Description: 学ぶ神経突起増殖アッセイと神経毒性評価法。ヒト神経前駆細胞由来ニューロンを用いて、小分⼦化合物の神経毒性を評価する。薬物スクリーニングにおける高い翻訳可能性と生理学的関連性を持つ手法です。

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この研究は、MAFに授与されたNIMAD研究助成金(940714)によって資金提供されました。

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<li>Schmitz, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+analysis+of+neuronal+morphology%2C+synapse+number+and+synaptic+recruitment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Automated analysis of neuronal morphology, synapse number and synaptic recruitment.</a> Journal of Neuroscience Methods. 195 (2), 185-193 (2011).</li>
<li>Grandjean, P., Landrigan, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+neurotoxicity+of+industrial+chemicals%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet%22%5BJournal%5D)">Developmental neurotoxicity of industrial chemicals.</a> The Lancet. 368 (9553), 2167-2178 (2006).</li>
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<li>Dolmetsch, R., Geschwind, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+brain+in+a+dish%3A+the+promise+of+iPSC-derived+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The human brain in a dish: the promise of iPSC-derived neurons.</a> Cell. 145 (6), 831-834 (2011).</li>
<li>Pan, C., Kumar, C., Bohl, S., Klingmueller, U., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+proteomic+phenotyping+of+cell+lines+and+primary+cells+to+assess+preservation+of+cell+type-specific+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Comparative proteomic phenotyping of cell lines and primary cells to assess preservation of cell type-specific functions.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 8 (3), 443-450 (2009).</li>
<li>Alge, C. S., Hauck, S. M., Priglinger, S. G., Kampik, A., Ueffing, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+protein+profiling+of+primary+versus+immortalized+human+RPE+cells+identifies+expression+patterns+associated+with+cytoskeletal+remodeling+and+cell+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Differential protein profiling of primary versus immortalized human RPE cells identifies expression patterns associated with cytoskeletal remodeling and cell survival.</a> Journal of Proteome Research. 5 (4), 862-878 (2006).</li>
<li>Yeo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Embryonic+Stem+Cell-Derived+Neural+Lineages+as+In+Vitro+Models+for+Screening+the+Neuroprotective+Properties+of+Lignosus+rhinocerus+%28Cooke%29+Ryvarden%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Research+International%22%5BJournal%5D)">Human Embryonic Stem Cell-Derived Neural Lineages as In Vitro Models for Screening the Neuroprotective Properties of Lignosus rhinocerus (Cooke) Ryvarden.</a> BioMed Research International. 2019, (2019).</li>
</ol>

すべての著者は、潜在的な利益相反がないことを示しています。

このプロトコルは、試験化合物による処理時の神経突起長の試験について説明する数少ない公表された論文の1つである。さらに、神経突起の成長アッセイや神経毒性評価にhNPCを用いる方法について述べています。hNPC由来ニューロンに対するこの神経突起伸長アッセイおよび神経毒性評価を利用することにより、エピジェネティックな低分子化合物のカテゴリーの神経因性ポテンシャル、HDAC阻害剤、神経突起成長を誘導する際の神経因性が22に実証される。さらに、Sartorらによって提示された別の論文では、このプロトコルは、ヒストンタンパク質であるH4K5acの蛍光強度を定量するために用いられる、いくつかのエピジェネティック修飾化合物23で治療する。
認知機能は、神経回路内の適切な配線と機能的な接続に依存しています。表現型スクリーニングアプローチとしての神経形態の様々な側面の詳細かつ一貫した定量化は、神経発達から精神疾患に至るまでの脳障害につながる基礎経路における信頼できる洞察を達成するために不可欠である。表現型ス...

神経突起増殖は、神経ネットワークと神経再生11,22の形成の基礎となるプロセスである。損傷後、神経突起の成長は神経系の再生に重要な役割を果たす。神経突起伸長は、神経変性疾患および神経損傷の結果を増強する神経細胞再生活動を誘導する細胞外シグナル伝達の重要な要素でもある33、4、5、6。4,5,6
様々な神経系統を産生する際の分化の可能性を維持することにより、ヒト神経前駆細胞(hNPC)は、中枢神経系(CNS)機能および開発77、8、98の研究のためのモデルシステムを9提供することができる。ヒト細胞モデルとしてのhNPCの高い翻訳ポテンシャルおよび生理学的関連性は、神経突起成長関連の創薬スクリーニングにおいてかなりの利点を提供する。しかし、高スループットアッセイ用のプライマリセルモデルのメンテナンスとスケーリングは、時間がかかり、10、11、12、1311,12,13の労働集約的な可能性があります。10
神経突起伸長研究における提示方法の適用に加えて、神経毒性評価は、hNPC由来のニューロンを用いた別のアプリケーションである。検査されていないか、または十分に理解されていない神経毒性の可能性を持つ市販の化学化合物の数千があります。.したがって、より信頼性が高く、より効果的なスクリーニング実験は、発達神経毒性を引き起こす可能性に基づいて化合物を評価、区別、およびランク付けする、高い需要14である。環境中の未試験化合物の豊富と共に神経疾患の有病率および発生率の増加は、神経毒性を引き起こす可能性のある有害な環境化合物を同定するためのより信頼できる効率的な実験の開発を必要とする15。
本明細書において提示される方法は、ヒトの神経前駆細胞由来ニューロンを利用して神経突起の伸長および神経毒性を誘導する化合物の能力をスクリーニングするために利用することができる、ヒト生物学を密接に表す細胞モデルである。

<table><tbody><tr><td>4ウェルガラスチャンバースライド</td><td>Sigma</td><td>PEZGS0816</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A-11001</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594</td><td>Invitrogen</td><td>R37117</td><td></td></tr><tr><td>抗生物質-抗真菌剤</td><td>Gibco</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>Anti-&β;-Tubulin III</td><td>Thermo</td><td>MA1-118X</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Thermo</td><td></td><td></td>17504001</tr><tr><td>B27 - マイナスビタミンA</td><td>サーモ</td><td>12587010</td><td></td></tr><tr><td>BDNF</td><td>PeproTech</td><td>450-02</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A8531</td><td></td></tr><tr><td>CellTiter-Glo</td><td>Promega</td><td>G7572</td><td></td></tr><tr><td>CoolCell</td><td>Corning</td><td>432000</td><td>標準化された制御速度を確保する細胞凍結容器 -1&#176;C/分細胞の凝固は-80&#176;C冷凍庫</td></tr><tr><td>CryoStor CS10</td><td>StemCell Technologies</td><td>7930</td><td>10% DMSO</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>を含む</td>凍結保存培地 <td>Thermo D1306</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>34869-100ML</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Gibco</td><td>PHG0311</td><td></td></tr><tr><td>FGF</td><td>Gibco</td><td>PHG6015</td><td></td></tr><tr><td>ホルムアルデヒド</td><td>サーモ</td><td>FB002</td><td></td></tr><tr><td>GDNF</td><td>ペプロテック</td><td>450-10</td><td></td></tr><tr><td>グルタマックス</td><td>ギブコ</td><td>35050061</td><td>L-アラニル-L-グルタミンサプリメント</td></tr><tr><td>ヤギ血清</td><td>サーモ</td><td>50062Z</td><td></td></tr><tr><td>ヘパリン</td><td>カルバイオケム</td><td>375095</td><td></td></tr><tr><td>ラミニン</td><td>シグマ</td><td>L2020-1MG</td><td></td></tr><tr><td>L-アスコルビン酸</td><td>Sigma</td><td>A92902-25G</td><td></td></tr><tr><td>L-リジン</td><td>Sigma</td><td>L5501</td><td></td></tr><tr><td>MEM 非必須アミノ酸</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>mFreSR</td><td>StemCell Technologies</td><td>5854</td><td>ヒト胚性および誘導多能性幹細胞の凍結保存用に設計された無血清凍結保存培地</td></tr><tr><td>N2</td><td>Gibco</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>71376</td><td></td></tr><tr><td>ニューロベース ミディアム</td><td>Gibco</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>Nunc 384-Well ポリスチレン ホワイト マイクロプレート</td><td>Thermo</td><td>164610</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Thermo</td><td>10010-049</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-lysine</td><td>Sigma</td><td>P5899-5MG</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold 退色防止封入剤</td><td>Thermo</td><td>P10144</td><td></td></tr><tr><td>レチノイン酸</td><td></td><td>Σ R2625</td><td></td></tr><tr><td>アジ化ナトリウム</td><td>Σ</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>StemPro Accutase</td><td>Gibco</td><td>A1110501</td><td>タンパク質分解酵素およびコラーゲン分解酵素を含む細胞解離試薬</td></tr><tr><td>Synaptophysin</td><td>Thermo</td><td>MA5-14532</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Sigma</td><td>10708976001</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>X100-100ML</td><td></td></tr></tbody></table>

神経前駆細胞由来ニューロンを用いた神経突起増殖アッセイと神経毒性評価

A Neurite Outgrowth Assay and Neurotoxicity Assessment with Human Neural Progenitor Cell-Derived Neurons

神経突起伸長アッセイおよび神経毒性評価は、本明細書において提示された方法を用いて行うことができる2つの主要な研究である。このプロトコルは、神経形態の信頼性の高い分析と、低分子化合物による治療時の神経突起長およびシナプスタンパク質の局在化および豊富さの修飾の定量的測定を提供します。神経突起伸長研究における提示方法の適用に加えて、神経毒性評価は、潜在的な発達神経毒性効果に基づいて市販の化学化合物を評価、区別、およびランク付けするために行うことができる。
細胞株は今日、神経科学における複合スクリーニングアッセイで広く使用されているが、それらはしばしばその組織起源とは遺伝的および表現的に異なる。一方、初等細胞は、生体内で観察される重要なマーカーおよび機能を維持する。したがって、これらの細胞が神経突起の成長アッセイや神経毒性評価を提供できる翻訳ポテンシャルと生理学的関連性のために、ヒト神経前駆細胞(hNPC)を一次ヒト細胞モデルとして使用することで大きな利益を得ることができます。
本明細書で提示される方法は、ヒトの神経前駆細胞由来ニューロンを利用して神経突起の伸びおよび神経毒性を誘導する化合物の能力をスクリーニングするために利用することができる、ヒト生物学を密接に表す細胞モデルである。

原稿に記載されているプロトコルは、最近発表された22、23,23の論文でうまく使われています。図3は、低分子化合物の神経突起の伸びとそれに続く神経形成能力のマーカーとしてのエピジェネティック化合物としてのHDAC阻害剤の効果を調べるhNPC由来ニューロンの使用を示す。
さらに、図4では、試験化合物(HDAC阻害剤)の神経毒性も、384ウェルプレートでhNPCを同時に分化することによって評価され、提示された細胞モデル(hNPC)の神経毒性評価の可能性およびより多くの化合物に対する神経毒性を試験するためにスケールアップする能力を示す。
Sartor et al. (図 5) による別の論文では、H4K5acの存在量を定量化する神経細胞蛍光...

提示されたプロトコルは、低分子化合物の神経突起成長アッセイおよび神経毒性評価のための方法を記述する。

Neurite outgrowth assay and neurotoxicity assessment are two major studies that can be performed using the presented method herein. This protocol provides ...

ヒトの生物学と低分子化合物の神経毒性評価に非常に関連する神経突起伸長アッセイを記述する提示されたプロトコル。ヒト初代ヒト細胞モデルとしてのヒト神経前駆細胞の翻訳ポテンシャルと生理学的関連性が高く、神経突起性創薬スクリーニングおよび神経毒性評価において大きな利点を提供する。提示されたプロトコルを利用して、ヒト誘導多能性幹細胞およびヒト胚性幹細胞由来ニューロンは、神経突起増殖アッセイおよび神経毒性評価のための代替細胞源として使用することもできる。浮動神経球でメディアを収集し、50ミリリットルの円錐管に移すことから始めます。3分間300〜400回gでチューブを遠心分離する。その後、慎重に上清を吸引します。解凍した細胞解離試薬の500マイクロリットルで球を再懸濁させる。球体を摂氏37度で5~15分間インキュベートします。その後、5〜10ミリリットルの事前温めた培養培地を加え、チューブを300〜400倍gで5分間遠心分離し、神経球を沈殿させます。上清を吸引し、神経圏が単一の細胞懸濁液を形成するまで、1000マイクロリットルピペットで上下にピペット化する2ミリリットルの文化メディアを加える。細胞を数えた後、10ミリリットルの培養培地中のT25フラスコに200万~300万個の細胞を加える。3 日ごとに半分の培養メディアを交換します。市販の凍結保存培地を使用して細胞を凍結する。神経球を50ミリリットルのチューブに移し、球体を底に落ち着かせる。200または1000マイクロリットルピペットチップを使用して、大きな神経球を新しい50ミリリットルチューブに移してから通過します。残りの神経球を300〜400回gで3分間遠心し、上清を慎重に除去する。1ミリリットルの凍結保存試薬で最大1000個の球体を再懸濁し、凍結管に移します。チューブをマイナス80度で一晩保管し、液体窒素に移動して長期保存します。神経細胞の伸びを測定するには、フィジーで画像を開き、分析、ツール、ROIマネージャーを選択します。ツールバーの「ストレート」の5番目のアイコンを右クリックし、フリーハンドラインに切り替えます。必要に応じて、同じアイコンをダブルクリックして、線幅を 10 に変更します。その後、細胞本体の近くで始まり、先端まで延びる最も長い神経突起を追跡します。コントロールと T を押してから F キーを押して測定を ROI マネージャに追加し、測定したニューロンをハイライトします。ROI 内のすべての数値を選択します。[計測]をクリックし、測定値をコピーしてスプレッドシートに貼り付けます。ラベル付けされた細胞の蛍光強度を測定するには、ツールバーのフリーハンド選択の4番目のアイコンをクリックし、セルの形状を描画します。[分析]をクリックし、[測定を設定]をクリックします。次に、[面積]、[平均グレー値]、[最小

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

この記事では、新規プロトコルと試薬の高いコンテンツの分析を用いてニューロンとアストロサイトの共培養での化合物および治療の神経毒性効果の感度測定のために設計されたセットを説明します。結果は、高含有量の分析は、神経毒性評価のためのエキサイティングな新技術を表すことを示している。...

神経毒性の高いコンテンツ分析のための神経とアストロサイト共培養アッセイ

私たちは、人間の神経前駆細胞の大量供給と神経修復のための開発CNSにおける神経細胞の種類の導出を可能にする低分子化合物、と定義された条件の下で維持さ多能性ヒト胚性幹細胞から直接、神経芽細胞の誘導のためのプロトコルを確立している。...

小分子の誘導と多能性ヒト胚性幹細胞からヒト神経前駆細胞と神経細胞の効率的な導出

このビデオプロトコルは、神経幹細胞（NSC）の物理的（サイズと内部の細かさ）に基づいて、フローサイトメトリー技術を用いた蛍光特性の再生可能エネルギー源から神経前駆細胞の生成とその後の精製のための新しい方法を示します。...

神経芽細胞アッセイ：フローサイトメトリーを用いて神経幹細胞の子孫を差別から神経前駆細胞の生成と濃縮のためのアッセイ

このビデオは、ニューロスフィアからの神経前駆細胞の移動応答を研究するin...

NPC Neurosphere Assay:ニューロスフィアからの神経前駆細胞の遊走応答を評価するためのIn Vitroアッセイ

このビデオでは、hNPC由来ニューロンの生存率に対する神経突起伸長促進小分子化合物の神経毒性を評価するための発光ベースの方法について説明します。このアッセイは、細胞生存率の指標である細胞内ATPレベルを測定し、試験化合物処理後の神経毒性を評価するものです。...

ニューロン上の試験化合物の神経毒性を評価するための発光ベースのアッセイ

分化したヒト神経幹細胞(hNSC)上のmiRNAの変化を特徴づける目的で、3次元システム上でのhNSC分化、miRNA...

三次元培養、マイクロRNAの分析と推定標的遺伝子上のヒト神経幹細胞株の分化

ヒトのニューロンで起こることの翻訳モデルとして機能する、信頼性のある複製可能なin vitroシステムを持つことは、神経生物学および神経ウイルス学において非常に重要です。このプロトコールでは、SH-SY5Yヒト神経芽腫細胞を培養し、in...

SH-SY5Yヒト神経芽腫細胞株の分化

ヒトが誘導する多能性幹細胞（hiPSC）は、薬物および化学物質のスクリーニングならびに神経毒性を含む毒性試験のための新しいインビトロモデルの開発のための強力なツールと考えられている。ここでは、hiPSCをニューロンおよびグリアに分化させるための詳細なプロトコールが記載されている。...

神経毒性試験のための、ヒト誘導多能性幹細胞のニューロンとグリアの混合培養物への分化のためのプロトコール

増殖、移行、および神経突起伸長はしばしば脳神経疾患で摂動など発達のプロセスします。このように、迅速かつ再現性をもって人間の iPSC 由来の Npc でこれらの神経発達のプロセスを評価するためのプロトコルを提案する.これらのプロトコルには、NPC...

ひと神経前駆細胞 (Npc) における神経発達学的表現型の迅速な検出

このプロトコルは、以前にインビトロで神経前駆体から数週間分化していたヒト幹細胞由来ニューロンを再中断および培養するための詳細な手順を説明する。この手順は、光顕微鏡検査および高含有量スクリーニングと互換性のある形式で、神経伝達物、シナプス、および後期発現ニューロンマーカーのイメージングベースのアッセイを容易にします。...

ニューウトジェネシスとシナプス成熟の高含有量スクリーニングに対するヒト多能性幹細胞由来ニューロンの分化後再形成

本報告では、EGFPと目的のタンパク質との共トランスフェクトにより、胚ラット皮質ニューロンにおける神経伝達の増殖を研究するための簡単なプロトコルについて述べる。...

原発性ニューロンにおける神経質の増殖を研究するための強化された緑色蛍光タンパク質ベースのアッセイ

学ぶ神経突起増殖アッセイと神経毒性評価法。ヒト神経前駆細胞由来ニューロンを用いて、小分⼦化合物の神経毒性を評価する。薬物スクリーニングにおける高い翻訳可能性と生理学的関連性を持つ手法です。

神経前駆細胞由来ニューロンを用いた神経突起増殖アッセイと神経毒性評価

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