外傷性出血挫傷および神経炎症に対する前臨床制御皮質衝撃モデル

脳挫傷を伴う実質内出血や神経炎症は、重度の二次性脳損傷を引き起こす可能性があります。このプロトコルは、マウス制御皮質衝撃(CCI)モデルの詳細を詳述しており、研究者は出血、挫傷、心的外傷後免疫応答を研究し、潜在的な治療法を探求することができます。

このモデルは、頭蓋内出血、鉄毒性、ニューロン死、軸索損傷、神経学的欠損、神経炎症など、脳挫傷に関連する病状を研究するために利用できます。この手法の主な利点は、CCIデバイスへの影響の速度や死などの生化学的パラメータを操作することにより、脳損傷の重症度を簡単に制御できることです。CCI 誘発性の局所皮質粉砕損傷は、非常に再現性があります。

適切な定位技術と開頭術は、安定した再現性のある CCI 誘発性脳損傷を引き起こす主要な決定要因です。一般に、この手順に不慣れな研究者は、マウスをステリオテックスフレームに安定させ、適切な開頭術を行うのに苦労します。手順を実演するのは、私の研究室の技師であるJhih Shuan Linさんです。

まず、動物につま先のつま先つまみ反射がないことを確認して、適切に麻酔をかけられるようにします。電気バリカンでネズミの頭を尾側から吻側に向けて剃ります。ただし、ひげをトリミングしないでください。

マウスを定位固定装置フレームに置き、イヤーバーを外耳道に慎重に挿入し、マウスの頭が両方の耳バーで均等に安定していることを確認します。手術期間中、麻酔を1〜2%イソフルランに維持します。.手術中の乾燥を防ぐために、両目にワセリンを塗ります。

次に、滅菌綿棒を使用して、剃った頭をベタジンで消毒し、続いて70%エタノールで消毒します。100マイクロリットルの0.25%ブピバカインを31ゲージのインスリン針で皮下に投与し、注射部位を優しくマッサージして吸収を改善します。.メスまたはハサミで頭皮の正中線に沿って縦方向に切開します。

次に、止血器を使用して皮膚を右側に引き抜きます。露出した頭蓋骨を1分間乾かします。次に、滅菌綿棒で頭蓋骨に残っている血液と組織をきれいに取り除きます。

動物の頭が水平面で水平であることを確認し、解剖学的なランドマークであるブレグマとラムダを特定し、両方の場所に鉛筆で印を付けます。BregmaとLambdaの両方のZ座標を測定することにより、動物の頭が吻側-尾側方向に水平であることを確認します。同じ手順を使用して、ヘッドを水平に配置します。

31ゲージのインスリン針を使用して、頭蓋切除部位を特定します。XY の原点を Bregma に設定し、針を右に 3 mm 横に動かします。この位置を頭蓋切除術の部位としてマークし、鉛筆で頭蓋骨に直径4ミリメートルの円を描きます。

鉛筆で縁取られた円に沿って、トレフィン付きの高速マイクロドリルで切り取り、直径4mmの穴を開けます。ピンセットで骨フラップを取り外し、氷のように冷たい通常の生理食塩水で保管します。出血を止めるために脳の表面に圧力をかける前に、生理食塩水で穴をやさしくすすいでください。

CCIデバイスで、直径2.5mmの丸みを帯びたインパクターの先端を22.5度の角度に設定します。衝撃先端を硬膜表面にゼロにし、コントロール ボックスの衝撃パラメータを毎秒 4 メートルの速度と変形深さ 2 ミリメートルに設定します。金属チップを引っ込めます。

ピストンを放電して、脳に宿便を発生させます。次に、滅菌綿棒を負傷した部分に置き、出血を止めます。骨フラップを元に戻し、歯科用セメントで固定します。

ティッシュ接着剤で頭皮を閉じます。マウスをヒートランプの下に置き、完全に回復するまで寝具付きの清潔な回復ケージに入れます。適切な定位技術と頭蓋切除術は、安定した再現性のある CCI 誘発性脳損傷を引き起こす主要な決定要因です。

理想的な頭蓋切除術は、偽の手術を受けた脳に最小限の組織学的損傷を引き起こすでしょう。脳損傷と脳梁損失の変化は、CCIの1、3、7、および28日目に観察されました。さらに、挫傷側の片側脳萎縮がCCI後28日目に見られました。

神経炎症は、Iba1陽性の活性化ミクログリアと挫傷領域の境界付近のマクロファージの蓄積によって明らかになりました。実質内出血は、CCI後1日目から7日目までのLy76陽性染色によっても検出できた。CCI後7日目に、破裂した細胞形態と無傷の細胞形態を持つ赤血球の混合物が観察され、この段階でRBCが溶解されたことが示唆されました。

この現象は、CCI後7日目から28日目にかけて挫傷領域で第二鉄の沈着が検出可能であったという観察結果と一致していました。活性化されたミクログリアとマクロファージは、CCI後3日目から28日目にかけて、挫傷部位から遠く離れた線条体で観察され、脳梁と線条体の損傷を示しています。この技術は、研究者が脳出血誘発性神経炎症相互作用をさらに調査する方法を開きます 出血挫傷後のミクログリアなどの免疫細胞の応答を理解することを通じて。