ライブイメージングのためのフィブリン・クロッツによる ショウジョウバエ 組織固定化の応用

このプロトコルでは、フィブリン血栓を使用したサンプルの固定化について説明しました。サンプルは、カバースリップの表面にあるフィブリノーゲンを含む培養液の滴に移され、その後、トロンビンを添加して重合が誘導されます。解剖顕微鏡下で、ブラシを使用してL3幼虫をPBSを含む9ウェルホウケイ酸ガラス皿に移します。

かき混ぜて幼虫からほとんどのハエの餌を取り除き、それを培養培地を含む別の井戸に移します。鉗子を使用して、幼虫を体長の中央にある全直径にわたってつかみ、200マイクロリットルの新鮮な培地を含むホウケイ酸プレートの別のウェルに移します。幼虫を放さないでください。

幼虫をその全直径にわたって半分に切断するには、鉗子の先端を横方向に動かして把持領域を粉砕するか、幼虫を保持している2つの鉗子の先端の間に別の鉗子のペアの一方の先端をスライドさせます。鉗子を使用して幼虫をキューティクルで保持し、別の鉗子のペアを使用して、脳を引っ張らずにキューティクルを剥がします。これを繰り返して、脳に由来する神経が見え、脳と口の部分をつなぐ器官にアクセスできるようになるまで

脳に由来する神経を鉗子で保持しながら、他の鉗子で脳と口の部分との接続を切断し、脳をキューティクルの残りの部分から分離します。腹側神経索から出ている軸索で脳をつかみ、周囲の臓器を脳からそっと引き離して摘み取ります。次に、目の想像円板と脳との間の接続をもう一方の鉗子でつかみ、脳を引っ張らずにこの接続を切断します。

脳から他の組織が適切に取り除かれ、損傷を受けていないことを確認してください。脳に損傷の兆候が見られる場合は、脳を廃棄してください。P20を出し入れしてコーティング溶液をピペットでピペットでコーティングし、コーティングされたチップと3マイクロリットルの培地で脳を吸引し、200マイクロリットルのクリーンな培養培地を含む別のウェルでピペットで取り出します。

このプロセスを十分な脳が解剖されるまで繰り返し、解剖が行われるウェルの培地を時々交換します。先端がコーティングされたP20ピペットを使用して、解剖した脳を200マイクロリットルの培地とフィブリノーゲンを含むホウケイ酸プレートの別のウェルに移します。1つの脳と9マイクロリットルの培地とフィブリノーゲンを吸引します。

チップの端が細胞培養皿のカバーガラス底部にほぼ触れた状態で、ピペットチップを出た直後に培地がカバースリップに触れるように内容物をピペットで取り出します。一対の鉗子の片方の先端、または閉じた一対の鉗子を使用して、脳を培養培地とフィブリノーゲン滴内に優しく押して配置します。脳の腹側部分を画像化する必要がある場合は、フィブリノーゲン凝固を誘導して、脳を血栓内に適切に向けます。

脳をドロップの片側に押します。ピペットの先端で脳の反対側にあるドロップの端に触れ、1マイクロリットルのトロンビンを追加します。フィブリノーゲンが重合を開始し、液滴の片側に濁った沈殿物が形成されるのを1〜2分待ってから、脳をフィブリン塊にそっと押し込んで押し込み、腹側が脳を変形させずにカバースリップにできるだけ近づくようにします。

フィブリンの塊に押し込まれていない脳の側面に近い1マイクロリットルのトロンビン溶液をピペットで取り出します。2番目のフィブリン血栓が固まるまで2〜3分待ってから、血栓の端を押して、脳を変形させないように注意しながら、血栓の端をカバースリップにより強く接着させます。脳がカバースリップから離れすぎているように見える場合は、フィブリン塊を脳に近づけて脳に近づけます。

脳の背側部分を画像化するためのフィブリン塊を誘導するために、脳をドロップの中心に置き、背側部分をカバースリップに向けます。P2ピペットを使用して、ピペットチップで脳の反対側にあるドロップの端に触れ、1マイクロリットルのトロンビンをピペットで取り出します。フィブリノーゲンが重合し始め、濁った繊維状の沈殿物が形成されるのを2〜3分待ってから、血栓の端を押して、脳を変形させないように注意しながら、血栓の端を押してカバースリップにより強く接着させます。

先端の端を血栓から約0.5センチメートル上に置き、フィブリノーゲンを含まない390マイクロリットルの培地を血栓の上に静かに滴下します。血栓の側面に培地を加えないでください、カバースリップから剥がれる可能性があります。余分なトロンビンを洗い流すには、皿から300マイクロリットルを取り出し、次に300マイクロリットルのきれいな培地を追加して、血栓が完全に浸ったままであることを確認します。

温度変化による焦点の変化を避けるために、試薬を含む溶液を培養皿と同じ温度に保ちます。培養皿自体をずらさずに培養皿の蓋を外します。取り外しを容易にするために、イメージングする前に、35ミリメートル皿の蓋を逆さまにして皿の上に置きます。

P1000ピペットチップを培養皿内の培地の表面に近づけ、十分な量の試薬溶液を静かに放出します。これは、血栓を剥離する可能性のある強いフラックスを発生させないようにします。培養皿内の溶液を均質化するには、P200ピペットを使用して、少量の溶液を5回ゆっくりとピペットで出し入れします。培養皿をずらさずにフタを元に戻し、イメージングを再開します。

GFPタグ付きバズーカを発現するフィブリン固定化幼生の脳にNAPP1を1つ加えると、aPKCのアナログ感受性変異を持つ脳は、神経上皮の収縮と、神経芽細胞とその子孫のバズの明るいクラスターを示しました。神経芽細胞はタイムラプスを通して分裂し続け、組織が健康を保っていることを示しています。また、脳は培地の変更にもかかわらず、ほとんどドリフトを示さなかった。

同様に、GFPタグ付きバズーカを発現する卵巣に1つのNAPP1を適用すると、アナログ感受性aPKC変異体濾胞細胞の収縮が誘導されましたが、コントロールの収縮は誘導されませんでした。横方向と焦点のずれの両方を表示するハイパースタックは、最初に横方向のドリフトを補正し、次に焦点のドリフトを補正した結果、元のハイパースタックで観察された動きが大幅に減少しました。このプロトコルを試みるときは、血栓がまだ可鍛性であるが、脳を安定して保持するのに十分な固体である間に、部分的に重合したフィブリン血栓に脳を押し込むことが重要です。

空の血栓の操作を試み、重合中に血栓を静かに調べて、血栓がどれほど頑丈かを確認します。