健康で負傷したマウス心臓における三次元線維芽細胞組織のための精製されたCLARITYベースの組織クリアリング
2021年5月16日
組織のクリアの精製方法が開発され、成体マウスの心臓に適用された。この方法は、遺伝的レポーター戦略に起因する標識された線維芽細胞蛍光を維持しながら、緻密な自己蛍光心臓組織をクリアするように設計された。
この新しい組織クリアリングプロトコルは、既存の技術を改善し、より正確なin vivoで心臓内の特定の細胞タイプと傷害条件下でのそれらの行動を見ることができるようにする。このプロトコルは、迅速かつかなり簡単です。細胞または組織染色を必要とせずに、バックグラウンド組織自動蛍光からの干渉を最小限に抑え、マルカ蛍光の維持を可能にする。
実験マウスの腹側表面を洗浄するために70%エタノール浸漬ガーゼパッドを使用して開始します。手術用ハサミを使用して、xiphoidプロセスの約3メートル下に約3メートル下の3センチメートルの横切り切開を行い、マウスを腹部からxiphoidプロセスにデグローブして、下層の腹壁組織から皮膚を分離する。皮下腹壁組織で2センチメートルの横切り切開を行い、xiphoidプロセスより3センチメートル下に、リブケージを通して正中線の上にこの切開から垂直カットを行います。
胸を後ろに固定して心臓を露出します。そして、優れた静脈と大オルタに冷たいPBSを注入するために27ゲージ針を装備した10ミリリットルの注射器を使用してください。すべての血液が心臓から洗い流されたら、10ミリリットルの冷たい4%PFAを上の大静脈と大オルタに送り込み、固定プロセスを開始する。
固定剤のすべてが点滅したら、心臓を切除し、まっすぐなブレードメスを使用して心房、右心室、中隔および左心室を分離します。心臓を冷たい4%PFAの15ミリリットルの円錐形チューブに入れ、ヌテットターで摂氏4度で一晩インキュベーションします。翌朝、0.25%の写真のイニシエーター溶液を作りたてのヒドロゲル溶液に加え、心臓をハイドロゲルに移します。
物理的な乱れなしに摂氏4度で一晩インキュベーションのためにホイルで円錐管を包みます。翌朝、37度のビードバスで2.5時間チューブを温め、鉗子を使用して心臓をPBSの15ミリリットルチューブに慎重に移します。PBSで3回、1回、1回、1回、37度で1回、ヌテエーターで心臓を洗浄し、心臓をアクティブな電気泳動機のバスケットに移します。
蓋を所定の位置に固定し、アクティブな電気泳動チャンバの貯蔵所に電気泳動クリア液を充填します。チャンバーがいっぱいになったら、溶液中のバスケットを沈め、電気泳動機のキャップを所定の位置に締め付けます。その後、1.5アンペアと摂氏37度で1.5時間電気泳動機を実行します。
電気泳動後、心臓を視覚的に調べて、不透明な組織が残らないようにします。クリアした心臓を15ミリリットル2回、1回、新鮮なPBSで1回、ヌテット器で洗浄1回37度で洗浄します。ヘムオート蛍光を低減させる脱色剤に心臓を沈める前に。
48時間後、示されているようにPBSで心臓を3回洗浄し、イメージング前に48時間、作りたてのRIMSで心臓を平衡化します。クリアされた心臓の3Dイメージングの場合、まず、3Dプリントされた底部の底部に真空グリースの薄い層を配置し、画像化されるサンプルと同じ高さ。RIMS でリザーバを充填し、すべての気泡を除去するピペットチップを使用します。
慎重に左心室壁を上に向けてRIMSに心臓を置き、溶液に泡が導入されていないのに注意してください。真空グリースを使用して、3Dプリントされたトップリザーバーピースの底面にガラスカバースリップを取り付け、上部のリザーバカバースリップを底の貯水池に下ろし、気泡を避けるように注意してください。その後、グリセロールで上部の貯水池を充填します。
共焦点顕微鏡を使用して、クリアされた心臓を画像化します。3D画像と洗練された心臓組織のクリアリングを組み合わせることで、心臓線維芽細胞の高度な詳細な可視化が可能になります。このイメージング技術を用いて、線維芽細胞は密に詰め込まれ、傷つけていない心臓に紡錘状の形態を有することが観察される。
虚血再灌流傷害後、傷害後最初の3日間は虚血領域で心臓線維芽細胞の喪失が見られる。7日目と14日目までに、線維芽細胞は、負傷した組織領域を再建するために移動または増殖した。28日目までに、心臓の負傷した領域を取り巻く心臓線維芽細胞集団は最大の密度にある。
心筋梗塞損傷の1日半後、負傷した左心室内に残っている線維芽細胞はほとんど残っていません。しかし、3日目までに線維芽細胞は膨張し、左心室のほとんどに存在する。虚血性手術とは対照的に、数週間にわたってアンジオテンシン2とフェノールフリンの注入は、心臓組織の喪失および壁の薄化をもたらさない。
代わりに、線維芽細胞は、組織クリアリングプロトコルに精製されたを使用する場合に見られるように、右手のらせん収縮パターンの軸に沿って整列する。また、アンジオテンシン2とフェノールフリン治療後、虚血再プロフュージョンおよび心筋梗塞損傷のモデルで観察される紡錘形状とは対照的に、線維芽細胞は小さく丸みを帯び現れる。電気泳動クリアは、特に損傷プロトコルを受けた心臓で作業する場合は慎重に行う必要があります。
このプロトコルは、心臓線維芽細胞が生体内の傷害にどのように反応するかを評価するために使用することができる。異なる蛍光マーカーは、心臓が細胞レベルでの傷害にどのように反応するかを理解するためにも使用できます。
完全なトランスクリプトを表示し、数千本の科学動画にアクセス
概要
成体マウスの心臓用の精製組織クリアリング法が開発され、特定の細胞タイプを可視化しながら、バックグラウンドの自己蛍光を最小限に抑えることができます。このプロトコルは、心臓組織の研究のための既存の技術を強化します。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 神経科学
- 心血管生物学
- 組織工学
背景
- 組織クリアリング技術は、密度の高い生物学的組織のイメージングに不可欠です。
- 自己蛍光は、イメージング研究において特定の細胞シグナルを隠す可能性があります。
- 標識された細胞の蛍光を維持することは、正確な分析に重要です。
- 既存の方法は染色を必要とする可能性があり、プロセスを複雑にします。
研究の目的
- 迅速で簡単な組織クリアリングプロトコルを発展させること。
- 心臓組織における線維芽細胞の蛍光の可視化を改善すること。
- 自己蛍光によるバックグラウンド干渉を減少させること。
使用された方法
- マウスの腹面を清掃するために70%エタノールを使用しました。
- 心臓にアクセスするために外科的切開を行いました。
- 新たなクリアリングプロトコルを心臓組織に適用しました。
- 染色せずにmarca蛍光を維持しました。
主な結果
- 新しいプロトコルは密度の高い心臓組織を効果的にクリアしました。
- プロセス中に線維芽細胞の蛍光が保たれました。
- バックグラウンドの自己蛍光が大幅に減少しました。
- この方法により、心臓細胞のより良いin vivoイメージングが可能になります。
結論
- この精製された方法は心臓組織の研究を強化します。
- 心臓損傷反応を調査する研究者にとって貴重なツールを提供します。
- このプロトコルは効率的で、追加の染色の必要性を最小限に抑えます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Understanding cardiac fibroblast dynamics in three dimensions provides critical insights into fibrosis mechanisms that drive ventricular stiffness and heart failure progression. This refined CLARITY-based tissue clearing approach enables high-fidelity, whole-organ visualization of fibroblast behavior without antibody penetration limitations or fluorescence loss, supporting mechanistic de-risking in cardiovascular target validation. The method offers predictive value by revealing spatially resolved fibroblast responses to ischemic and non-ischemic injury models, informing go/no-go decisions in early discovery pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of fibroblast localization and morphology in intact tissue to clarify pathogenic versus reparative roles in cardiac fibrosis.
- Operational Value: Supports functional target validation by linking genetic fibroblast labeling (Tcf21-MerCreMer; Rosa26-loxP-eGFP) to spatial phenotypes in healthy and injured hearts.
- Predictive Confidence: Reveals injury-specific fibroblast patterns—such as aligned bands post-angiotensin II/phenylephrine or repopulation from border zones post-ischemia—to de-risk mechanistic hypotheses.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Produces cleared, fluorescently labeled hearts compatible with confocal imaging for quantitative 3D analysis of fibroblast density, distribution, and morphology.
- Reproducibility: Standardized electrophoresis-based clearing (1.5 amps, 37°C, 1.5 hours) and RIMS equilibration ensure consistent tissue optical properties across experimental groups.
- Scalability: Compatible with multi-sample processing in active electrophoresis chambers, enabling side-by-side comparison of control, ischemic, and hypertensive injury models.
Translational & Preclinical Research
- Disease-Relevant System: Captures fibroblast responses in models mimicking human ischemic injury (reperfusion) and pressure overload (angiotensin II/phenylephrine), aligning with clinical fibrosis phenotypes.
- Translational Continuity: Tracks fibroblast death, border zone repopulation, and density peaks at day 28 post-ischemia—key temporal windows for antifibrotic intervention testing.
- Mechanistic De-risking: Distinguishes pro-fibrotic spindle-shaped fibroblasts in ischemia from small, rounded phenotypes in hypertension, informing target-specific pathway modulation.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing through lead identification, providing spatially resolved phenotypic data that bridges in vitro findings and functional outcomes in preclinical models.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing of fibroblast activation, migration, and proliferation in 3D tissue context, clarifying pathway-level contributions to fibrosis.
- Screening: Generates quantitative imaging outputs (fibroblast density, alignment, morphology) suitable for high-content analysis in compound screening cascades.
- Analytics: Supports morphometric and spatial statistical analysis of fibroblast networks, enabling comparison across genotypes, injuries, and time points.
- Translational Research: Links fibroblast dynamics to ventricular remodeling timelines, supporting biomarker-aligned preclinical validation.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable tissue clearing and imaging platform applicable to multiple cardiovascular disease models and cell types beyond fibroblasts.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in fibroblast function by preserving native tissue architecture and fluorescent signal integrity.
- Operational Value: Eliminates need for sectioning and staining, reducing workflow variability and increasing throughput for 3D phenotyping.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision confidence by revealing on-target fibroblast responses that predict functional outcomes in heart failure models.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of antifibrotic targets based on spatially validated target engagement and phenotypic modulation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in murine cardiac surgery, perfusion fixation, and hydrogel-based tissue clearing techniques.
- Dependent on access to active electrophoresis equipment, confocal microscopy, and RIMS/glycerol mounting solutions.
- Necessitates standardization of clearing duration and temperature to prevent over-clearing or autofluorescence in injured tissue.
- Adaptation to other disease models may require optimization of decolorization time to reduce heme-derived background without quenching GFP signal.
- Practical limitation: Long-term imaging stability depends on proper RIMS equilibration to prevent refractive index mismatch and signal degradation.
