Name: 液体クロマトグラフィーとタンデム質量分析法を用いたサッ カロミセス・セレビシエ の定量的メタボロミクス (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-01-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 25 s
Description: 学ぶLC-MS/MSを用いたSaccharomyces cerevisiaeの定量的メタボロミクス手法。370種類以上の水溶性代謝物を高感度に検出し、最適化されたクエンチングで細胞損傷と代謝物漏出を最小化します。

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ティトレンコ研究所の現在および元メンバーの話し合いに感謝しています。我々は、質量分析の生物学的応用センター、構造機能ゲノム研究センター、および顕微鏡・細胞イメージングセンター(すべてコンコルディア大学)が優れたサービスを提供することを認める。この研究は、カナダの自然科学工学研究評議会(NSERC)(RGPIN 2014-04482およびCRDPJ 515900 - 17)からの助成金によって支えられた。K.Mは、コンコルディア大学アーマンドC.アルシャンボーフェローシップとコンコルディア大学芸術科学学部優秀賞の支援を受けました。

1. 酵母を育てる培地を製造し、殺菌する
<ol><li>完全な酵母エキスの180 mLをバクトペプトン(YP)培地で作ります。完全なYP培地は、1%(w / v)酵母エキスと2%(w / v)バクトペプトンが含まれています。</li>
	<li>180 mLのYP培地を4つの250 mLのエルレンマイヤーフラスコに均等に分配します。これらのフラスコのそれぞれは、YP培地の45 mLを含む。</li>
	<li>15 psi/121 °Cで45分間オートクレーブすることにより、YP培地でフラスコを殺菌します。</li>
</ol>2. 野生型酵母菌株
<ol><li>BY4742(MATα his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0)株を使用します。</li>
</ol>3. 2%グルコースを含むYP培地中の酵母の成長
<ol><li>15 psi/121 °Cで45分間オートクレーブすることにより、グルコースの20%(w/v)ストック溶液を殺菌します。</li>
	<li>45 mLの滅菌されたYP培地を用いて、2つのエルレンマイヤーフラスコのそれぞれにグルコースのオートクレーブ20%(w/v)ストック溶液の5 mLを加えます。YP培地中の最終濃度グルコースは2%(w/v)である。</li>
	<li>2%グルコースを含むYP培地で、酵母細胞を2つのエルレンマイヤーフラスコのそれぞれに接種するために、微生物学的ループを使用してください。</li>
	<li>200rpmに設定した回転シェーカーで、酵母細胞を30°Cで一晩成長させます。</li>
	<li>酵母文化のアリコートを取る。培養のmL当たりの酵母細胞の総数を決定する。ヘモサイトメーターを使用して細胞を数えます。</li>
</ol>4. 細胞への移動と細胞は、2%グルコースを有するYP培地で成長する
<ol><li>殺菌した20%(w/v)ストック溶液の5 mLを、オートクレーブされたYP培地を用いて残りの2つのエルレンマイヤーフラスコのそれぞれに添加する。グルコースの最終的な濃度は2%(w/v)です。</li>
	<li>合計5.0 x107細胞 を含む2%のグルコースを含む2%のグルコースを有するYP培地中の一晩酵母培養物の体積を、2%グルコースを含むYP培地を用いた2つのエルレンマイヤーフラスコのそれぞれに移す。細胞の移動に滅菌ピペットを使用してください。</li>
	<li>200rpmに設定した回転シェーカーで30°Cで酵母細胞を少なくとも24時間(または実験が必要な場合は以上)成長させます。</li>
</ol>5. 試薬の製造、ラボウェアの準備、細胞焼入れ装置の設置
<ol><li>以下を準備する:1)クエンチング溶液(60%高グレード(>99.9%)メタノール155mM重炭酸アンモニウム(ABC)緩衝液、pH = 8.0);2)氷冷ABC溶液(pH = 8.0);3)-20 °Cまで測定することができるデジタル温度計;4)500 mL大遠心分離機ボトル。5)事前に冷却された高速遠心分離機、あらかじめ冷却されたローターと、このローター用の500 mL遠心分離ボトルを-5 °Cで冷却。6)代謝物抽出管(ポリテトラフルオロエチレン裏地付きキャップ付き15 mL高速ガラス遠心管)。7)ドライアイス。</li>
</ol>6. 細胞の焼入れ
<ol><li>血球体を使用して、2%グルコース培養でYPのmL当たりの酵母細胞数を決定します。</li>
	<li>5.0 x 108 細胞の総数を含む2%のグルコースを含むYP培地の培養液の体積を、冷却済みの500 mL遠心分離機ボトルに移します。</li>
	<li>細胞を含む遠心分離器ボトルを200mLの体積まで、-20°Cに保存された消光液で素早く満たします。</li>
	<li>-5 °Cで3分間、11,325 x gの高速遠心分離機でボトルを遠心分離します。</li>
	<li>迅速かつ優しく遠心分離機からボトルを回復します。蓋を緩めて外し、ペレットを邪魔することなく上清を取り除きます。</li>
	<li>10 mLの氷冷ABCバッファーで細胞ペレットを素早く再懸濁し、代謝物抽出用のポリテトラフルオロエチレン裏地付きキャップを備えた15mL高速ガラス遠心管に懸濁液を移管します。</li>
	<li>0°Cで3分間3,000 x gの臨床遠心分離で遠心分離によって細胞を収集します。</li>
	<li>上清を素早く取り除き、ドライアイスにチューブを置いて、代謝物の抽出を開始するか、抽出するまで-80 °Cでチューブを保管します。</li>
</ol>7. 代謝物抽出用の試薬、実験器具、装置の調製
<ol><li>以下を準備します: 1) LC-MSグレードクロロホルム;2)LC-MSグレードメタノール;3)LCグレードナノ純水;4) LC-MSグレード (ACN);5)ガラスビーズ(酸洗浄、425-600 μm);6)リテーナー付きフォームチューブホルダーキット付き渦。7)ポリテトラフルオロエチレン裏地付きキャップ付き15 mL高速ガラス遠心分離管;8)MSバイアル。9)ドライアイス;10)1.5mLチューブをエタノールで1回、ACNで1回、ナノ純水で1回洗浄した。 注:有機溶剤に対して耐性のあるポリプロピレン製のマイクロピペットチップとチューブのみを使用してください。</li>
</ol>8. 代謝物抽出
<ol><li>ドライアイスに保管するか、ステップ6.7から-80°Cのチューブで保存した代謝物に、次の1)2 mLのクロロホルムを-20°Cで保存します。2) -20 °Cで保存されたメタノールの1 mL;3)氷冷ナノ純水の1 mL;4)425-600 μmの酸洗浄ガラスビーズの200 μL。</li>
	<li>チューブの口をアルミホイルで覆い、閉じます。リテーナーと渦を持つフォームチューブホルダーキットにチューブを置き、中速で30分間(すなわち、6に設定された速度で、12は渦の最高速度)4°Cで、代謝物の抽出を容易にします。</li>
	<li>チューブを氷上で15分間インキュベートし(ドライアイスではありません!)、タンパク質の沈殿と下側の有機相からの上水域の分離を促進します。</li>
	<li>4°Cで10分間3,000 x gの臨床遠心分離機でチューブを遠心分離します。 この遠心分離ステップは、上層水相(水溶性代謝物を含む)を中間層(細胞の破片およびタンパク質を含む)および下の有機相(主に脂質を含む)から分離することを可能にする。</li>
	<li>マイクロピペットを使用して、上の水相(400 μL)を洗浄し、-20°Cで保存した800 μLのACNを含む1.5mLチューブに転写します。 注:ACNに上水相を加えた後、白雲の降水量が-20°Cに保たれています。</li>
	<li>サンプルをテーブル上の遠心分離機で13,400 x gで4°Cで10分間遠心します。 注:遠心分離後、白雲の降水量は消えます。</li>
	<li>チューブ内の液体の上部からラベル付きMSバイアルに800 μLを移します。LC-MS/MSで分析されるまで0°Cで保存してください。</li>
</ol>9. LC用試薬・ラボウェア・装置の製造
<ol><li>以下を準備します: 1) 渦。2)超音波超音波処理器。3)MSガラスバイアル。4)バイナリポンプ、脱ガッサー、およびオートサンプラーを装備したLCシステム。5) ジウテリオニック相クロマトグラフィーカラム(5 μmポリマー、150 x 2.1 mm)を 材料表に記載。6)カラムヒーター。7)移動相、相A(5:95 ACN:水(v/v)20 mM酢酸アンモニウム、pH = 8.0)および相B(100%ACN)を含む。</li>
</ol>10. LCによる抽出された代謝物の分離
<ol><li>MSバイアルの内容を15分間超音波処理します。</li>
	<li>室温(RT)で10秒間MSバイアル3倍を渦。</li>
	<li>MSバイアルをウェルプレートに入れなさい。</li>
	<li>クロマトグラフ中は、カラムを45 °C、流量0.250 mL/minに保ちます。試料は、0°Cのウェルプレートに保管してください。 クロマトグラフィーで使用する必要がある LC 勾配については、 表 1 を参照してください。 注:野生型株BY4742の細胞から抽出した水溶性代謝物の代表的な全イオンクロマトグラムを 図1に示す。LCによって分離された代謝産物を同定し、ステップ11について説明したように、正イオン化[ESI(+)]モードで行った質量分析によって定量化した。</li>
</ol>11. LCによって分離された代謝物の質量分析
<ol><li>LCで分離された水溶性代謝物の同定と定量のために、加熱エレクトロスプレーイオン化(HESI)を備えた質量分析計を使用してください。MS1イオン用の質量分析計とMS2イオン用の質量分析計の検出器を使用します。 MS1およびMS2 イオンのデータ依存的な取得については、表2および 表3 に示す設定を使用します。</li>
	<li>ESI(+)モードとESI(-)モードの両方で、注入には10 μLのサンプルボリュームを使用します。</li>
</ol>12. LC-MS/MSからの生データ処理による異なる代謝物の同定と定量
<ol><li>材料表に記載されているソフトウェアを使用して、生の LC-MS/MS ファイルから異なる水溶性代謝物の同定と定量を行います。このソフトウェアは、代謝物の定量にMS1、代謝物の同定にMS2を使用します。ソフトウェアは、最も広範囲にキュレーション質量スペクトル断片化ライブラリを利用して、MSスペクトルを一致させることによってLC-MS/MS生データを使用して代謝物にアナティケートします。このソフトウェアはまた、オンラインデータベースを使用して代謝物にアナプトするためにMS1と同位体パターンマッチの正確な質量を使用しています。詳細については、図 2を参照してください。</li>
	<li>オンラインで自由に利用できるデータベースとスペクトルのライブラリ(https://www.mzcloud.org)を使用して、生データのMS2スペクトルを検索します。</li>
</ol>13. ヨウ化プロピジウム(PI)染色法および蛍光顕微鏡による膜完全性測定
<ol><li>ステップ6について説明したように細胞の焼入れを行った後、焼入れ細胞を15mLのABCバッファーで十分に洗浄し、焼入れ溶液を除去する。0°Cで5分間3,000xgで遠心分離して細胞を採取する。</li>
	<li>ABCバッファーの1 mLで細胞ペレットを再懸濁し、PI溶液(0.5 mg/mL)の0.5 mLを加えます。</li>
	<li>10 sのサンプル3xでチューブをボルテックスし、暗闇と氷の上で10分間インキュベートします。</li>
	<li>サンプルをテーブル上の遠心分離機で13,400 x gで4°Cで10分間遠心します。</li>
	<li>上清を取り除き、ABCバッファーの1mLでペレットを再懸濁します。</li>
	<li>チューブを13,400 x gで4°Cで10分間遠心し、上清を取り除く。この手順をさらに 2 回繰り返して、セル表面にバインドされた PI を削除します。</li>
	<li>ABCバッファーの300 μLでペレットを再懸濁します。10 μLのサスペンションを顕微鏡スライドの表面に置きます。</li>
	<li>微分干渉コントラスト(DIC)と蛍光顕微鏡画像を蛍光顕微鏡で撮影します。励起波長と発光波長が593nmと636nm(それぞれ)に設定されたフィルタを使用します。</li>
	<li>ソフトウェアを使用して、総細胞数(DICモード)と蛍光染色細胞数をカウントします。また、このソフトウェアを使用して、個々の細胞の染色の強度を決定します。</li>
</ol>

著者らは、競合する財政的利益はないと宣言している。

ここで説明するプロトコルを正常に使用するには、以下に説明する予防措置に従ってください。クロロホルムとメタノールは、実験室のプラスチック製品から様々な物質を抽出します。したがって、慎重にそれらを処理します。これら2つの有機溶剤と接触するステップでのプラスチックの使用を避けてください。これらのステップには、ホウケイ酸ガラスピペットを使用してください。使用前にクロロホルムとメタノールでこれらのピペットを上げます。有機溶剤に対して耐性のあるポリプロピレン製のマイクロピペットチップとチューブのみを使用してください。LC-MS/MSのサンプル調製中に、ウェルプレートに挿入する前に、ガラスバイアル内のすべての気泡を除去します。
ここで使用されるzwitterionic相カラムは、RTシフトを最小限に抑えるために、各実行後に大規模な再コンディショニングを必要とします。列の再調整では、列の約 20 ボリュームである再調整ソリューションのボリュームを使用することをお勧めします。列は、0.4 mL/minの増加流量で15分間、初期移動相で再調整する必要があります。再コンディショニング中にカラムが損傷しな...

水溶性代謝産物は、低分子の中間体であり、必須の細胞プロセスに寄与する代謝産物です。これらの進化的に保存されたプロセスには、栄養素の使用可能エネルギーへの変換、高分子の合成、細胞増殖およびシグナル伝達、細胞周期制御、遺伝子発現調節、ストレス応答、代謝の翻訳後調節、ミトコンドリア機能の維持、静脈細胞密売、オートファジー、細胞老化、および調節細胞死1、2、3が含まれる。
水溶性代謝産物のこれらの本質的な役割の多くは、出芽酵母S.cerevisiae1、3、4、7、9、14、15、16、17、18、19、20、21、22の研究によって発見されています。この単細胞真核生物は、高度な生化学的、遺伝的、および分子生物学的解析23、24、25、26へのアメナビリティによる細胞プロセスに水溶性代謝物が寄与する解剖機構を解剖するための有用なモデル生物である。非標的メタボロミクスのLC-MS法は、出芽酵母3、18、22、27における水溶性代謝産物の役割を研究するために使用されてきたが、この種の分析では、その汎用性、堅牢性、感度、およびこれらの代謝産物の異なる構造異性体と立体異性体形態を区別する能力の向上が必要である。
近年、非標的メタボロミクスのLC-MS/MS法を生体内の水溶性代謝産物のプロファイリングに適用する際の大きな進歩が顕著である。しかし、この方法論を使用する上での多くの課題は、2、28、29、30、31、32、33、34、35、36のままです。これらの課題には、次のようなものがあります。まず、多くの水溶性代謝産物の細胞内濃度が、現在使用されている方法に対する感受性の閾値を下回る。第二に、代謝活性の改善の効率が低すぎると、細胞内代謝産物の焼入れ関連細胞漏出の程度は、現在の方法では高すぎる。したがって、現在使用されている水溶性代謝産物の細胞内濃度を過小評価する方法。第三に、既存の方法では、特定の代謝物の構造異性体(すなわち、同じ化学式を持つ分子が原子結合性が異なる分子)や立体異性体(すなわち、同じ化学式と原子結合性を有する分子)を区別することはできません。これにより、現在使用されているメソッドによる特定の代謝物の正しい注釈がなくなります。第4に、親イオン(MS1)と二次イオン(MS2)の既存の質量スペクトルオンラインデータベースは不完全です。これは、現在のメソッドの助けを借りて生成された未加工の LC-MS/MS データを使用して、特定の代謝産物の正しい識別と定量に影響します。第五に、既存の方法は、水溶性代謝産物のすべてのまたはほとんどのクラスを回復するために単一のタイプの代謝産物抽出を使用することはできません。第六に、既存の方法は、水溶性代謝産物の全てのクラスまたはほとんどのクラスを互いに分離するために、単一のタイプのLCカラムを使用することはできません。
ここでは 、S.セレビシエ 細胞内の代謝活性を改善し、抽出前にこれらの細胞内の水溶性代謝産物の大部分を維持し、酵母細胞からほとんどのクラスの水溶性代謝産物を抽出するための条件を最適化した。我々は 、S.セレビシエ 細胞から抽出された370以上の水溶性代謝産物のLC-MS/MSベースの同定と定量のための汎用性、堅牢で高感度な方法を開発しました。非標的化メタボロミクスのこの方法は、種々のエネルギーキャリア分子、ヌクレオチド、アミノ酸、単糖、解糖の中間体、および三カルボン酸サイクル中間体の細胞内濃度を評価することを可能にする。開発されたLC-MS/MS法により、多様な構造、物理的、化学的特性を有する水溶性代謝産物の異なる構造異性体および立体異性体の同定と定量化が可能です。

<table><tbody><tr><td>Chemicals</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>アセトニトリル</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック<td>A9554</td><td></td></tr>酢<tr><td>酸アンモニウム</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>A11450</td><td></td></tr>重<tr><td>炭酸アンモニウム</td><td>シグマ</td><td>9830</td><td></td></tr>バ<tr><td>クトペプトン</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック<td>BP1420-2</td><td></td></tr>クロ<tr><td>ロホル</td><td>ムフィッシャーサイエンティフィック</td><td>C297-4</td><td></td></tr><tr><td>グルコース</td>フィ<td>ッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>D16-10</td><td></td></tr><tr><td>L-ヒスチジン</td><td>シグマ</td><td>H8125</td><td></td></tr><tr><td>L-ロイシン</td><td>シグマ</td><td>L8912</td><td></td></tr><tr><td>L-リジン</td><td>シグマ</td><td>L5501</td><td></td></tr><tr><td>メタノール</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>A4564</td><td></td></tr> メタ<tr><td>ノール</td>フィ<td>ッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>A4564</td><td></td></tr><tr><td>ヨウ化プロピジウム</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td>R37108</td><td></td></tr><tr><td>ウラシル</td><td>シグマ</td><td>U0750</td><td></td></tr><tr><td>酵母抽出物</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP1422-2</td><td></td></tr><tr><td>ハードウェア 機器</ストロング></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>500 ml 遠心分離ボトル</td><td>ベックマン</td><td>355664</td><td></td></tr><tr><td>アジレント 1100 シリーズ LC システム</td><td>Agilent Technologies</td><td>G1312A</td><td></td></tr><tr><td>ベックマン・コールター遠心分離機</td><td>ベックマン</td><td>6254249</td><td></td></tr><tr><td>ベックマン・コールター遠心分離機ローター</td><td>ベックマン</td><td>JA-10</td><td></td></tr><tr><td>Centra CL2 臨床遠心分離機</td><td>Thermo Scientific</td><td>004260F</td><td></td></tr><tr><td>デジタル温度計</td><td>オメガ</td><td>HH509</td><td></td></tr><tr><td>フォームチューブホルダーキット リテーナー</td><td>サーモ付きScientific</td><td>02-215-388</td><td></td></tr><tr><td>SeQuant ZIC-pHILIC 双性イオン相カラム (5&micro;m ポリマー 150 x 2.1 mm)</td><td>Sigma Milipore</td><td>150460</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Orbitrap Velos MS</td><td>Fisher Scientific</td><td>ETD-10600</td><td></td></tr><tr><td>超音波超音波装置</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>15337416</td><td></td></tr><tr><td>ボルテック</td>ス <td>フィッシャー サイエンティフィ</td>ック <td>2215365</td><td></td></tr><tr><td>ZORBAX Bonus-RP, 80&Aring;, 2.1 x 150 mm, 5 & マイクロ;m</td><td>Agilent Technologies</td><td>883725-901</td><td></td></tr><tr><td>Laboratory materials</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2 mL ガラスサンプルバイアル、テフロンライニングキャップ付き</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>60180A-SV9-1P</td><td></td></tr><tr><td>ガラスビーズ (酸洗浄、425-600 &mu;m)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8772</td><td></td></tr><tr><td>血球計算盤</td><td>Fisher Scientific</td><td>267110</td><td></td></tr><tr><td>15 mL テフロンライニングキャップ付き高速ガラス遠心チューブ</td><td>PYREX</td><td>05-550<</td><td></td></tr><tr><td>strong>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Compound Discoverer 3.1</td><td>Fisher Scientific</td><td>V3.1</td><td></td></tr><tr><td>酵母株</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>酵母株BY4742</td><td>ダルマコン</td><td>YSC1049</td><td></td></tr></tbody></table>

液体クロマトグラフィーとタンデム質量分析法を用いたサッ カロミセス・セレビシエ の定量的メタボロミクス

Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

メタボロミクスは、細胞、組織、臓器、生体、または生物内の多くの低分子中間体および代謝産物の同定と定量に使用される方法論である。メタボロミクスは伝統的に水溶性代謝産物に焦点を当てています。水溶性のメタボロメは、様々なゲノム、エピゲノム、トランスクリプトーム、プロテオミクス、および環境因子を統合する複雑な細胞ネットワークの最終生成物です。したがって、メタボロミック分析は、様々な生物内の生物学的プロセスの多くのこれらの要因の作用の結果を直接評価する。これらの生物の一つは、出芽酵母 サッカロミセスセレビシエ、完全に配列されたゲノムを持つ単細胞真核生物です。 S.cerevisiae は包括的な分子解析に適しているため、真核細胞内の多くの生物学的プロセスの根底にあるメカニズムを解剖するモデルとして使用されています。水溶性のメタボロムの堅牢で、敏感で、正確な定量的評価のための多目的な分析方法は、これらのメカニズムを解剖するための不可欠な方法論を提供するであろう。ここでは 、S.セレビシエ 細胞からの代謝活性の活性化および水溶性代謝産物抽出の最適化条件に関するプロトコルを提示する。このプロトコルはまた、抽出された水溶性代謝産物の定量分析のためのタンデム質量分析(LC-MS/MS)と結合された液体クロマトグラフィーの使用を記述する。ここで説明する非標的メタボロミクスのLC-MS/MS法は、汎用性と堅牢性があります。それはこれらの代謝物の異なった構造異性体および立体異性体形態を含む多様な構造、物理的、および化学的特性を有する370以上の水溶性代謝産物の識別そして定量化を可能にする。これらの代謝産物は、種々のエネルギー担体分子、ヌクレオチド、アミノ酸、単糖類、解糖の中間体、および三カルボン酸サイクル中間体を含む。LC-MS/MS法は、非標的メタボロミクスの感度が高く、0.05 pmol/μLの低濃度で水溶性代謝物の同定と定量を可能にします。この方法は、異なる条件下で培養した野生型および変異酵母細胞の水溶性メタボロメの評価に成功して使用されている。

酵母細胞内の水溶性代謝産物の定量的評価を改善するために、代謝産物検出のための細胞焼入れ条件を最適化した。この目的のための細胞の焼入れは、細胞31、33、37、38内のすべての酵素反応の迅速な逮捕を伴う。このような細胞代謝活性の停止は、生体内の水溶性代謝産物の定量に必要な方法の不可欠な工程であり、それらの細胞内濃度31、33、37、38の過少推定を防ぐので、代謝産物評価のための細胞の焼入れは、常に、細胞膜(PM)(および細胞壁(CW)の完全性を損なう...

我々は、酵母 サッカロミセスセレビシエにおける水溶性代謝産物の主要クラスの同定と定量のためのプロトコルを提示する。記載された方法は、汎用性、堅牢性、および高感度です。これは、構造異性体と水溶性代謝物の立体異性体の分離を可能にします。

Metabolomics is a methodology used for the identification and quantification of many low-molecular-weight intermediates and products of metabolism within ...

このプロトコルは、高い特異性、高感度を有し、また異性体、同種、親水性、疎水性分子を含む代謝産物の多くの異なるクラスをプロファイルすることができるので、現在使用されている酵母メタボロミクスよりも多くの利点を有する。このプロトコルで使用されるクエンチ法は、細胞からの代謝産物の漏出を著しく減少させながら、すべての酵素反応を停止します。このプロトコルで構築された MS1 ライブラリは、さまざまな MS2 実行から実行されます。摂氏30度および1分間に200回転で一晩培養した後、1ミリリットルの培養で酵母細胞の数を決定し、フラスコ当たり45ミリリットルのオートクレーブYP培地を含む2つのエルレンマイヤーフラスコのそれぞれに5ミリリットルの殺菌された20%ストック溶液のグルコースを加える。滅菌転移ピペットを使用して、各フラスコに7番目の酵母細胞に10倍を加え、1分間に200回転で摂氏30度で少なくとも24時間酵母細胞を成長させます。代謝産物抽出の場合、培養後、遠心分離により酵母細胞を採取し、上清を素早く除去する。チューブをドライアイスに置き、マイナス20度のクロロホルム2ミリリットル、マイナス20度メタノールの1ミリリットル、氷冷ナノ純水1ミリリットル、425〜600ミクロンの酸洗浄ガラスビーズ200マイクロリットルを細胞に加えます。ビーズを添加したら、アルミ箔で覆われたチューブをリテーナー付きのフォームチューブホルダーキットに入れ、サンプルを4°Cで中速で30分間渦を出して代謝物の抽出を容易にします。次に、サンプルを遠心分離する前にチューブを氷上で15分間インキュベートし、上部水相を中デブリおよびタンパク質および低有機相から分離できるようにします。マイクロピペットを使用して、上水相の約400マイクロリットルを洗浄し、マイナス20°Cのアセトニトリルの800マイクロリットルを含む1.5ミリリットルチューブにラベル付けします。次いで、サンプルを遠心分離し、上清の上部の800マイクロリットルを、液体クロマトグラフィータンデム質量分析までゼロ度保存用の標識質量分析バイアルに移します。抽出した代謝物を分離するには、サンプルバイアルを15分間超音波処理し、続いて室温で3つの10秒渦を超音波処理します。ボルテックスの後、バイアルを液体クロマトグラファーのウェルプレートに入れ、1分あたり0.25ミリリットルの流量でカラムを摂氏45度に、ウェルプレートを摂氏ゼロ度に設定します。次に、この表を使用して、分析用の液体クロマトグラフィー勾配を設定します。分離後、水溶性代謝物を同定し定量するために、加熱されたエレクトロスプレーイオン化を備えた質量分析計で、エレクトロスプレーイオン化正および負の両方のモードで10マイクロリットルのサンプルの注入を使用します。解析の最後に、適切な化合物分析ソフトウェアプログラムで生データを開き、質量スペクトルを一致させるために質量スペクトルを利用して、分析で特定された代謝産物にアポイントを付けます。MS1 と同位体パターンの正確な質量を識別して、オンライン データベースを使用して代謝物の注釈を可能にすることもできます。次に、データベースとスペクトルのライブラリを使用して、生データの MS2 スペクトルを検索します。翌日、酵母細胞を焼入れた後、15ミリリットルのABCバッファーで細胞を十分に洗浄し、遠心分離によって細胞を採取する。新鮮なABCバッファーの1ミリリットルにペレットを再懸濁し、500マイクロリットルのヨウ化プロピジウム溶液を細胞に加える。1渦あたり10秒間、サンプルを3回渦を起こして、光から保護された氷の上で細胞を10分間インキュベートする。インキュベーションの終了時に、遠心分離によって細胞を採取し、1回の洗浄につき1ミリリットルの新鮮なABCバッファーで細胞を3回洗浄します。最後の洗浄後、新鮮なABCバッファーの300マイクロリットルにペレットを再懸濁し、得られた細胞懸濁液の10マイクロリットルを顕微鏡スライドに加えます。蛍光顕微鏡を使用して、593ナノメートルの励起波長と636ナノメートルの発光波長に設定されたフィルターを使用して、細胞の差動干渉コントラストと蛍光顕微鏡画像をキャプチャします。次に、適切な画像解析プログラムを使用して、明視野画像および蛍光画像における細胞の総細胞数をカウントし、個々の細胞の染色の蛍光強度を決定します。改変細胞焼入法は、マイナス40°Cの焼入れ法で非緩衝化80%メタノールよりも、細胞膜および細胞壁への損傷を著しく低くする。実際、改変法を用いて焼入れを行った細胞のほとんどすべてが、赤い蛍光発光を示し、これは、細胞膜および細胞壁が損傷していない酵母細胞の特徴である。これに対し、40°C法で非緩衝化80%メタノールを用いて焼入を行った細胞のほとんどすべてが、緑色の蛍光発光を示し、これは、細胞膜および細胞壁が著しく損傷している酵母細胞の特徴である。改変細胞焼入法はまた、マイナス40°Cの除菌法で非緩衝化80%メタノールよりも酵母細胞からの水溶性代謝物の漏出を著しく低くする。水溶性代謝産物標準の保持時間シフト値は有意に低く、ピーク形状は逆相カラムと比較してジウテリオニック相カラムに対して実質的に鋭い。液体クロマトグラフィータンデム質量分析法のもう1つの利点は、ジウィッテリオニック相カラムを使用して、多様な構造、物理的、化学的特性を持つ異なる水溶性代謝産物を効率的に分離できることです。暗闇の中に立ってヨウ化プロピジウムを行うことを確認し、また、中間相を乱さない間、上の段階を収集することを確認してください。MS2 スペクトル ライブラリがないためにどの MSP にも注意を付けることができない場合は、NMR を使用してこの構造を説明します。

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液体クロマトグラフィーとタンデム質量分析法を用いたサッカロミセス・セレビシエの定量的メタボロミクス

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