Name: ショウジョウバエ細胞におけるイン核Hi-C (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 58 s
Description: 学ぶショウジョウバエ細胞における高解像度イン核Hi-Cプロトコル。クロマチン相互作用を正確にプロファイリングし、TAD境界における遺伝子発現制御メカニズムを解明する強力な手法です。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

この研究は、UNAM技術イノベーション研究支援プログラム(PAPIIT)助成金番号IN207319と科学技術国家評議会(CONACyT-FORDECyT)助成金番号303068によって支援されました。A.E.-L.科学技術国家評議会(CONACyT)CVU番号968128によってサポートされている修士課程の学生です。

1. 固定
<ol><li>1000万のシュナイダーのライン2プラス(S2R+)細胞から始め、室温(RT)で10%のウシ胎児血清(FBS)を含むシュナイダー培地で17.5mLの細胞懸濁液を調製する。</li>
	<li>メタノールフリーホルムアルデヒドを添加し、2%の最終濃度を得る。RTで10分間混ぜてインキュベートし、毎分混ぜるように注意してください。 注意:ホルムアルデヒドは有害な化学物質です。適切な安全衛生規則に従い、ヒュームフードで作業してください。</li>
	<li>グリシンを加えて反応を焼き付け、0.125Mの最終濃度を達成し、混合する。RTで5分間インキュベートし、氷の上で15分間インキュベートします。</li>
	<li>遠心分離機 400 × G RT で 5 分間、4 °C で 10 分間;上清を捨てる25 mLの冷たいリン酸緩衝生理食塩分でペレットを慎重に再懸濁します。</li>
	<li>400×gで400gで4°Cで10分間遠心し、上清を捨てます。 注: プロトコルを続行する場合は、手順 2.1 に進み、lysis を使用します。それ以外の場合は、ペレットを液体N2 にフラッシュフリーズし、ペレットを-80°Cに保存します。</li>
</ol>2. リシス
<ol><li>氷冷ライシスバッファー(10 mM Tris-HCl、pH 8;非イオン界面活性剤の0.2%)( 材料表参照)、10 mM NaCl;1xプロテアーゼ阻害剤)の1mLで細胞を再懸濁し、氷冷ライシスバッファーで体積を10 mLに調整します。106 細胞/mLの1×の濃度を得るためにボリュームを調整します。氷の上で30分間インキュベートし、チューブを反転して2分ごとに混合します。</li>
	<li>4°Cで5分間300×gで核を遠心し、上清を慎重に捨てます。ペレット1xを1mLの冷たいリシスバッファーで洗浄し、マイクロ遠心チューブに移します。ペレット1xを1mLの冷たい1.25x制限バッファーで洗浄し、各細胞ペレットを360 μLの1.25x制限バッファーに再懸濁します。</li>
	<li>1管当たり10%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)11μL(最終濃度0.3%)を加え、ピペット処理で慎重に混合し、37°Cで45分間インキュベートし、700-950rpmで振ります。インキュベーション中に数回塊を破壊するために上下にピペット。</li>
	<li>非イオン性界面活性剤(10%溶液、材料表を参照)をチューブあたり75μL(10%溶液、 材料表を参照)を加えてSDSをクエンチし、37°Cで45分間インキュベートし、950rpmで振る。インキュベーション中に塊を混乱させるために数回上下にピペット。 注:束が大きく、破壊しにくい場合は、SDSおよび界面活性剤の処理中に回転速度を400rpmに下げます。塊がピペット処理によって分解しにくい場合は、サンプルを2つに分割します。制限バッファー、SDS、および界面活性剤の量を調整する。透過処理を進めます。次に、最小速度(200×g)で核を回転させ、上清を慎重に捨て、サンプルを1X制限バッファに一緒にプールし、消化を進めます。未消化サンプル(UD)として10μLアリコートを取る。</li>
</ol>3. 酵素消化
<ol><li>1チューブ当たりMbo Iの200単位(U)を加えてクロマチンを消化し、回転しながら4時間から一晩(950rpm)の範囲の37°Cでインキュベートします。</li>
	<li>翌日、チューブあたりMbo Iを50U追加し、回転しながら2時間37°Cでインキュベートします(950 rpm)。</li>
	<li>60°Cで20分間チューブをインキュベートすることにより酵素を不活性化する。チューブを氷の上に置きます。 注:10 μL アリコートを消化サンプルとして取ります (D)。</li>
</ol>4. DNAのビオチン化終了
<ol><li>制限フラグメントのオーバーハングを埋め、DNAの端にビオチンを付けるには、10 mM dCTPをそれぞれ1.5 μL追加し、 dGTP、dTTP、0.4 mMビオチンdATPの20 μL、トリス低EDTA(TLE)バッファーの17.5 μL[10 mM Tris-HCl、0.1 mM EDTA、pH 8.0]、および10 μLの5 U/μLの5 U/μLの全ての断片に断片する。慎重に混ぜ、37°Cで75分間インキュベートします。 30 sの場合は10 sごとに700 rpmで振ります。ライゲーションミックスを準備しながら、氷の上にすべてのチューブを置きます。</li>
</ol>5. ライゲーション
<ol><li>各消化クロマチン混合物を、ライゲーションミックス(10xライゲーションバッファーの100 μL、10 mg/mLのウシ血清アルブミンの10 μL、T4 DNAリガーゼの15 U、および425 μLの二重蒸留水[ddH2O])に移します。穏やかなピペットで十分に混ぜ、16°Cで一晩インキュベートします。</li>
</ol>6. 架橋反転とDNA精製
<ol><li>1管あたり50mg/mLプロテイナーゼKを50μL加えてタンパク質を分解し、37°Cで2時間インキュベートします。温度を65°Cに上げることで逆クロスリンクし、一晩インキュベートします。</li>
	<li>10 mg/mL RNase Aの20 μLを加えてRNAを分解し、37°Cで1時間インキュベートします。</li>
	<li>フェノール:クロロホルム抽出を行い、その後エタノール沈殿を行います。<ol>
<li>1体積のフェノールクロロホルムを加え、反転によって十分に混ぜ合わせて均質な白相を得る。 注:フェノールは有害な化学物質です。適切な安全衛生規則に従ってください。ヒュームフードで作業します。</li>
		<li>15,000×gで遠心分離機を15分間使用します。水相を新しい2 mLマイクロ遠心チューブに移します。TLEバッファの100 μLで下層のバック抽出を行い、水相を同じ2 mLチューブに移します。</li>
		<li>100%エチルアルコール(EtOH)の2体積、酢酸ナトリウム3Mの0.1容量、20mg/mLグリコーゲンの2μLを加えることによってDNAを沈殿させます。2時間から一晩の範囲の期間-20°Cでインキュベートする。</li>
		<li>4°Cで30分間15,000×gで回転し、氷冷70%EtOHでペレット2倍を洗います。 RTでペレットを乾燥させ、TLEバッファの100 μLで再懸濁します。メーカーの指示に従ってDNAと蛍光計に選択的に結合する蛍光色素を用いてDNAを定量化する(材料表)。 注: プロトコルはここで一時停止することができます。ライゲーション製品は、4 °C(短期)または-20°Cで長期間保存します。品質管理のために、合字サンプル(L)として材料のアリコート(100 ng)を使用してください。</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. Hi-C テンプレートの品質を評価する
<ol><li>消化および結紮の定性的制御<ol>
<li>架橋を反転させることでUDおよびDアリコートからDNAを精製し、フェノール:クロロホルム抽出およびエタノール沈殿を上述のように行う。</li>
		<li>1.5%アガロースゲルにUD、D、およびLサンプルの100 ngをロードします。Dサンプルの約500bpを中心としたスミアとLサンプルの高分子量バンドを探します(代表的な結果を参照)。</li>
	</ol>
</li>
	<li>消化効率定量制御 注: 消化効率をより正確に評価するには、UD および D サンプルをテンプレートとして使用し、次のように設計されたプライマーを使用して定量的ポリメラーゼ連鎖反応 (qPCR) を実行します。<ol>
<li>消化に使用される酵素のDNA制限部位を含むDNA断片を増幅するプライマーペア(本プロトコルではMbo I)を、ステップ7.2.3の式でRと呼ぶ。</li>
		<li>消化に使用される酵素の制限部位を含まない制御DNA断片を増幅するプライマーペアを設計する(本プロトコルのMbo I)、ステップ7.2.3の式でCと呼ばれる。</li>
		<li>増幅のサイクル閾値(Ct値)を使用して、以下の式に従って制限効率を計算します。 % 制限 = 100 - 100/2{(CtR - CtC)D - (CtR - CtC)UD} ここでCtRはフラグメントRのCt値を指し、CtCはサンプルDおよびサンプルUDのフラグメントCのCt値を指す。 注:制限率は、制限DNA部位を含まないコントロール(C)DNA断片と比較して制限酵素が制限(R)DNA断片を切断する効率を反映している。80%≥の制限効率が推奨されます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>既知の相互作用の検出<ol>
<li>PCRを実行して内部ライゲーションコントロールを増幅し、短距離および/または中距離または長期相互作用を調べます(代表的な結果を参照)。</li>
		<li>あるいは、プライマーが隣接する制限フラグメントにおいて前方または逆方向にあるライゲーション生成物を増幅する設計プライマー。</li>
	</ol>
</li>
	<li>充填およびビオチン標識制御<ol>
<li>上述したように、ゲノム中の隣接する制限断片間の既知の相互作用またはライゲーション産物の増幅および消化によってHi-Cマーキングおよびライゲーション効率を検証する。 注:Mbo Iサイト(GATC)の正常な充填およびライゲーションは、結紮接合部で制限酵素Cla I(ATCGAT)の新しい部位を生成し、Mbo Iサイトを再生します。</li>
		<li>PCR産物を Mbo I、Cla I、またはその両方で消化します。サンプルを1.5〜2%ゲルで実行した後、カットバンドとノーカットバンド26の強度を定量することにより、3CおよびHi-Cライゲーション接合部の相対数を推定する。 注:70%>の効率が望まれます(代表的な結果を参照)。</li>
	</ol>
</li>
</ol>8. 超音波処理
<ol><li>サンプルを超音波処理して200-500 bp DNA断片を得る。このプロトコルで使用される装置(材料表を参照)については、サンプル(5~10 μg)を1管当たりdH2Oの130 μLで希釈し、400 bp:充填レベルに超音波処理するように装置を設定します。関税係数: 10% ;ピークインシデント電力(w):140;バーストあたりのサイクル数: 200;時間(s):80。</li>
</ol>9. ビオチン除去/終了修復
注:以下に示すステップは、Hi-C DNAの5 μgに合わせて調整されています。
<ol><li>ビオチン除去を行うために、サンプル(130 μL)を新しいマイクロ遠心分離管に移します。10xライゲーションバッファーの16 μL、10 mM dATP の 2 μL、T4 DNA ポリメラーゼの 5 μL (15U)、および 7 μL の ddH2O (全容量の 160 μL) を加えます。20°Cで30分間インキュベートします。</li>
	<li>10 mM dNTPs 5 μL、10xライゲーションバッファー4 μL、T4ポリヌクレオチドキナーゼ5 μL(10 U/μL)、クレノウ1 μL、および25 μLのddH2O(総体積200μL)を加えます。20°Cで30分間インキュベートします。</li>
</ol>10. サイズの選択
<ol><li>主に250-550 bpサイズの範囲の断片を選択するには、最初に0.6xで順次固相可逆固定化(SPRI)サイズ選択を行い、次いでメーカーの指示に従って0.90倍を選択し、100 μLのTLEを使用してDNAを溶出させます。</li>
</ol>11. ビオチンプルダウン/Aテーリング/アダプターライゲーション
注:磁性ビーズを渦で再懸濁して、回転ホイールでサンプルを3分間回転させてから、サンプルを短時間回転させて磁気スタンドに置きます。ビーズを磁石に貼り付け、上澄み物を捨て、次の洗浄工程を進めます。回転ホイールの代わりに回転するサーモブロックで55°Cでの打ち付けを行います。
<ol><li>TLEを使用して、最終ボリュームをサンプルあたり300 μLに設定します。ビーズ洗浄バッファーを準備する:1xトゥイーンバッファー(TB)(TB:5 mMトリスHCl pH 8.0、 0.5 mM EDTA, 1 M NaCl, 0.05% トゥイーン), 0.5x TB, 1x No-Tween バッファー (NTB) (5 mM トリス HCl pH 8.0, 0.5 mM EDTA, 1 M NaCl), 2x NTB.</li>
	<li>ストレプトアビジンにリンクされた磁気ビーズをライブラリごとに150 μL( 材料表を参照)を使用します。ビーズ2xを400μLの1tbで洗います。その後、ビーズを300 μL 2x NTBで再懸濁します。</li>
	<li>ビーズを300 μL Hi-C材料と混合し、回転ホイールでRTで30分間インキュベートし、ビオチンがストレプトアビジンビーズに結合できるようにします。</li>
	<li>400 μLの0.5x TBでビーズを洗浄し、55°Cで3分間インキュベートし、750 rpmで回転します。1x制限バッファーの200 μLでビーズを洗浄します。</li>
	<li>ビーズを100 μLのdATPテーリングミックス(5 μLの10 mM dATP、10x制限バッファの10 μL、クレノウエキソ-5 μL、ddH2Oの80 μL)で再懸濁します。37°Cで30分間インキュベートします。</li>
	<li>上清を取り除き、55°Cで3分間インキュベートし、750rpmで回転させることで、ビーズ2xを0.5x TBの400 μLで洗浄します。</li>
	<li>1x NTBの400 μLでビーズを洗浄し、1xライゲーションバッファーを100 μLで洗浄します。</li>
	<li>ビーズを50 μLの1xライゲーションバッファーに再懸濁し、懸濁液を新しいチューブに移します。4 μL のプレアニール型 PE アダプター (15 μM ストック) と 2 μL の T4 リガーゼ (400 U/μL、すなわち 800 U/チューブ) を追加します。RTで2時間インキュベートする。 注: PE 1.0 および PE 2.0 アダプタ (30 μM ストック) の両方の等量を追加し、RT で 10 分間インキュベートすることでアダプタを事前アニールします( 資料表を参照)。</li>
	<li>上清を取り除き、400 μLのTBでビーズを2倍洗ってビーズを取り戻します。1x NTBの200 μLでビーズを洗浄し、1x制限バッファを100 μLで洗浄し、ビーズを40 μLの1x制限バッファで再中断します。</li>
</ol>12. PCR増幅
<ol><li>25 μL ボリュームの PCR を 5、6、7、8 サイクルで設定します。PCR ごとに、次の方法を使用します。<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="2">反応レシピ</td>
			</tr>
<tr>
<td>ハイCビーズ</td>
				<td>2.5 μL</td>
			</tr>
<tr>
<td>10 μM PE PCR プライマー 1(材料表)</td>
				<td>0.75 μL</td>
			</tr>
<tr>
<td>10 μM PE PCR プライマー 2(材料表)</td>
				<td>0.75 μL</td>
			</tr>
<tr>
<td>10 mM dNTP</td>
				<td>0.6 μL</td>
			</tr>
<tr>
<td>5x反応バッファー</td>
				<td>5 μL</td>
			</tr>
<tr>
<td>DNAポリメラーゼ</td>
				<td>0.3 μL</td>
			</tr>
<tr>
<td>ddH2O</td>
				<td>14.65 μL</td>
			</tr>
<tr>
<td>トータル</td>
				<td>25 μL</td>
			</tr>
</tbody></table>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>サイクル</td>
				<td>温度</td>
				<td>時間</td>
			</tr>
<tr>
<td>1</td>
				<td>98°C</td>
				<td>30 s</td>
			</tr>
<tr>
<td rowspan="3">n サイクル</td>
				<td>98°C</td>
				<td>10 s</td>
			</tr>
<tr>
<td>65°C</td>
				<td>30 s</td>
			</tr>
<tr>
<td>72°C</td>
				<td>30 s</td>
			</tr>
<tr>
<td>1</td>
				<td>72°C</td>
				<td>7分</td>
			</tr>
</tbody></table>
</li>
</ol>13. 最終 PCR 増幅
<ol><li>上記と同じ条件と選択したサイクル数を使用して、最終PCR増幅を行います。50 μL反応で、5 μLのHi-Cビーズをテンプレートとしてサンプルを分割します。</li>
	<li>すべてのPCR反応を収集し、新鮮なチューブに転送します。磁石を使用してストレプトアビジンビーズを除去し、上清(PCR産物)を回収します。新しいチューブにビーズを移し、ステップ11.2.9に示すようにビーズを洗浄し、バックアップとして4°Cの1x制限バッファーに保管します。</li>
	<li>メーカーの指示に従って、SPRIビーズの量0.85倍を使用してPCR製品を精製してください。TLEバッファの30 μLとエルルート。</li>
	<li>蛍光計測器を使用してHi-Cライブラリを定量化し、チップベースのキャピラリー電気泳動によりライブラリの品質を確認します。</li>
	<li>最後の品質チェックポイントとして、ステップ12.1で説明したのと同じ条件を使用して10サイクルを使用してPCR反応を行うテンプレートとして、Hi-Cライブラリの1μLを使用します。PCR産物を2つのマイクロ遠心分離チューブに分けます:1つをCla Iで消化し、もう1つをコントロールとして未消化のままにします。1.5-2%アガロースゲルで製品を実行します(代表的な結果を参照)。</li>
	<li>適切なシーケンスプラットフォーム上で 50 bp または 75 bp ペアエンドシーケンスに進みます。</li>
</ol>

<ol><li>Cremer, T., Cremer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+territories%2C+nuclear+architecture+and+gene+regulation+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Review+Genetics%22%5BJournal%5D)">Chromosome territories, nuclear architecture and gene regulation in mammalian cells.</a> Nature Review Genetics. 2, 292-301 (2001).</li>
<li>Lieberman-Aiden, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+mapping+of+long-range+interactions+reveals+folding+principles+of+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome.</a> Science. 326, 289-293 (2009).</li>
<li>Dixon, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topological+domains+in+mammalian+genomes+identified+by+analysis+of+chromatin+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Topological domains in mammalian genomes identified by analysis of chromatin interactions.</a> Nature. 485, 376-380 (2012).</li>
<li>Sexton, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+folding+and+functional+organization+principles+of+the+Drosophila+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional folding and functional organization principles of the Drosophila genome.</a> Cell. 148 (3), 458-472 (2012).</li>
<li>Dixon, J. R., Gorkin, D. U., Ren, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+domains%3A+the+unit+of+chromosome+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Chromatin domains: the unit of chromosome organization.</a> Molecular Cell. 62, 668-680 (2016).</li>
<li>Bonev, B., Cavalli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+and+function+of+the+3D+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Organization and function of the 3D genome.</a> Nature Reviews Genetics. 17, 661-678 (2016).</li>
<li>Lupiáñez, D. G., Spielmann, M., Mundlos, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breaking+TADs%3A+how+alterations+of+chromatin+domains+result+in+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Breaking TADs: how alterations of chromatin domains result in disease.</a> Trends in Genetics. 32, 225-237 (2016).</li>
<li>Phillips, J. E., Corces, V. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CTCF%3A+master+weaver+of+the+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">CTCF: master weaver of the genome.</a> Cell. 137 (7), 1194-1211 (2009).</li>
<li>Hong, S., Kim, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computational+characterization+of+chromatin+domain+boundary-associated+genomic+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Computational characterization of chromatin domain boundary-associated genomic elements.</a> Nucleic Acids Research. 45, 10403-10414 (2017).</li>
<li>Zuin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cohesin+and+CTCF+differentially+affect+chromatin+architecture+and+gene+expression+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Cohesin and CTCF differentially affect chromatin architecture and gene expression in human cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (3), 996-1001 (2014).</li>
<li>Guo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR+inversion+of+CTCF+sites+alters+genome+topology+and+enhancer%2Fpromoter+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">CRISPR inversion of CTCF sites alters genome topology and enhancer/promoter function.</a> Cell. 162, 900-910 (2015).</li>
<li>Lupiáñez, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruptions+of+topological+chromatin+domains+cause+pathogenic+rewiring+of+gene-enhancer+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Disruptions of topological chromatin domains cause pathogenic rewiring of gene-enhancer interactions.</a> Cell. 161, 1012-1025 (2015).</li>
<li>Van-Steensel, B., Furlong, E. E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+transcription+in+shaping+the+spatial+organization+of+the+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The role of transcription in shaping the spatial organization of the genome.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20, 327-337 (2019).</li>
<li>Merkenschlager, M., Nora, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CTCF+and+cohesin+in+genome+folding+and+transcriptional+gene+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Genomics+and+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">CTCF and cohesin in genome folding and transcriptional gene regulation.</a> Annual Review of Genomics and Human Genetics. 17 (1), 17-43 (2016).</li>
<li>Hansen, A. S., Pustova, I., Cattoglio, C., Tjian, R., Darzacq, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CTCF+and+cohesin+regulate+chromatin+loop+stability+with+distinct+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">CTCF and cohesin regulate chromatin loop stability with distinct dynamics.</a> Elife. 6, 1-10 (2017).</li>
<li>Van Bortle, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulator+function+and+topological+domain+border+strength+scale+with+architectural+protein+occupancy%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Insulator function and topological domain border strength scale with architectural protein occupancy.</a> Genome Biology. 15, 82(2014).</li>
<li>Ramírez, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+TADs+reveal+DNA+sequences+underlying+genome+organization+in+flies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">High-resolution TADs reveal DNA sequences underlying genome organization in flies.</a> Nature Communications. 9, 189(2018).</li>
<li>Ulianov, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+chromatin+and+transcription+play+a+key+role+in+chromosome+partitioning+into+topologically+associating+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Active chromatin and transcription play a key role in chromosome partitioning into topologically associating domains.</a> Genome Research. 26, 70-84 (2016).</li>
<li>Rowley, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionarily+conserved+principles+predict+3D+chromatin+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Evolutionarily conserved principles predict 3D chromatin organization.</a> Molecular Cell. 67, 837-852 (2017).</li>
<li>Gavrilov, A. A., Golov, A. K., Razin, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actual+ligation+frequencies+in+the+chromosome+conformation+capture+procedure%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Actual ligation frequencies in the chromosome conformation capture procedure.</a> PLoS One. 8, 60403(2013).</li>
<li>Gavrilov, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disclosure+of+a+structural+milieu+for+the+proximity+ligation+reveals+the+elusive+nature+of+an+active+chromatin+hub%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Disclosure of a structural milieu for the proximity ligation reveals the elusive nature of an active chromatin hub.</a> Nucleic Acids Research. 41, 3563-3575 (2013).</li>
<li>Nagano, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+Hi-C+reveals+cell-to-cell+variability+in+chromosome+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-cell Hi-C reveals cell-to-cell variability in chromosome structure.</a> Nature. 502, 59-64 (2013).</li>
<li>Rao, S. S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+3D+map+of+the+human+genome+at+kilobase+resolution+reveals+principles+of+chromatin+looping%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A 3D map of the human genome at kilobase resolution reveals principles of chromatin looping.</a> Cell. 159 (7), 1665-1680 (2014).</li>
<li>Nagano, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+Hi-C+results+using+in-solution+versus+in-nucleus+ligation%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Comparison of Hi-C results using in-solution versus in-nucleus ligation.</a> Genome Biology. 16, 175(2015).</li>
<li>Arzate-Mejía, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+dissection+of+domain+boundaries+affect+genome+topology+and+gene+transcription+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">In situ dissection of domain boundaries affect genome topology and gene transcription in Drosophila.</a> Nature Communications. 11, 894(2020).</li>
<li>Schoenfelder, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Promoter+capture+Hi-C%3A+high-resolution%2C+genome-wide+profiling+of+promoter+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Promoter capture Hi-C: high-resolution, genome-wide profiling of promoter interactions.</a> Journal of Visualized Experiments. (136), e57320(2018).</li>
<li>Servant, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HiC-Pro%3A+an+optimized+and+flexible+pipeline+for+Hi-C+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">HiC-Pro: an optimized and flexible pipeline for Hi-C processing.</a> Genome Biology. 16, 259(2015).</li>
<li>Philip, E., Måns, M., Sverker, L., Max, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MultiQC%3A+Summarize+analysis+results+for+multiple+tools+and+samples+in+a+single+report%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">MultiQC: Summarize analysis results for multiple tools and samples in a single report.</a> Bioinformatics. 10, 1093(2016).</li>
<li>Wingett, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HiCUP%3A+pipeline+for+mapping+and+processing+Hi-C+data%5BTitle%5D)+AND+%22F1000+Research%22%5BJournal%5D)">HiCUP: pipeline for mapping and processing Hi-C data.</a> F1000 Research. 4, 1310(2015).</li>
<li>Imakaev, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iterative+correction+of+Hi-C+data+reveals+hallmarks+of+chromosome+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Iterative correction of Hi-C data reveals hallmarks of chromosome organization.</a> Nature Methods. 9 (10), 999-1003 (2012).</li>
<li>Akdemir, K. C., Chin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HiCPlotter+integrates+genomic+data+with+interaction+matrices%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biolog%22%5BJournal%5D)">HiCPlotter integrates genomic data with interaction matrices.</a> Genome Biolog. 16, 198(2015).</li>
<li>Ramirez, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+TADs+reveal+DNA+sequences+underlying+genome+organization+in+flies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">High-resolution TADs reveal DNA sequences underlying genome organization in flies.</a> Nature Communications. 9, 189(2018).</li>
<li>Ando-Kuri, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+global+and+promoter-centric+3D+genome+organization+temporally+resolved+during+a+circadian+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">The global and promoter-centric 3D genome organization temporally resolved during a circadian cycle.</a> bioRxiv. , (2020).</li>
<li>Cuellar-Partida, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+priors+for+identifying+active+transcription+factor+binding+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Epigenetic priors for identifying active transcription factor binding sites.</a> Bioinformatics. 28 (1), 56-62 (2012).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Model-based+analysis+of+ChIP-Seq+%28MACS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS).</a> Genome Biology. 9, 137(2008).</li>
<li>Ong, C. -T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poly%28ADP-ribosyl%29ation+regulates+insulator+function+and+intrachromosomal+interactions+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Poly(ADP-ribosyl)ation regulates insulator function and intrachromosomal interactions in Drosophila.</a> Cell. 155 (1), 148-159 (2013).</li>
<li>Fresán, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+insulator+protein+CTCF+regulates+Drosophila+steroidogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+Open%22%5BJournal%5D)">The insulator protein CTCF regulates Drosophila steroidogenesis.</a> Biology Open. 4 (7), 852-857 (2015).</li>
<li>Quinodoz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+promotes+the+formation+of+spatial+compartments+in+the+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">RNA promotes the formation of spatial compartments in the nucleus.</a> Cell. 174, 744-757 (2018).</li>
<li>Olivares-Chauvet, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capturing+pairwise+and+multi-way+chromosomal+conformations+using+chromosomal+walks%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Capturing pairwise and multi-way chromosomal conformations using chromosomal walks.</a> Nature. 540 (7632), 296-300 (2016).</li>
<li>Beagrie, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complex+multi-enhancer+contacts+captured+by+genome+architecture+mapping%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Complex multi-enhancer contacts captured by genome architecture mapping.</a> Nature. 543, 519-524 (2017).</li>
<li>Redolfi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DamC+reveals+principles+of+chromatin+folding+in+vivo+without+crosslinking+and+ligation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">DamC reveals principles of chromatin folding in vivo without crosslinking and ligation.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 26, 471-480 (2019).</li>
<li>Maxwell, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HiChIP%3A+efficient+and+sensitive+analysis+of+protein-directed+genome+architecture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">HiChIP: efficient and sensitive analysis of protein-directed genome architecture.</a> Nature Methods. 13, 919-922 (2016).</li>
<li>Gao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C-BERST%3A+Defining+subnuclear+proteomic+landscapes+at+genomic+elements+with+dCas9-APEX2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">C-BERST: Defining subnuclear proteomic landscapes at genomic elements with dCas9-APEX2.</a> Nature Methods. 15 (6), 433-436 (2018).</li>
</ol>

著者らは競合する利益を宣言しない。

ここで提示される核中のHi-C法は、ショウジョウバエゲノムトポロジーの詳細な探索を高解像度で可能にし、プロモーターおよびエンハンサーなどの調節要素間のクロマチンループからTADおよび大きなコンパートメント識別25までの異なるゲノムスケールでのゲノム相互作用の図を提供する。同じ技術は、いくつかの修飾33を有する哺乳類組織にも効率的に適用されている。例えば、単細胞懸濁液の代わりに組織を処理する場合、組織は70μmのフィルターを通してふるいにかけ、そしてDounceホモジナイザーを使用して材料を均質化しながら、リシスステップを行う。さらに、哺乳類のゲノムがショウジョウバエゲノムより25倍大きいほど、1~5kbの分解能マトリックスを構築するのに必要な有効な読み取りペアの数が多くなります。核内Hi-C法は、結紮前65°Cで1%SDSを有する核ライシスの回避において、元のHi-C法2とは異なり、したがって核完全性を維持し、7mLの代わりに1mLで結紮することにより<sup class=...

真核生物では、ゲノムは第1相間の核空間内の特定の領域を占める染色体に分割される。染色体を形成するクロマチンは、転写的に寛容であるアクセス可能なクロマチンの1つと、転写的に抑制的なコンパクトクロマチンの2つの主要な状態に分けることができます。これらのクロマチン状態は、核空間で分離し、めったに混ざらず、核2に2つの異なるコンパートメントを形成する。サブメガベーススケールでは、境界は、染色体組織3、4、5をマークするTADと呼ばれる高周波クロマチン相互作用のドメインを分離します。哺乳類では、TAD境界は、凝集およびCCCTC結合因子(CTCF)6、7、8によって占められます。凝集複合体は、安定したクロマチンループ9、10、13、14を形成するためにゲノム配列において収束配向で配置されたCTCF結合部位においてクロマチンを押し出し、停止する。CTCFDNA結合部位の境界または凝集タンパク質の存在量の減少における遺伝的破壊は、調節要素間の異常な相互作用、TAD形成の喪失、および遺伝子発現調節緩和9、10、11、13、14をもたらす。
ショウジョウバエでは、TAD間の境界は、境界元素関連因子32 kDa(BEAF-32)、モチーフ1結合タンパク質(M1BP)、中心タンパク質190(CP190)、毛深翼(SuHW)の抑制剤、CTCFを含むいくつかのAPによって占められており、活性なトーン修飾およびポリメラーゼII.17において濃縮される。ショウジョウバエでは、TADが転写13、17、19の結果として現れ、境界形成および絶縁特性における独立APの正確な役割はまだ調査中であると示唆されている。したがって、ショウジョウバエのドメインが類似した転写状態の領域の凝集の唯一の結果であるかどうか、またはCTCFを含むAPが境界形成に寄与するかどうかは、完全に特徴づけられるままである。染色体立体構造キャプチャ技術の開発と次世代シーケンシングを通じて、ゲノム接点の高解像度の探索が可能になった。Hi-Cプロトコルは、クロマチンフラグメント間のスプリアスライゲーション産物を回避するために「溶液中」2を行うライゲーションステップで最初に記載した。しかし、いくつかの研究は、データ中の有用なシグナルが溶液20,21になかった部分的に溶解した核で形成されたライゲーション生成物から来たという認識を指摘した。
次に、単細胞Hi-C実験22の一部として核内部のライゲーションを行うようにプロトコルを改変した。核内Hi-Cプロトコルは、その後、ゲノム距離の全範囲にわたってより一貫したカバレッジを生み出し、より少ない技術的なノイズ23、24でデータを生成するために、細胞集団Hi-Cに組み込まれた。ここで詳細に説明するプロトコルは、核内Hi-Cプロトコル23,24の集団に基づいており、ショウジョウバエ25のノッチ遺伝子遺伝子座遺伝子のドメイン境界からCTCFおよびM1BPのDNA結合モチーフを遺伝的に除去した結果を調査するために使用された。この結果は、境界でAPのDNA結合モチーフを変更することは、ノッチドメイン形成、ノッチ座を取り巻く領域におけるより大きなトポロジカル欠陥、および遺伝子発現調節緩和に大きな影響を及ぼすことを示している。これは、ドメイン境界における遺伝的要素が、ショウジョウバエ25におけるゲノムトポロジーおよび遺伝子発現の維持にとって重要であることを示している。

<table><tbody><tr><td>16%(vol / vol)パラホルムアルデヒド溶液</td><td>寒天科学</td><td>R1026</td><td></td></tr><tr><td>ビオチン-14-dATP</td><td>Invitrogen</td><td>CA1524-016</td><td></td></tr><tr><td>ClaI酵素</td><td>NEB</td><td>R0197S</td><td></td></tr><tr><td>COVARIS 超音波装置</td><td>Covaris</td><td>LE220-M220</td><td></td></tr><tr><td>カットスマート</td><td>NEB</td><td>B72002S</td><td></td></tr><tr><td>ダルベッコの修正イーグル培地(DMEM) 1x</td><td>Life Technologies</td><td>41965-039</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads MyOne ストレプタビジン C1</td><td>Invitrogen</td><td>65002</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清 (FBS) 滅菌フィルター</td><td>Sigma</td><td>F9665</td><td></td></tr><tr><td>Klenow Dna PolI ラージフラグメント</td><td>NEB</td><td>M0210L</td><td></td></tr><tr><td>Klenow exo(-)</td><td>NEB</td><td>M0210S</td><td></td></tr><tr><td>Ligation Buffer</td><td>NEB</td><td>B020S</td><td></td></tr><tr><td>MboI酵素</td><td>NEB</td><td>R0147M</td><td></td></tr><tr><td>NP40-Igepal</td><td>SIGMA</td><td>CA-420</td><td>溶解緩衝液に添加する非イオン性界面活性剤 PE</td></tr><tr><td>アダプター 1.0</td><td>イルミナ</td><td>5'-P-GATCGGAAGAGCGGTTCAGCAG GAATGCCGAG-3'PE</td><td></td></tr> <tr><td>アダプター 2.0</td><td>イルミナ</td><td>5'-ACACTCTTTCCCTACACGACGCT CTTCCGATCT-3'PE</td><td></td></tr> <tr><td>PCRプライマー 1.0</td><td>Illumina</td><td>5'-AATGATACGGCGACCACCGAGAT CTACACTCTTTCCCTACACGAG CTCTTCCGATCT-3'PE</td><td></td></tr> <tr><td>PCR プライマー 2.0</td><td>Illumina</td><td>5'-CAAGCAGAAGACGGCATCGAG ATCGGTCTCGGCATTCCTGCTGA ACCGCTCTTCCGATCT-3'Phenol</td><td></td></tr><tr><td>: Chloroform:Isoamyl Alcohol 25:24:1</td><td>SIGMA</td><td>P2069</td><td></td></tr><tr><td>Primer 1 (既知の相互作用、図)2A)</td><td>Sigma</td><td>5'-TCGCGGTAATTTTGCGTTTGA-3'Primer</td><td></td></tr> <tr><td>2 (既知の相互作用、図 2A)</td><td>Sigma</td><td>5'-CCTCCCTGCCAAACGTTTT-3'Protease</td><td></td></tr> <tr><td>inhibitor カクテル錠</td><td>Roche</td><td>4693132001</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Roche</td><td>3115879001</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Qubit ThermoFisher</td><td>Q33327</td><td></td></tr><tr><td>RNAse</td><td>Roche</td><td>10109142001</td><td></td></tr><tr><td>SPRI ビーズ</td><td>Beckman</td><td>B23318</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNAリガーゼ</td><td>Invitrogen</td><td>15224-025</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNAポリメラーゼ</td><td>NEB</td><td>M0203S</td><td></td></tr><tr><td>T4ポリヌクレオチドキナーゼ(PNK)&nbsp;</td><td>NEB</td><td>M0201L</td><td></td></tr><tr><td>TaqPhusion</td><td>NEB</td><td>M0530S</td><td>DNAポリメラーゼ</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td></td><td></td><td>SDSの消光のための非イオン性界面活性剤</td></tr></tbody></table>

ショウジョウバエ細胞におけるイン核hi-c

In-Nucleus Hi-C in Drosophila Cells

ゲノムは、ドメイン間の相互作用を分離する境界によって区切られたトポロジカルに関連付けられたドメイン(TAD)に編成される。ショウジョウバエでは、TADの形成と境界の根底にあるメカニズムはまだ調査中です。ここで説明する核内Hi-C法の適用は 、ノッチ 遺伝子を単離するTAD境界における建築タンパク質(AP)結合部位の機能を解剖するのに役立った。APの損失を引き起こすドメイン境界の遺伝子改変は、TAD融合、転写欠陥、および長距離トポロジカル変化をもたらす。これらの結果は、ショウジョウバエにおけるドメイン境界形成および遺伝子発現制御に対する遺伝要素の寄与を示す証拠を提供した。ここでは、核内Hi-C法について詳細に説明し、これはプロトコルと共に実験の品質を評価するための重要なチェックポイントを提供する。また、異なるゲノムスケールでゲノム相互作用を分析するために必要なシーケンシング読み取り数と有効なHi-Cペアも示されています。CRISPR/Cas9は、この核内Hi-Cプロトコルを用いたゲノム相互作用の調節要素の遺伝子編集と高解像度プロファイリングを、遺伝的要素の構造機能の調査のための強力な組み合わせとなり得る。

以下に、Hi-C プロトコルが正常に機能した結果を示します (図 1Aの Hi-C プロトコル ワークフローの概要を参照してください)。核のHi-C実験の間にはいくつかの品質管理のチェックポイントがある。サンプルアリコートは、(UD)および(D)後に、結紮後(L)と同様にクロマチン制限ステップを回収した。架橋を逆転させ、DNAを精製し、アガロースゲル上で動かした。Mbo Iとの制限が成功した場合、200-1000 bpのスミアが観察された(図1B)。分子の予想サイズは、選択した制限酵素に依存する。ライゲーションが成功した場合、ゲルの上部に高分子量帯が見られた(図1B)。消化効率は、プロトコルに詳述するqPCRによっても確認することができる。許容可能な消化効率は80%以上である(図1C)。
Hi-Cライゲーション効率を詳細に評価するために、プライマ...

ゲノムは核空間内で異なる構造に編成され、染色体立体構造の捕捉技術によって明らかにすることができる。核内Hi-C法は、ショウジョウバエ細胞株におけるクロマチン相互作用のゲノム全体のコレクションを提供し、制限フラグメントレベルでメガベース解像度で探索できる接触マップを生成する。

ショウジョウバエ細胞におけるイン核Hi-C

The genome is organized into topologically associating domains (TADs) delimited by boundaries that isolate interactions between domains. In Drosophila, ...

核Hi-Cプロトコルは、クロマチンループ、ドメイン、およびゲノムを組織するコンパートメントの特徴付けのための異なる解像度で染色体確認の探査を可能にする。このプロトコルは、異なるスケールでのゲノム相互作用の高解像度プロファイリングを提供し、より少ない技術的なノイズを持つゲノム距離とデータの全範囲にわたって、より一貫したカバレッジを生み出します。このプロトコルと遺伝子編集を組み合わせることは、遺伝的要素の構造的機能をテストするための強力な戦略です。また、疾患を引き起こす構造変化の特性評価にも適用できる。核Hi-Cプロトコルは、真核ゲノムのゲノム組織を探索するために適用することができます。SDSおよびTriton処理を行うと、凝集体が酵素反応効率を妨げるので、核塊を細分化し、シーケンシング前に適切な品質管理を行います。メタノールフリーホルムアルデヒドを10倍に10回に加えて、シュナイダー培地の17.5ミリリットルのシュナイダーの7つのシュナイダーのライン2プラスショウジョウバエ細胞に10回加え、60秒ごとに混合するか、回転ホイールでグリシンを室温で10分間インキュベートし、グリシンを0.12モルとの最終濃度に加えます。室温で5分後、氷上で15分後、遠心分離によって細胞を収集し、慎重に冷たいPBSの25ミリリットルでペレットを再中断し、別の遠心分離で細胞を収集します。遠心分離の終わりに、カウントするための氷冷ライシスバッファーの1ミリリットルで細胞を再中断し、ミリリットル濃度当たり6細胞に10倍に細胞を調整します。氷上の細胞を30分間インキュベートし、2分ごとにチューブを反転させ、別の遠心分離で細胞を混合して収集します。新鮮な氷冷間リシスバッファーの 1 ミリリットルでペレットを再懸濁します。遠心分離後、1ミリリットルの1ミリリットルの制限バッファーでライセートを洗浄します。再び遠心分離機を使用して、ライセートを収集する。ペレットを新鮮な制限バッファーの360マイクロリットルと慎重なピペットで10%SDSの11マイクロリットルに再懸濁し、時折ピペットで毎分7〜950回転で45分間インキュベートします。インキュベーションの終わりに、75マイクロリットルの非イオン性界面活性剤で透過化を停止し、時折ピペットで毎分950回転で揺れ動いてさらに45分間、チューブをインキュベーターに戻します。クロマチン消化の場合は、回転で摂氏37度で4〜16時間インキュベーションのためにチューブにMbo1の200単位を追加します。インキュベーションの終了時に、摂氏60度で20分間のインキュベーションで酵素を不活性化する。制限フラグメントの突出しを埋め、DNAの終点をビオチンで標識するには、 10ミリモルdCTP、dGTP、dTTP、0.4ミリモルビオチンdATPの20マイクロリットル、トリス低

Research

JoVE Journal

Genetics

遺伝学

このプロトコルは、解剖さショウジョウバエの幼虫の免疫組織化学を実行する方法を示しています。...

ショウジョウバエ幼虫NMJ免疫組織化学

本論文では、直接蛹殻を介して画像細胞挙動への高速走査型共焦点顕微鏡を使用する方法を示します。そのまま蛹ケースを残すことによって、このメソッドを直接学ぶことは困難であるショウジョウバエの発生段階で動的な細胞プロセスの観察と測定を可能にします。...

の蛹ケースを画像化<em&gt;キイロショウジョウバエ</em

ショウジョウバエの組織は、しばしば、細胞型の不均一な混合物を含有する。特定の組織の特定の細胞型における遺伝子発現を調べるために、核が遺伝的にタグ付けし、続いて親和性に基づくアプローチを用いて単離することができる。単離された核は、遺伝子発現解析およびクロマチン免疫沈降などの下流用途に使用することができる。...

からのタグ付き核の親和性に基づく分離<em&gt;ショウジョウバエ</em遺伝子発現解析のための&gt;組織

記載されている RNAその場で交配のプロトコルでは、全体のショウジョウバエの胚または切り裂かれたティッシュで RNA の検出をことができます。96 ウェル マイクロ...

ショウジョウバエの胚とパスチラミドシグナル信号増幅を利用した生体表面の高解像度蛍光In Situハイブリダイゼーション

創傷誘発倍化は、細胞の損失を補うために分割する代わりに細胞のサイズが成長する保存された組織修復戦略です。ここでは、上皮創傷修復における策略とその遺伝的調節を測定するモデルとしてフルーツフライを使用する方法に関する詳細なプロトコルがあります。...

創傷による多重化を研究する ショウジョウバエ モデル

このプロトコルの目的は、熱ストレスに続いて、ショ ウジョウバエ...

ライブ熱ストレスショ ウジョウバエ 胚における核内アクチンロッドのイメージング

このプロトコルは、ショ ウジョウバエ...

ショ ウジョウバエ 唾液腺におけるヘテロクロマチン関連タンパク質の可視化のための免疫蛍光染色

5-エチニル-2'-デオキシウリジン(EdU)およびホスホヒストンH3(pH3)標識による細胞周期解析は、広範な最適化を必要とし得る多段階の手順である。ここでは、異なる細胞周期段階で細胞を区別するための画像解析および定量化を含む、この手順のすべてのステップを説明する詳細なプロトコルを提示する。...

5-エチニル-2'-デオキシウリジン/ホスホヒストンH3細胞周期進行解析用二重標識プロトコル

ショウジョウバエでは、卵母細胞核は卵発生時に微小管依存性の移動を受ける。ここでは、卵室ex-vivoでライブイメージングを行うことで、移行に追随するために開発されたプロトコルについて説明します。私たちの手順は、スピニングディスク共焦点顕微鏡を使用してマルチポジション3Dタイムラプス映画を取得するために12時間生きている卵室を維持します。...

ショ ウジョウバエ・ ウーサイトにおける核移動

このプロトコルは、ショウジョウバエのメラノガスター幼虫視葉におけるハイブリダイゼーション連鎖反応蛍光性交配(HCR-FISH)を行うために必要な手順を説明しています。プローブ設計、ハイブリダイゼーション、増幅、組織マウントの手順が詳細に記載され、発達中の視葉の可視化を容易にします。...

発達中の ショウジョウバエ の視葉におけるハイブリダイゼーション連鎖反応FISHの

学ぶショウジョウバエ細胞における高解像度イン核Hi-Cプロトコル。クロマチン相互作用を正確にプロファイリングし、TAD境界における遺伝子発現制御メカニズムを解明する強力な手法です。

ショウジョウバエ細胞におけるイン核Hi-C

さらに動画を探す