Name: タンパク質アルギニンメチルトランスレシーゼ1-9細胞内活性を研究する定量的方法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-07T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 11 s
Description: 学ぶPRMT1-9の細胞内酵素活性を定量的蛍光ウエスタンブロッティングで測定する手法。ヒストンH4アシメトリックジメチル化をバイオマーカーとし、阻害剤効果を評価できる標準化されたアプローチを確立した。

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1. 細胞培養とめっき
注:マイコプラズマ汚染について、推奨媒体とテストを行う培養細胞。HEK293T、MCF7、およびC2C12細胞は、PRMTアッセイでこれらの細胞株が正常に使用されたので、例として選ばれました。
<ol><li>DMEMにおける培養HEK293T、MCF7、およびC2C12は、10%のウシ胎児血清(FBS)、ペニシリン(100 UmL−1)、およびストレプトマイシン(100μgmL−1)を10cmの組織培養処理(TC)ディッシュで補充した。</li>
	<li>PRMT8アッセイの場合、アッセイ開始前に3日間、ドキシサイクリン(2 μg/mL)を含む培地でPRMT1誘導ノックダウンHEK293T細胞を増殖させます。</li>
	<li>細胞をプレートするには、プレートから培地を取り出して捨てます。</li>
	<li>10 mLのPBS(Ca+2 およびMg+2 イオンを含まない)を加え、細胞を洗浄し、溶液を廃棄します。</li>
	<li>トリプシンEDTA(0.25%)を1 mL加え、室温(RT)で1分間インキュベートし、溶液を廃棄します。細胞が丸くなるまでインキュベートし、プレートから取り外します。必要に応じて、プレートをタップしてセルを取り外します。C2C12などのトリプシン化が困難な細胞の場合は、37°Cでプレートを1〜2分間インキュベートします。 注:細胞の生存率を低下させるため、トリプシン溶液への細胞暴露を長期間(>10分)避けてください。</li>
	<li>プレートに1mLのプリウォームされた培地を加え、ピペット細胞を上下にそっと分解して細胞の塊を分解します。細胞を15mLチューブに移し、3〜5mLの培地を加えます。</li>
	<li>細胞数を測定するには、10 μLのトリパンブルーと10 μLのセルを混合し、10 μLをヘモサイトメーターに移すか、他の細胞計法を使用します。</li>
	<li>推奨セル密度にセルを希釈し、500 μL/wellを24ウェルTCプレートに入れる(表1)。内因性アッセイ(PRMT1、PRMT4、PRMT5、PRMT7、およびPRMT9)については、ステップ3.1に進みます。</li>
</ol>2. 細胞トランスフェクション
<ol><li>外因性アッセイ(PRMT3、PRMT6、PRMT8)の場合、推奨量のDNAを用いてHEK293T細胞をトランスフェクトする(表2)。HEK293T細胞はトランスフェクトが容易なので、メーカーの指示に従って、あらゆるトランスフェクション試薬を使用できます。</li>
</ol>3. 複合処理
注:培養培地中の最終ジメチルスルホキシド(DMSO)濃度を0.1%超えないでください。各ウェルに同じDMSO濃度を保ちます。選択的PRMT阻害剤(化学プローブ)およびそれらの密接に関連する不活性な類似体を 表3に示す。
<ol><li>内因性アッセイ(PRMT1、PRMT4、PRMT5、PRMT7、PRMT9)の場合は、細胞から培地を取り出し、化合物またはDMSO単独で500μLの培地に置き換えます(コントロール)。 注:通常、Rメチル化レベルの80%以上の減少を観察するのに2日かかります。</li>
	<li>外因性アッセイ(PRMT3、PRMT6、PRMT8)の場合、トランスフェクション後4時間の培地を取り出し、化合物またはDMSO単独(対照)で500μLの培地を添加し、20〜24時間インキュベートします。</li>
</ol>4. 細胞のライセート調製
<ol><li>ウェルからすべてのメディアを取り除き、100 μLのPBSで洗浄して残留培地を取り除き、 60 μLのリシスバッファー(20 mM Tris-HCl pH 8、150 mM NaCl、1 mMエチレンジアミント酢酸(EDTA)、10 mM MgCl 2、0.5% トリトン X-100、12.5 U mL-1 ベンゾナーゼ、完全なEDTAフリー阻害剤をそれぞれ加えます。<ol>
<li>RTで1分未満インキュベートし、プレートを揺らし、細胞上にリシスバッファーを分配する。次に、20%の3μLを加えて、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)を加え、最終的な1%濃度にし、軽く振って混ぜます。ライセートをマイクロ遠心チューブに移し、氷の上に保管します。 注:使用前に新鮮なベンゾナーゼとタンパク質阻害剤カクテルを追加します。ベンゾナス酸の添加は、細胞のリゼート粘度を低下させる核酸を迅速に加水分解する。</li>
	</ol>
</li>
	<li>BCAプロテインアッセイキットを使用してサンプルのタンパク質濃度を決定するか、溶液中の1%SDSを許容する他の方法を使用してください。<ol>
<li>96ウェルクリアプレートのウェルに、2 μLのライセートおよびタンパク質標準(リシスバッファー内の BSA の 0、1、2、4、および 8 μg/mL)を加えます。</li>
		<li>試薬Aと試薬Bを50:1比で混合し、1ウェルあたり200μLを加えます。37°Cで20分間インキュベートし、吸光度を読み取ります。</li>
	</ol>
</li>
	<li>サンプル全体で等しくなるように、リシスバッファーでタンパク質濃度を調整します。</li>
	<li>4xローディングバッファーの20 μLを60 μLのセルライセートに加え、95°Cで5分間加熱します。熱変性後、ライセートは-20°Cで保存することができる。</li>
</ol>5. ウェスタンブロット分析
<ol><li>ヒストンタンパク質の分析用に5~20μgの全細胞ライセートを、他のタンパク質に対して20~100 μgを4-12%ビストリスタンパク質ゲルにロードします。</li>
	<li>MOPS SDSランニングバッファ(50 mM MOPS、50 mM Tris Base、0.1%SDS w/v、1 mM EDTA、pH 7.7)で、100Vで約2時間、または色素フロントがゲルの底部に達するまで、ゲルを実行します。</li>
	<li>湿式移送を行う場合は、氷冷トリスグリシン転送バッファー(25 mMトリス、192 mMグリシン、20%v/vメタノール、および0.05%w/v SDS)でトランスファーサンドイッチを組み立てます。<ol>
<li>メーカーの指示に従ってスポンジ、フィルターペーパー、PVDF膜、ゲルを配置します。メタノールに浸漬してPVDF膜を活性化し、アセンブリ前に30秒間の転写バッファーにゲルを平衡化します。 注:ヒストンなどの低分子量タンパク質に対する自己蛍光性と適合性が低いため、推奨されるPVDFウェスタンブロッティングメンブレンを使用してください(材料表)。</li>
	</ol>
</li>
	<li>トリスグリシン移動バッファーでゲルから PVDF 膜にタンパク質を 1.5 時間氷上で転送します。</li>
	<li>ブロックバッファー内の30分間のブロック膜 (5% w/v 乳酸緩衝塩分、PBS).洗浄バッファー(PBST:PBSで0.1%v/v Tween-20)を用いてリンスし、ウシ血清アルブミン(BSA)溶液中の一次抗体(PBST中5%BSA)を一晩4°Cでインキュベートする(表3)。 注:長期保存のために、フィルター殺菌BSA溶液、0.02%w/vナトリウムアジドを加え、4°Cに保ちます。</li>
	<li>PBSTで3×5分洗浄します。その後、ヤギ抗ウサギ(IR800)とロバ抗マウス(IR680)抗体を推奨ブロッキングバッファー(材料表、表3)でRTで30分間インキュベートし、PBSTで3 x 5分洗浄します。</li>
	<li>800および700 nmの蛍光ウェスタンブロットイメージャーの信号を読み取る。高感度かつダイナミックレンジ、高い信号対雑音比、画像飽和度に達したときの警告、同じサンプルバンド内の2つの蛍光色の多重化を持つ単一の画像で、強いバンドとかすかなバンドを明確にイメージングできる機器を使用するのが好ましい。</li>
	<li>蛍光ウェスタンイメージング用の適切なソフトウェアを使用して、ウェスタンブロット分析のためのバンド強度を決定します。</li>
</ol>

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</ol>

著者は、競合する金銭的利益やその他の相反する利益を宣言していません。

ここでは、PRMTファミリーのメンバーに対する詳細な細胞アッセイプロトコルについて、蛍光ウェスタンブロッティング法を用いることが記載されている。アルギニンメチル化の変化が個々のPRMT損失または触媒阻害時に容易に検出され、他の家族によって補償することができないユニークな基質が選択された。一部のタンパク質は、複数のPRMT21,23によってメチル化されており、所与のPRMTが所定のタンパク質基質24、25、26、27に少量の細胞マークのみを寄与する基質特異性における重複を示唆する。したがって、各アッセイでは、ノックダウンおよび/または過剰発現実験を用いた基質および抗体の徹底的な検証と、十分に特徴付けられた選択的阻害剤を用いたさらなる検証が必要でした。PRMT特異的な基質は、間接的にメチルアルギニンマークレベルに影響を与える可能性のある細胞生存率および増殖の複合効果を避けるために、PRMT後2〜3日以内にメチル化マークの変化を検出できることを同定した。PRMT1、4、5、7、9用のユニークな基板を見つけることは可能でしたが、。PRMT3、6、および8では、機能アプローチの利得を採用する必要がありました。いくつかのアルギニンメチル特異的抗体は、様々な細胞標的についてテストされました, しかし、どれもPRMT3とPRMT6ノックダウンの3日以内に有意な変化を検出できませんでした;したがって、バイオマーカーアッセイは、触媒的に不活性な変異体と共に異所性発現酵素を用いて開発され、基線基質メチル化の制御として役立った。PRMT8は近いPRMT1ホモログであり、同様の基質の好みを共有する。PRMT8選択的バイオマーカーを同定できなかったため、PRMT1ノックダウン細胞のアッセイが開発され、そこでPRMT8がEWSと共に発現した。PRMT1はH4R3不斉メチル化を担う主要な酵素でも、従って、H4R3me2aをPRMT3およびPRMT6細胞アッセイのバイオマーカーとして使用し、基底H4R3me2aレベルの低い細胞を選択し、触媒的に不活性な変異体をバックグラウンドコントロールとして使用した。内因性アッセイが好ましいが、外因性アッセイは、いくつかの選択的PRMT阻害剤7、8、9の細胞力を試験する上で非常に貴重である。PRMT生物学に関する知識の増大に伴い、PRMT3、PRMT6、PRMT8に対してより特異的なバイオマーカータンパク質を見つけることでアッセイを改善することが期待されます。
PRMTアッセイの性能には、検証済みの抗体および適切な制御が重要です。ここで推奨されるすべての抗体は、ノックダウンと過剰発現実験によって徹底的に検証されていますが、バッチ間の違い(特にポリクローナル抗体の場合)は、依然としてその性能に影響を与える可能性があります。したがって、アッセイの信頼性を確認するために、遺伝的方法と化学プローブを密接に関連する陰性制御と組み合わせて使用することが重要です。さらに、タンパク質過剰発現を必要とするPRMTアッセイでは、触媒的に不活性な変異体を野生型タンパク質と共に使用して基底メチル化レベルを決定することが重要です。
細胞内のPRMTの活性をプロファイリングするための定量アッセイのこのコレクションは、基本的な細胞培養および蛍光ウェスタンブロッティング技術のみを含む最小限の装置と限られた技術的専門知識で迅速かつ容易に実施することができるので、科学界にとって広く有用であり得る。PRMTに推奨される抗体および化学プローブは、特定のABPPプローブの適合性を確立し、標的関与を監視し、競合するABPP形式を使用してオフターゲット効果を評価するために、活性ベースのタンパク質プロファイリング(ABPP)アッセイにも利用できます。ここで説明するアッセイ開発アプローチは、タンパク質リジンメチルトランスフェリン酵素やアセチルトランスビセナーゼなどの他の酵素ファミリーに対しても外挿することができます。

アルギニンメチル化は、タンパク質とタンパク質とRNAの相互作用を調節する重要な翻訳後修飾であり、mRNA前スプライシング、DNA損傷、転写応答、および成長因子媒介伝達1,2などの様々な細胞プロセスにおいて重要な役割を果たしている。アルギニンは、モノメチルアルギニン(Rme1)、非対称ジメチルアルギニン(Rme2a)、または対称型ジメチルアルギニン(Rme2s)3を生じるタンパク質アルギニンメチルトランスレシエート(PRMT)によってメチル化される。メチル化タイプに基づいて、PRMTは、モノメチル化と非対称ジメチル化を触媒するI型(PRMT1、2、3、4、6、および8)の3つのグループに分類されます。モノおよび対称的なジメチル化を触媒するII型(PRMT5およびPRMT9)。そしてIII型(PRMT7)は、アルギニン3のモノメチル化しかできない。
市販のアルギニンメチル化特異的抗体の数が増えているため、PRMT活性はウェスタンブロッティングを使用して測定することができます。蛍光性ウェスタンブロットは、より大きなダイナミックレンジと直線性、高感度、および多重化を可能にする4に起因する化学発光検出よりも好ましい技術である。タンパク質メチル化レベルを定量するためには、メチル化シグナルを全タンパク質レベルに正規化することが必要です。異なる宿主種(例えば、マウスおよびウサギ)で育てられた全量およびメチル化タンパク質に対する抗体を選択することにより、異なるフルオロフォアで標識された二次抗体を使用することができ、両方の抗体のシグナルを同じサンプルバンドで決定することができる。メチルアルギニン抗体は、特定の文脈でメチルアルギニンが見つかるモノメチル化、非対称、または対称的にジメチル化タンパク質を同定し、特徴付けるために開発されました。PRMTsメチル化グリシンとアルギニンが豊富なモチーフの大部分が基質5の中で、それぞれ、モノメチルまたは非対称の対称ジメチルアルギニングリシン反復を含むペプチドに対していくつかの抗体が発生した。他のメチルアルギニン抗体は、これらの特定の文脈におけるメチルアルギニンの検出を容易にする反復文脈における非対称、対称ジメチル−およびモノメチルアルギニンを含むペプチドライブラリーに対して生成された6。ヒストンH4R3me2aやBAF155-R1064me2aなどのメチル化を選択的に検出できる単一タンパク質上の特定のアルギニンマークを認識する抗体も増えています。
市販のPRMT阻害剤は、PRMT細胞アッセイ用のツールとして使用できるいくつかの市販のPRMT阻害剤があります。しかし、それらのすべてが選択性とオフターゲット効果のために完全に特徴付けられているわけではないし、いくつかは慎重に使用する必要があります。構造ゲノムコンソーシアムは、学術機関や製薬パートナーと共同で、科学界の制限なく使用できる強力で選択的で細胞透過性のPRMT阻害剤(化学プローブ)を開発しました。これらの阻害剤に関する情報は、https://www.thesgc.org/chemical-probes/epigenetics および https://www.chemicalprobes.org/ に記載されています。化学プローブは、インビトロIC50またはKd<100nM、同じファミリー内のタンパク質に対する30倍以上の選択性、および1μMでの有意な細胞活性を有する低分子阻害剤であり、さらに、各化学プローブは、意図された標的7、8、9、10、11、12に対して不活性である近い化学類似体を有する。
このプロトコルの目的は、蛍光ウェスタンブロット法を用いて個々のPRMTファミリーメンバーの細胞活性を測定することです。ここでは、検証済みのアッセイバイオマーカー、抗体、および強力な細胞活性阻害剤に関する詳細情報と、アッセイの実装を成功させるための貴重な戦略が提供されています。

<table><tbody><tr><td>10 cm TC皿</td><td>Greiner bio-one</td><td>664160</td><td></td></tr><tr><td>24-well TCプレート</td><td>Greiner bio-one</td><td>662160</td><td></td></tr><tr><td>4&ndash;12% ビストリスタンパク質ゲル</td><td>サーモフィッシャー Scientiffic</td><td>NP0323BOX, NP0322BOX,NP0321BOX</td><td></td></tr><tr><td>アマシャム ハイボンド P PVDF 膜</td><td>ミリポアシグマ</td><td>10600021</td><td></td></tr><tr><td>抗アシム 24</td><td>ミリポアシグマ</td><td>07-414</td><td></td></tr><tr><td>抗アシム 25</td><td>ミリポアシグマ</td><td>09-814</td><td></td></tr><tr><td>アンチ B-アクチン</td><td>サンタクルーズバイオテクノロジー</td>ズ <td>sc-47778</td><td></td></tr><tr><td>反BAF155</td><td>Santa Cruz Biotechnologies</td><td>sc-32763</td><td></td></tr><tr><td>anti-BAF155-R1064me2a</td><td>Millipore-Sigma</td><td>ABE1339</td><td></td></tr><tr><td>anti-FLAG (#, 1:5000)</td><td>Millipore-Sigma</td><td>F4799</td><td></td></tr><tr><td>anti-GFP</td><td>Clontech</td><td>632381</td><td></td></tr><tr><td>anti-H3</td><td>Abcam</td><td>ab10799</td><td></td></tr><tr><td>anti-H3R2me2a</td><td>Millipore-Sigma</td><td>04-848</td><td></td></tr><tr><td>反H3R8me2a</td><td>ロックランド</td><td>600-401-I67</td><td></td></tr><tr><td>反H4</td><td>アブカム</td><td>ab174628</td><td></td></tr><tr><td>反H4R3me2a</td><td>アクティブモチーフ</td><td>39705</td><td></td></tr><tr><td>反HSP / Hsc70</td><td>エンツォ</td><td>ADI-SPA-820</td><td></td></tr><tr><td>反PRMT1</td>ミリ<td>ポアシグマ</td><td>07-404</td><td></td></tr><tr><td>反PRMT3</td><td>アブ</td><td>カム ab191562</td><td></td></tr><tr><td>反PRMT4</td>、<td>ベチル</td> <td>#A300-421A</td><td></td></tr><tr><td>、反PRMT5</td>、<td>アブカム</td><td>ab109451</td><td></td></tr>、<tr><td>反PRMT6</td>、<td>アブカム</td><td>ab47244、</td><td></td></tr><tr><td>反PRMT7</td>、<td>アブカム</td><td>ab179822</td><td></td></tr>、<tr><td>反Rme1</td>、<td>CST</td><td>8015</td><td></td></tr>、<tr><td>反Rme2a</td>、<td>CST</td><td>13522</td><td></td></tr>、<tr><td>反Rme2s</td><td>CST</td><td>13222</td><td></td></tr><tr><td>anti-Rme2s (ASYM25), Millipore, , 1:2000)</td><td></td><td>09-814</td><td></td></tr><tr><td>anti-SAP145 (Abcam, #, 1:1000)</td><td>Abcam</td><td>ab56800</td><td></td></tr><tr><td>anti-SAP145-R508me2s</td><td></td><td></td><td>kind gift from Dr. Yanzhong Yang, Beckman Research Institute of City of</td></tr><tr><td>Hope anti-SmBB</td>'<td>サンタクルーズ</td><td>バイオテクノロジーsc-130670</td><td></td></tr><tr><td>ベンゾナーゼ</td><td></td><td></td><td>は</td></tr><tr><td>、ステファンリチャード博士、マギル大学</td>cOmplete、EDTAフリープロテアーゼ阻害剤カクテルミリポアシグマ11873580001<td></td> DMEMWisentから社内BSAミリポアシグマシグマA7906 C2C12<td></td><td></td>ギフト</tr>を製造<tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>319-005-CL</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Bioshop</td><td>DMS666.100</td><td></td></tr><tr><td>ロバ抗マウス IgG-IR680</td><td>Licor</td><td>926-68072</td><td></td></tr><tr><td>ドキシサイクリン</td><td>ミリポアシグマ</td><td>D9891</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Bioshop</td><td>EDT111.500</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Wisent</td><td>80150</td><td></td></tr><tr><td>グリシン</td><td>Bioshop</td><td>GLN002.5</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ抗ウサギ IgG-IR800</td><td>Licor</td><td>926-32211</td><td></td></tr><tr><td>HEK293T</td><td></td><td></td><td>ヨーク大学</td></tr><tr><td>Image Studio Software ver 5.2</td><td>Licor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Loading buffer: NuPAGE LDS Sample Buffer (4x)</td><td>ThermoFisher Scientiffic</td><td>NP0007</td><td></td></tr><tr><td>MCF7</td><td></td><td>ATCC&reg;HTB-22&トレード;</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Bioshop</td><td>SOD001.1</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE MOPS SDS ランニングバッファー</td><td>ThermoFisher Scientiffic</td><td>NP0001</td><td></td></tr><tr><td>Odyssey ブロッキングバッファー (PBST で 4 倍に希釈)</td> <td>Licor</td><td>927-40000</td><td>インターセプト (PBS) ブロッキングバッファーも使用できます # 927-70001</td></tr><tr><td>Odyssey CLX イメージングシステム</td><td>Licor</td><td>モデル番号 9140</td><td></td></tr><tr><td>PBS (組織培養)</td><td>Wisent</td><td>311-010-CL</td><td></td></tr><tr><td>PBS(ウェスタンブロット)</td><td>Bioshop</td><td>PBS405.4</td><td></td></tr><tr><td>penstrep</td><td>Wisent</td><td>450-201-EL</td><td></td></tr><tr><td>Pierce&trade;BCAの蛋白質の試金のキット</td><td>ThermoFisher Scientiffic</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Bioshop</td><td>SDS001.1</td><td></td></tr><tr><td>脱脂粉乳</td><td>Bioshop</td><td>SKI400.500</td><td></td></tr><tr><td>TC20 自動化された細胞カウンターBiorad</td><td></td><td>1450102</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin-EDTA(0.25%)</td><td>Wisent</td><td>325-043-EL</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Bioshop</td><td>TRS003.5</td><td></td></tr><tr><td>トリットンX-100</td><td>バイオショップ</td><td>TRX506</td><td></td></tr><tr><td>トリパン</td><td>ブルーGIBCO</td><td>15250-061</td><td></td></tr>トゥ<tr><td>イーン-20</td><td>バイオショップ</td><td>TWN510.500</td><td></td></tr></tbody></table>

タンパク質アルギニンメチルトランスレシーゼ1-9細胞内活性を研究する定量的方法

Quantitative Methods to Study Protein Arginine Methyltransferase 1-9 Activity in Cells

タンパク質メチルトランスファー酵素(PRMT)は、基質タンパク質のアルギニン残基へのメチル基の転移を触媒します。PRMTファミリーは、アルギニン残基を単メチル化または対称/非対称的にジメチル化することができる9つのメンバーから構成されています。様々なタンパク質のアルギニンメチル化の異なるタイプを認識するいくつかの抗体が利用可能です;従って、PRMT活性バイオマーカーアッセイの開発のためのツールを提供する。PRMT抗体ベースのアッセイは、重なり合う基質とモチーフベースの抗体特異性により困難です。これらの問題と個々のPRMTによって寄与するアルギニンメチル化を調査するための実験的なセットアップが議論されている。9つのPRMTのうち8つのバイオマーカーである代表的な基質を慎重に選択して、PRMT活性アッセイのパネルを設計しました。ここで、細胞アッセイ用のプロトコルは、細胞内のPRMTファミリーの個々のメンバーの酵素活性を定量的に測定する方法が報告されている。上記の方法の利点は、細胞培養および蛍光ウェスタンブロット機能を備えたあらゆる実験室でのそれらの簡単な性能である。基質特異性および選択された抗体信頼性は、ノックダウンおよび過剰発現アプローチで完全に検証された。アッセイバイオマーカーおよび抗体の詳細なガイドラインに加えて、PRMTのためのインヒビターツール化合物コレクションの使用に関する情報も提供される。

これらのプロトコルは、細胞内のタンパク質アルギニンメチルトランスファーゼ(PRMT)ファミリーの個々のメンバーの酵素活性を評価するために使用される方法論を提供する。内因性および外因性バイオマーカー、メチルアルギニン認識抗体、および阻害剤ツール化合物を用いたPRMT活性評価に関する詳細なガイドラインが記載されている。

Protein methyltransferases (PRMTs) catalyze the transfer of a methyl group to arginine residues of substrate proteins. The PRMT family consists of nine ...

この手順の目標は、細胞内のプロテインアルギニンメチルトランスレシーゼファミリーの個々のメンバーの酵素活性を測定することです.活性は、定量的蛍光ウェスタンブロッティングを使用して、アルギニンメチル化レベルおよびバイオマーカータンパク質の総レベルを決定することによって測定される。記載された方法の利点は、細胞培養および蛍光ウェスタンブロット機能を有するあらゆる実験室での簡単な性能である。バイオマーカー、抗体および阻害剤2つの化合物に関する詳細なガイドラインが記事に記載されています。ここでは、実験手順に関わる重要なステップについて説明しました。そして、手順は24ウェル形式で示されています。まず、リシスバッファーを調製し、使用前にベンゾナーゼおよびタンパク質阻害剤カクテルを新たに添加する。井戸からすべてのメディアを削除します。100マイクロリットルPBSで洗浄し、60マイクロリットルの溶菌バッファーをウェルに加えます。室温で1分間インキュベートし、プレートを揺らし、細胞の上にリシスバッファーを分配する。その後、20%SDSの3マイクロリットルを加えて1%濃度を見つけ、穏やかな揺れで混ぜます。リセートをエペンドルフチューブに移し、氷の上に置いておく。BCAタンパク質アッセイキットを使用してサンプルのタンパク質濃度を決定するか、溶液中の1%SDSを許容する他の方法を使用してください。リシスバッファーでタンパク質濃度を調整した後、サンプル全体で4回の負荷バッファーの20マイクロリットルで60マイクロリットルの細胞ライセートに、そして5分間95度で加熱します。リシスバッファーにベンゾナスを添加すると核酸を急速に加水分解し、細胞のリゼート粘度を低下させる。ベンゾネーゼを使用したリセートは粘性がありません。ベンゾナーゼのないライセートは、紡いだときにペレットを与えないグーイDNAの大きなグロブを有する。ヒストンタンパク質の全細胞ライセートの5〜20マイクログラム、および勾配4〜12ビストリスタンパク質ゲル内の他のタンパク質の20〜100マイクログラムに負荷を与えます。周囲の緩衝液としてモップのゼリーの周りを100ボルトで約2時間、または青色のローディング染料がゲルの底に達するまで。湿式移送を行う場合は、アイスコールドトリスグリシン転送バッファーにトランスファーサンドイッチを組み立てます。メタノールに浸漬してPVDF膜を活性化し、前のアセンブリーの30秒前に移動バッファーにゲルを平衡化します。メーカーの指示に従ってスポンジのフィルターペーパー、PVDF膜およびゲルを置きます。トリスグリシン移動バッファー内のタンパク質を 70 ボルトで氷上で 1 ~ 1 時間半転送します。転写後、ブロックバッファーで30分間膜をインキュベートする。洗浄バッファーでリンスし、一次抗体を一晩4度でインキュベートする。翌日、洗浄バッファーで5分間膜を3回洗浄し、蛍光標識二次抗体を室温で30分間インキュベートし、洗浄バッファーで5分間3回洗浄します。蛍光ウェスタンブロットイメージャーのガラス板に膜を下に置きます。ゴムシートで覆い、気泡を取り除きます。700および800ナノメートルで信号を読みます。スキャンが完了したら、画像に移動し、バンドをはっきりと見るために700と800チャンネル信号を調整します。ここで赤色として示される700チャネル信号は、全タンパク質レベルを表し、800チャネル信号は緑色で示し、メチル化タンパク質のレベルを表す。次に、分析に移動し、中央値の上と下の読み取り値を選択します。バンドの強度を測定するには、長方形描画ツールを選択し、数値化するバンドの周囲に図形を描画します。700 チャンネルと 800 チャンネルの強度を見つける図形に移動します。シグナルと呼ばれる列は、背景を減算した強度レベルを提供します。結果は、Excel ファイルに直接コピーできます。以下に、PRMT型1阻害物質MS023による細胞阻害時のPRMT1活性の分析を示す例である。PRMT1活性はヒストンH4アルギニン3不斉ジメチル化レベルを決定することによって測定される。ここで、メチル化レベルは、緑色のバンドが用量依存的に下がり、総ヒストンレベルは赤いバンドは変わらない。化合物IC50を決定するために、ヒストンH4アルギニン-3不斉ジメチル化レベルに対する阻害剤濃度の対数をプロットし、ヒストンレベルを合計して非線形適合分析を行う。記載された方法は、細胞内のタンパク質メチルトランスファーゼの活性の責任と再現性の二重検出を可能にする。この方法の利点は、学術ラボでアクセス可能で、ラボ機器に応じて簡単に変更できる、よく知られたウェスタンブロッティング方法論を利用できることです。本稿では、各PRMTファミリーメンバーに対するバイオマーカータンパク質、抗体および化学2つの化合物を含むアッセイの詳細が提供されています。

quantitative-methods-to-study-protein-arginine-methyltransferase-1-9

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

タンパク質アルギニンメチル化酵素、すなわちクラスによって触媒。、タンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ（PRMTs）は、タンパク質内のアルギニンのメチル基の酵素添加の過程である。 インビトロメチル化アッセイは、既知または新規のPRMT基質のメチル化状態を評価するための最も信頼できるツールである。...

タンパク質アルギニンメチル化を研究するためのin vitroでメチル化アッセイで

現在のプロトコルは、機能的に相同脱ユビキチン化酵素の活性を測定する方法を詳述します。特殊なプローブは、共有結合酵素を変更し、検出を可能にします。この方法は、新たな治療標的を同定する可能性を保持しています。...

細胞株および組織試料中の脱ユビキチン化酵素の活性を測定する方法

本レポートは、リーシュマニア細胞抽出物を使用してホスファチジルエタノールアミンメチルトランスフェラーゼ活性を測定するためのin vitro酵素アッセイについて説明しています。このアッセイは、S-[Methyl-3H]adenosyl-L-methionineから内因性ホスファチジルエタノールアミンへの放射性メチル基の移動に基づいています。...

インビトロアッセイではホスファチジルメチルトランスフェラーゼ活性を測定します

部位特異的タンパク質アセチル化および/またはサクシニル化入居 (化学量論) 内因性変更後導入された変更のレシオ メトリック分析を通して全体の proteome...

部位特異的タンパク質のリジンのアセチル化のサクシニル化化学量論組成データに依存しない取得質量分析法による定量

本研究では、タンパク質安定性の変化をモニタリングし、タンパク質リガンド相互作用の親和性を推定することにより、DARTS実験のデータ解析能力を強化した。相互作用は、プロテオティック曲線と線量依存曲線の 2...

ラパマイシン/mTOR相互作用を研究するための半定量薬物アフィニティ応答性標的安定性(DARTS)アッセイ

ここで、合成またはインビトロ転写RNA上のメチルトランスフェラーゼ活性の直接分析のための抗体フリーインインビトロアッセイが記載されている。...

RNAメチルトランスフェラーゼ活性分析のための抗体フリーアッセイ

タンパク質アルギニン(R)-メチル化は、複数の生物学的経路を調節する広範な翻訳後修飾です。質量分析は、修飾ペプチド濃縮のための生化学的アプローチと組み合わせると、R-メチルプロテオームをグローバルにプロファイリングするための最良の技術です。ここでは、ヒト細胞における全体的なR-メチル化を高信頼で同定するために設計されたワークフローについて説明します。...

質量分析に基づくプロテオミクスアプローチによるグローバルで信頼性の高いタンパク質R-メチル化分析

DNAメチルトランスフェラーゼは、潜在的な抗がん剤標的です。ここでは、DNAメチルトランスフェラーゼ阻害について低分子を評価するためのプロトコルが提示されています。このアッセイでは、エンドヌクレアーゼを利用してDNAメチル化と蛍光生成を結合させ、酵素活性をリアルタイムでモニタリングすることができます。...

DNAメチルトランスフェラーゼ阻害剤をスクリーニングするための連続蛍光ベースのエンドヌクレアーゼ共役DNAメチル化アッセイ(英語)

本プロトコルは、1H-NMR分光法による遊離およびタンパク質結合アルギニンおよびメチルアルギニンの調製および定量的測定を記載している。...

核磁気共鳴分光法によるアルギニンメチロームの探索

特定の阻害剤をスクリーニングするための迅速かつ正確な化学アッセイは、医薬品開発の武器庫における重要なツールです。ここでは、HAT1アセチル化活性の阻害を測定するためのスケーラブルなアセチルクリックケミストリーアッセイを紹介します。...

ヒストンアセチルトランスフェラーゼ1アセチル化を測定するためのアセチルクリックケミストリーアッセイ

学ぶPRMT1-9の細胞内酵素活性を定量的蛍光ウエスタンブロッティングで測定する手法。ヒストンH4アシメトリックジメチル化をバイオマーカーとし、阻害剤効果を評価できる標準化されたアプローチを確立した。

タンパク質アルギニンメチルトランスレシーゼ1-9細胞内活性を研究する定量的方法

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