Name: フラグメントベースのリード発見におけるスクリーニングのためのナノ差動走査フルオリメトリー (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 26 s
Description: 学ぶナノ差動走査フルオリメトリーによるフラグメントベースのリード発見スクリーニング法。ラベルフリーでタンパク質融解温度変化を測定し、SARS-CoV-2 3C-like proteaseなどの標的に対するフラグメント結合を効率的に同定できます。

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「この研究は、NKIタンパク質施設、教示エリックセンターへのアクセスの恩恵を受けました。iNEXT、プロジェクト番号653706、プロジェクト番号871037 iNEXT-Discoveryによって資金援助が提供されており、欧州委員会のHorizon 2020プログラムが資金を提供しています。

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</ol>

開示はありません。

このプロトコルは、一般的なロボット工学や計測機器を使用してフラグメントライブラリをスクリーニングするための中~高スループットの方法を説明します。このプロトコルで説明されているような画面は、アムステルダムのNKIタンパク質ファシリティによって日常的に実行することができます, 例えばiNEXT-Discoveryサービスとして, 多くの場合、提案アプリケーションやピアレビュー後にユーザーのために無料で.このような場合、DSi-Poised ライブラリは、この機能によって提供されますが、他のライブラリの使用についても、異なるユーザー アプリケーションとサービス契約のコンテキストで説明できます。このプロトコルの器械の選択は多くの実験室のための実用的な解決を表すが、金の標準として考慮されるべきではない。標識のない方法は、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応サーモサイクラーでの展開を検出するために環境に敏感なラベルを使用する方法ではなく、フラグメントスクリーニングのために標的タンパク質の熱安定性を測定するために推奨されます。
プロメテウスの器具を使用してここに示すようなラベルフリーの方法には、いくつかの利点があります:彼らはタンパク質の量が少なく、多くの場合、桁数の数桁を使用します。これらは、同時にサンプルの散乱を測定し、したがって凝集するために使用することができます。他のアプローチで展開を検出するために使用されるラベルは、各フラグメントと異なる相互作用を行い、測定アーティファクトを生じる可能性があります。このプロトコルは、手動で行うことができないサンプルの非常に少量(0.3 μL)のピペットを可能にするモスキートロボットのコンテキストで説明されています。モスキートは、構造生物学や創薬プロジェクトに取り組んでいる多くの研究室に存在する人気のロボットです。ただし、このプロトコルは、少量のピペット処理に代替アプローチを使用できます。
フラグメントライブラリには、DMSOに溶解した化合物が含まれています。初期の課題の1つは、タンパク質が安定したままで、化合物が可溶性のままである最適なDMSO濃度を見つけることです。これは、スクリーニングのための最適な条件を決定するために、様々なDMSO濃度で測定を行うことを含みます。ここで使用される希釈をフラグメント化するタンパク質は、DMSO濃度が0.2%になります。ほとんどのタンパク質は、これらの条件でかなり安定しています。768-化合物ライブラリーのスクリーニングを行う際に必要なタンパク質の量は、測定が一般的に低タンパク質濃度(0.2 mgmL-1)で行われるため、合計で〜2〜3mgである。このような比較的低いタンパク質濃度で作業すると、タンパク質の生産コストが削減されるだけでなく、タンパク質の沈殿の可能性も低下します。低タンパク質濃度はフラグメント結合の検出に影響を及ぼさず、実験中の断片の濃度が〜2mMであるため、弱い結合剤も同定できる。
これらの実験における融解遷移検出は蛍光強度に基づいているため、重要な側面は、測定を行うレーザーの励起力を決定することです。タンパク質との化合物の相互作用は、(i)その固有の蛍光に影響を及ぼさない、(ii)クエンチ、または(iii)その固有蛍光を増加させる。これに加えて、低タンパク質濃度での作業は、天然タンパク質の蛍光数が低いことを意味します。したがって、励起力は、ほとんどのサンプルを測定できるように調整する必要があります。各実行のスキャッタリング プロファイルは、フラグメントの追加によってトリガーされる可能性のある集約効果に関する重要な情報を提供します。また、化合物の溶解性に対する温度の影響は、散乱プロファイルにも見られる。
予想外に、多くの化合物に対して、温度上昇に伴って実際に散乱が減少することが観察された(図6)。したがって、融解遷移曲線とそれに付随する散乱プロファイルの両方を見て、各実験の信頼性について決定することが重要であり、特にX線結晶学またはNMR分光法によるより厳しい測定の候補と考えられている断片、あるいはフォローアップ化学のヒットと見なされる断片についても決定することが重要です。フラグメントスクリーニングの目的での方法の1つの特定の制限は、DSi-Poisedライブラリ内の多くの断片が、時には検出器の飽和限界を超えても、顕著な固有蛍光を有し、したがって、これらは低励磁力であっても標的結合のために適切にスクリーニングすることができないということです。この方法で注意すべきもう一つのポイントは、トリプトファン残基を含むタンパク質としか使用できないということです。
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62469/62469fig6v11.jpg"> 図6:化合物溶解度に対する温度の影響 2つの異なる化合物を有するHec1の融解遷移曲線および散乱プロファイル。(A)散乱プロファイルは、このサンプルの溶解度が温度の影響を受けないことを示しています。(B)散乱プロファイルは、温度上昇に伴ってこのサンプルの溶解度が高くなることを示している。したがって、この場合の融解遷移曲線は信頼できません。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62469/62469fig6v11large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
オープンな質問は、数学的な観点からではなく、実用的な観点から、Tmの有意な変化として考慮されるべきものである:Tm の変化は、タンパク質へのリガンドの結合を示すものとして考慮することが重要ですか?これらの例では、結合Hec1の断片の74%、Mps1の66%、Nsp5の53%に対して1°C未満のシフトが見られ、1°Cを「有意な変化」と考えると、フォローアップ化学によって追求するのに値するヒットはほとんど得られません。概観図(図5)では、1、2、5、または5度以上のTm シフトのビン(正または負のいずれか)が考慮された。これには、適切な概要を示し、情報に基づいた意思決定を可能にし、次のステップを決定するために、各特定のケースに応じた変更が必要です。特に、一部のタンパク質について、標的の安定化および脱安定化の両方が、考慮された断片に応じて観察された。両方のイベントは、両方のフラグメント結合の結果であり、両方ともタンパク質の挙動を操作するための良好なフォローアップ分子につながる可能性がありますので、興味深いです。
最後の質問は、「何が有用なヒットを定義するのか」というものです。実際、答えは特定の状況によって異なります。例えばHec1の場合、タンパク質を2度以上安定させたり、5度以上不安定化させたりするすべての断片は、これらのヒットに基づいて新しい分子を設計した化学の共同研究者に伝えられました。しかし、Nsp5の場合、最も安定解除ヒットはNMRの共同研究者に伝え、NMR実験でnanoDSF由来のヒットを確認しました。つまり、このプロトコルから得られたスクリーニング結果は、特定の質問と周囲の方法論に基づいて情報に基づいた意思決定を行い、注意してコンテキスト依存的な方法で分析する必要があります。いずれにしても、ここで説明する方法は、X線やNMRベースのスクリーニングなどの既存の方法論に対する補完的なアプローチであり、化学キャンペーンの確認、優先順位付け、新しいアイデアの提供を目指すことができます。
補足表S1:タンパク質のスクリーニングに使用されるバッファーのリスト。 略語: HEPES = 4-(2-ヒドロキイェチル)-1-ピペラジンタンスルホン酸;DTT = ジチオスレイトール;MOBS = 4-(Nモルフォリノ)ブタンレスルホン酸。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62469/62469_Supp_Table_S1.xlsx" target="_blank">このテーブルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足表S2:ナノディスペンサーロボットで使用するためのMRC 2ウェルプレートの特性。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62469/62469_Suppl_Table_S2.xlsx" target="_blank"></a>
補足表S3:ナノディスペンサーロボットで使用するための96ウェルVボトムプレートの特性。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62469/62469_Suppl_Table_S3.xlsx" target="_blank">このテーブルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足表S4:代表的な結果で考察したタンパク質の緩衝、タンパク質濃度、およびTm。略語: DTT = ジチオスレイトール;Hec1 = 癌 1 タンパク質で高発現;Mps1 = 単極スピンドルキナーゼ 1;Nsp5 = SARS-CoV-2 3C様プロテアーゼ<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62469/62469_Suppl_Table_S4.xlsx" target="_blank">このテーブルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足ファイル1:概要パラメータ-データ例<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62469/Supplementaty_file_1.xlsx" target="_blank"></a>。
補足ファイル 2: 406 フラグメントサンプルデータの Tmおよび ΔTm値。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62469/Supplementary_file_2.xlsx" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>

創薬プログラムは、多くの場合、薬物標的(最も頻繁にタンパク質)と相互作用および/または機能を変更する能力について化学化合物をスクリーニングすることから始まります。このような画面に見られるいわゆる「ヒット」は、新しいリードと開発候補の発見の基礎を築き、最近ライセンスされている新薬のほとんどに基づいています。したがって、ハイスループットメソッドの可用性は、膨大な数の異なる化合物を含む膨大な数の利用可能なターゲットをスクリーニングして、その緊密な結合またはターゲットの特定の機能を調節する能力を迅速に特定するために不可欠です。ヒットが特定された後、最も有望なヒットターゲットの組み合わせは、「構造活動関係」(SAR)を理解するために、他の、しばしば高価で時間のかかる技術を使用して広範な医薬品開発パイプラインに押し込まれます。
EU出資のアクセスプログラム「トランスレーショナルリサーチのためのインフラ」や現在の後継iNEXT-Discovery(iNEXT)や現在の後継的なiNEXT-Discoveryが提供する構造生物学のアプローチは、多くの場合、合成化学の数ラウンドによって初期ヒットの親和性および薬理学的特性を改善しながら、非常に詳細に多数の化合物の相互作用を研究するために使用されます。これらの「ヒットからリードへ」キャンペーンから出現する鉛化合物は、開発候補となり、前臨床試験に入ります。よく開発された分子スクリーニング方法は、リガンドベースのリード発見(LBLD)とフラグメントベースのリード発見(FBLD)の2つのアプローチに大別することができます。LBLDキャンペーンでは、タンパク質受容体は、数千個の手摘みリガンド(天然リガンドの構造または標的の構造に基づく)、または化学空間の大部分をカバーする薬物様リガンドライブラリ内の何万もの化合物のいずれかでスクリーニングされます。
通常、化合物は、活性アッセイにおいてそれらの阻害活性について試験され、典型的には酵素機能を監視する。しかし、FBLDキャンペーンでは、一般的に薬物(100-200ダルトン)よりも小さい何百もの化合物が、活性アッセイを使用せずに標的を直接結合する能力についてテストされる。この結合は標的活性を妨げる可能性があり、標的に結合する断片の能力を直接報告する多くの生物物理学的方法、またはX線結晶学6や核磁気共鳴分光法7などの構造方法によって、さらに最近では、クライオ電子顕微鏡法によって測定することができる。断片がタンパク質上で互いに近接する異なる場所で結合する場合、異なる、通常低親和性結合フラグメントを合理的に化学的に結合して、より詳細に研究できる少数のリードを作成することができる。これは、より高い親和性、より強力な化合物を頻繁に生じ、この方法論は、臨床的可能性を有する重要な分子を生み出し始めている。化学群を効率的に利用する「理想」の断片ライブラリの選択は、長年にわたり8、9、10の研究分野として活発に行われてきました。
最初は完全な化学空間をカバーすることに重点を置いていたが、その後の注意は、リード化合物を生成するために断片ヒットの下流の化学的組み合わせを可能にすることに焦点を当てた。このような研究は、いわゆる「準備された」図書館につながっています。これらはSARの研究の効率上の進歩のための急速な、安価なフォローアップ合成化学を可能にする少なくとも1つの官能基を有する断片を含んでいる。iNEXTが触媒した活動の一つは、ダイヤモンド光源と構造ゲノミクスコンソーシアムの研究者によって開発された準備された図書館を更新することであった。この組み合わせの努力は、iNEXT12内で検証された DSi-Poised ライブラリー11に生じ、その後、このライブラリは、スクリーニングのためのビルディングブロックと複合ライブラリの大規模なコレクションの化学研究組織と生産者であるEnamine Ltd.のREALデータベースで化合物の入手可能性に合わせて調整されました。DSi-Poisedは、誰でも購入できますが、サポートされているフラグメントスクリーニングプロジェクトのための多くのiNEXT-Discoveryパートナーラボでも利用できます。
ハイエンドのX線結晶学とNMR構造生物学の技術は、FBLDの長所と短所の両方があります。どちらも分離されたターゲットサンプルを必要とし、FBLDに必要な高解像度の原子詳細を生成します。しかし、X線結晶学には結晶が必要であり、断片は三次元結晶格子の構築に関与していない整えられたタンパク質領域の空洞に結合する。NMRは、結晶環境の影響を受けず、部分的に順序付けられたタンパク質領域でも結合を検出する上で良好であるため、しばしばX線結晶学とは異なるヒットを生み出します。しかし、リガンドベースのNMR実験は比較的速いですが、まだかなりの時間と材料を必要とし、比較的小さなタンパク質ターゲットまたはドメインに対してのみ日常的に行うことができます。結晶学またはNMR実験のための化合物の優先順位付けの目的のために、生物物理学的アプローチは13、14、15を使用されてきた。
近年の計測・計算プロトコルは、構造を決定し、1,000個の断片を非常に効率的に分析することで、FBLDの効率的な結晶学的スクリーニングを可能にするものであり、この優先順位付けはX線ベースの研究においてあまり重要でなくなっています。しかし、NMRの場合、ライブラリスクリーニングを優先し、最高端の機器の機器時間を節約するために、より安価で迅速な実験を使用することが望ましいままです。同時に、本質的に異なる技術の組み合わせを使用すると、結合イベントの独立した確認、あるいは結晶学またはNMR法のみを採用することによって拾われない追加のヒットを提供することができます。結晶学とNMRの技術は両方とも非常に高価な機器を必要とし、多くの場合、地元の高度に熟練した専門家の助けを借りて専用の外部施設でのみ行うことができます。また、結果の適切な分析には高い専門知識も必要です。iNEXTやiNEXT-Discoveryなどのプログラムは、このような施設へのアクセスを民主化していますが、他の方法による安価で高速でハイスループットのFBLDスクリーニングは、より広い範囲の実験室での薬物スクリーニングプログラムを奨励することができると認識されています。このような結果は、薬効化学者とのコラボレーションを構築し、NMRおよび結晶学施設がスクリーニング可能な化合物の数に制限を課す場合、最も有望な化合物に最も高価なスクリーニング実験を優先する指標として使用することができます。
TSAは、FBLDスクリーニングに使用できる迅速で効率的で比較的安価でアクセス可能な生物物理学的方法17 を形成する。これは、結晶化試験18のための安定したタンパク質条件を見つける支援から、細胞19内の特定の標的に結合する化合物を見つけるために、複数の設定で使用されてきた。TSAは、リガンド結合性標的タンパク質の解離定数を測定するためにも使用されており、リガンド結合は熱安定性の変化をもたらすことが多い。すべてのTSAにおいて、タンパク質の変性温度の変化(その安定性)は、温度上昇の遅い関数として測定される。加熱時にタンパク質変性を追う効率的な方法は、DSFまたはサーモフルターによるもので、温度上昇により展開するタンパク質の露出した疎水性領域との相互作用時に疎水性色素(典型的にはSypro Orange)の蛍光消光を定量化します。
ナノDSFは、典型的には、外部染料の不在時のタンパク質の熱安定性の測定をいう。この可能性を提供した最初の機器の1つは、サンプルの光の拡散だけでなく、光の強度の広いスペクトルを測定するOPTIM1000でした。この機械は、タンパク質の展開(典型的にはトリプトファン蛍光)とタンパク質凝集(形成されたナノ粒子として〜400nmで光散乱の増加をもたらす)の同時測定を可能にした。その後、プロメテウスは、蛍光シグナルの凝集および高感度検出を測定するためのバック反射の使用を導入し、良好な感度20で低タンパク質濃度のスクリーニングを可能にする。次のセクションでは、プロメテウスを使用して、異なるタンパク質標的のヒットを検出するためのフラグメントスクリーニングプロトコルを実証する方法について説明します。予測されるタンパク質の質と量について簡単に説明した後、フラグメントスクリーニング実験を準備、実行、分析するためのステップバイステップのプロトコルが続きます。3つのタンパク質のスクリーニング結果は、iNEXT-Discoveryコラボレーションの一環として得られたサンプルデータとして示されています。

<table><tbody><tr><td>ClearVue Sheets</td><td>Molecular Dimensions</td><td></td><td>タンパク質プレート用接着シーリングフィルム</td></tr><tr><td>CORNING 6570 アルミニウムシーリングテープ</td><td>フラグメントプレート用CORNING</td><td></td><td>接着シーリングフィルム</td></tr><tr><td>DSiポイズドライブラリ</td><td>Enamine</td><td></td><td>この研究で使用された768の化合物を含むフラグメントライブラリ</td></tr><tr><td>Elisa 試薬 Reservior</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15075</td><td>タンパク質</td></tr><tr><td>Greinerラウンド(U)底板</td><td></td>のピペッティングに使用される試薬リリザーブ <td>Cat.いいえ&nbsp;</td><td>650201 これらのプレートで供給されるフラグメント</td></tr><tr><td>モスキートタイプ X1</td><td>sptlabtech</td><td>部品 nr- 3019-0003</td><td>ナノリットルディスペンサー</td></tr><tr><td>MRC 2ウェル結晶化プレート</td><td></td><td>MRC96T-PS</td><td></td></tr><tr><td>ピアス ELISA 試薬リザーバー</td><td>ピアス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>プロメテウス 高感度毛細血管</td><td>カタログ PR-C006</td><td></td><td></td></tr><tr><td>プロメテウス NT.48 ナノDSF</td><td>ナノテンパー</td><td>カタログ nr PR001 (+アグリゲーション検出光学系、カタログ nr PR-AGO)</td><td>nanoDSFおよび光後方散乱</td></tr><tr><td>プロメテウス標準キャピラリータイプ</td><td>カタログ PR-C002</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TX-1000</td> プレート<td></td>用<td>サーモサイエンティフィック</td><td>遠心分離機</td></tr></tbody></table>

フラグメントベースのリード発見におけるスクリーニングのためのナノ差動走査フルオリメトリー

Nano-Differential Scanning Fluorimetry for Screening in Fragment-based Lead Discovery

熱シフトアッセイ(TSA)は、その環境(例えば、緩衝液組成)の変化に応じて、標的タンパク質の融解温度(Tm)がどのように変化するかを調べる。TSAの有用性、および特にナノ差動走査蛍光測定(nano-DSf)の有用性は、特定のタンパク質を安定化するのに役立つ条件を見つけ、また、見かけのTmの変化をモニタリングしてリガンド結合を見るための、長年にわたって確立されてきた。本論文では、ナノDSFを用いたダイヤモンド-SGC-iNEXTポイズド(DSi-ポイズド)フラグメントライブラリー(768化合物)の効率的なスクリーニングを提示し、Tmをモニタリングして潜在的な断片結合を同定する。ナノDSF実験を行うためのタンパク質の品質と濃度に関する前提条件は、構造生物学研究所で一般的に使用されるナノリットルロボットディスペンサーを使用して96ウェルプレートで必要なサンプルを調製するステップバイステッププロトコルを次に簡単に概説しています。プロトコルは、試薬混合物がナノDSF測定に必要な毛細血管に転送される方法を記述します。さらに、熱変性(本来のトリプトファン蛍光を監視する)と凝集(光の逆散乱を監視する)とデータ転送と分析の後続のステップを測定するためのプロトコルを提供します。最後に、3つの異なるタンパク質標的を用いたスクリーニング実験について議論し、リード発見キャンペーンの文脈におけるこの手順の使用を説明する。説明する方法の全体的な原則は、他のフラグメントライブラリに簡単に転送したり、他の機器に適応させることができます。

DSi-Poisedライブラリ(768個の断片)の全画面を、医療目的の3つのタンパク質に対して行いました。 すなわち、癌1タンパク質(Hec1、またはNdc80)において高発現した外キネコア、単極スピンドルキナーゼ1(Mps1)の調節テトラリコペプチド反復(TPR)ドメイン、およびSARS-CoV-2 3C様プロテアーゼNsp5は、11部位でポリタンパク質のC末語を切断する。各タンパク質に対して選択された緩衝条件は、タンパク質濃度およびTm のタンパク質濃度と同様に、 補足表S4に示されている。
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62469/62469fig5v12.jpg"> 図5:この研究で代表的な結果として示した3つのタンパク質Hec1,Mps1,Nsp5に対する融解温度変化の周波数分布(ΔTm)を示す。 略語: Hec1 = 癌 1 タンパク質で高発現;Mps1 = 単極スピンドルキナーゼ 1;Nsp5 = SARS-CoV-2 3C様プロテアーゼ <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62469/62469fig5v11large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
上記のプロトコルを用いた3つのスクリーニングの結果は、Tm の変化とフラグメント数の周波数分布として表示され、 図5に示されている。これらのプロットは、プロトコルのセクション5.3に記載されているように生成されており、Tmで観察された変化の頻度をプロットしている。シフトの重要性は、以下の説明セクションで説明するように、各プロジェクトの主観的な方法で定義する必要があります。負の値は、フラグメント存在下での溶融温度の低下を示し、Tmの増加を正の値とします。このようなプロットから、Nsp5では全ての断片が不安定な効果を有し、Hec1とMps1の場合は、安定と不安定性の両方のヒットが観察されることを容易に観察できる。これは期待でき、議論されるでしょう。

標的タンパク質の溶融温度の変化をモニタリングする(すなわち、熱シフトアッセイ、TSA)は、数百化合物の断片ライブラリーをスクリーニングするための効率的な方法である。フラグメントスクリーニング用の固有トリプトファン蛍光と光逆散乱をモニタリングするためのロボット工学支援ナノ微分走査蛍光測定(nano-DSF)を実装するTSAプロトコルを発表する。

Thermal shift assays (TSAs) examine how the melting temperature (Tm) of a target protein changes in response to changes in its environment (e.g., buffer ...

このプロトコルは、有望なフラグメントを熱候補として選択するための追加ツールとして、フラグメント化ベースのリード検出キャンペーンに役立ちます。フラグメントスクリーニング用のナノDSOは、限定された非標識タンパク質サンプルを使用し、ほぼすべてのタンパク質標的に日常的に使用することができます。この方法は、リガンドの任意のコレクションをスクリーニングするために使用することができます。または他の方法からの熱を確認する。マイナス20度またはマイナス80度の冷凍庫からフラグメントプレートを取り出し、ベンチトップシェーカーで穏やかに揺れて室温で解凍させます。プレートを500倍Gで30秒間遠心し、井戸の側面に付着した滴を集める。マルチチャネルピペットを使用して、MRC 2ウェル結晶化プレートとピペット15マイクロリットルのタンパク質ストック溶液を各サブウェルに取り込みます。モスキートの断片およびタンパク質プレートの定義を確認するには、ナノディスペンサーのスイッチを入れ、移動するコンポーネントの周りに障害物がないことを確認します。グラフィカルユーザーインターフェイスを開き、[設定]タブをクリックし、[デッキ構成]で、化合物が供給され、タンパク質が転送されたプレートの種類が利用可能なプレートのリストにすでに存在するかどうかを確認します。それがない場合は、[オプション]をクリックし、[プレート]をクリックして、プロパティ タイプの正しい値を入力して新しいプレート定義を作成します。[設定]タブで、[デッキ構成]の下でプレートの位置を指定します。ドロップダウンメニューを使用して、位置1にグレインなU底プレートを選択し、位置2にMRC 2ウェルプレートを選択し、プロトコルを保存します。フラグメントプレートを1桁に置き、プロテインプレートをデッキの2桁に配置します。プロトコルタブで、[ファイル]をクリックし、フラグメントを分配するために前の手順で保存したプロトコルを選択します。分配される断片の体積を0.3マイクロリットルとして定義します。列 1 と 12 の一般的なプレートでは、フラグメントを含まない場合は、開始位置から 2 列目、および列 11 までの終了位置を定義します。プレートによっては、列 2 または 11 が空の場合、列 3 と 10 を開始値と終了値として使用します。[実行] をクリックしてプログラムを起動します。約2分かかる塗布後、ロボットからタンパク質とフラグメントプレートを取り出し、接着シールフィルムで密封します。タンパク質プレートをGの500倍の30秒間短く遠心し、次のステップに進む前にウェルの側面に付着した任意の滴を収集する。タンパク質プレートの井戸の中で、断片の添加によって発生した可能性のある沈殿物を視覚的に検査します。沈殿が多くのウェルで観察される場合は、断片の濃度を下げ、実験を繰り返します。プロメテウスの楽器のスイッチを入れて下さい。タッチスクリーンで、引き出しを開いて、器具のキャピラリーローディングモジュールにアクセスします。ローディングモジュールから磁気ストリップを取り外し、ミラーをエタノールで洗浄して、ほこりを取り除きます。タンパク質断片プレートから毛細血管に溶液を移すには、タンパク質プレートとキャピラーを器具の隣に置いて、キャピラリーローディングモジュールに簡単にアクセスできます。片方の端にキャピラリーを持ち、タンパク質プレートの溶液をキャピラリーのもう一方の端に触れてサンプルを転送します。手袋は必ず着用し、手袋からの不純物が測定に影響を与えるため、真ん中の毛細血管に触れないようにしてください。キャピラリーをホルダーの指定位置に配置し、正しく位置合わせおよび中央揃えになっていることを確認し、これらの手順を繰り返して、ローディングモジュール内のすべての位置を埋めます。最後に、キャピラリーの上に磁気ストリップを置いて所定の位置に保持し、引き出しを閉じるを押してNano-DSF実験を開始します。プロメテウスアプリケーションPRを開きます。ThermControlをクリックして新しいプロジェクトを作成し、新しいセッションを開始します。まず、サンプルの蛍光を検出するための探索スキャンを行います。レーザーの励起力を調整して、サンプルの蛍光信号を変化させます。熱変性の場合は、溶融スキャンタブをクリックし、開始温度を摂氏20度、終了温度を摂氏95度、温度勾配を1分あたり1°Cに設定します。次に、[計測を開始]をクリックします。外側、運動、又は癌1タンパク質において高度に発現した変化および融解温度の周波数分布、単極スピンドルキナーゼ1の調節性テトラトリコペプチド反復ドメイン、およびSARS-CoV-2 3c様プロテアーゼをここに示す。負の値はフラグメント存在下での溶融温度の低下を示し、正の値は溶融温度の上昇を示します。Nsp5では、すべてのフラグメントに安定化解除効果があるのに対し、Hec1とMps1では、安定化ヒットと安定化解除ヒットの両方が観察されます。これは、フラグメントライブラリをスクリーニングするための安価で迅速な方法です。NMRやX線結晶学などの他の方法は、断片の正確な結合を示し、INX発見を通じても利用可能です。コロナウイルスプロテアーゼの結果は、COVID-19に対する薬物に開発することができる新しい化合物を提案するのに役立ちました。

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