D11 scFv-アルカリホスファターゼ融合タンパク質と免疫蛍光を用いた組織中のイソレブグランジンの直接検出(英語)
2021年7月5日
この記事では、アルカリホスファターゼ結合ScFv D11抗体を使用した免疫蛍光法による組織内のイソレブグランジンの測定のための詳細な方法論を提供します。マウスとヒトの両方の高血圧モデルは、組織サンプル中のイソレブグランジン測定に関連する段階的な手順と基本原理を説明するために使用されます。
イソレブグランジンは、いくつかの疾患、特に心血管疾患に関与しています。このプロトコルは、D11アルカリホスファターゼ融合タンパク質および免疫蛍光を有する組織中のイソレブグランジンを検出するために開発されました。現在の検出方法は高価であるか、Eタグ用の二次抗体が必要です。
信頼性の高い二次抗体を見つけることは困難ですが、このプロトコルは二次抗体ステップを排除します。マウスおよびヒトパラフィン包埋組織のスライドをキシレンに3回5分間浸して、組織を脱パラフィン化します。組織を再水和するには、組織を95%エタノールで2回洗浄し、続いて70%エタノールで2回洗浄し、次に水中で調製した50%エタノールで2回洗浄します。
スライドホルダーにTBSTを満たして、0.1%Tween 20を含むトリス緩衝生理食塩水でスライドを3回洗浄します。次に、TBSTを破棄します。スライドを予熱したクエン酸ナトリウムバッファーに入れ、高圧で4分間に設定した圧力鍋でインキュベートし、合計抗原回収時間は20分です。
インキュベーションの終わりに、圧力鍋からスライドを取り出し、室温で20分間冷却します。示されているように、TBSTでスライドを3回すばやく洗浄します。TBSTに溶解した2%BSAを加えてスライドをブロックします。
スライドをパラフィンテープで覆い、室温で15分間インキュベートする。インキュベーション後、ブロッキングバッファーを廃棄します。TBSTで調製した200マイクロリットルのD11アルカリホスファターゼをスライドに加え、スライドをパラフィンテープで覆います。
スライドを加湿チャンバー内で室温で3時間インキュベートした後、スライドをTBSTで3回洗浄します。免疫組織化学用の熱量測定アルカリホスファターゼ現像液、または免疫蛍光用の蛍光アルカリホスファターゼ現像液を使用してスライドを開発します。スライドをTBSTで一度洗浄して余分な現像液を取り除き、それ以上の発色を防ぎます。
免疫蛍光のためにPBSで調製した1ミリリットルあたり1マイクログラムのHEX核染色剤でスライドを対比染色します。次に、スライドをTBSTで一度洗浄して、余分な対比汚れを取り除きます。封入剤を使用して、現像したスライドにカバースリップを置きます。
免疫組織化学用の倒立光学顕微鏡、または免疫蛍光用の共焦点蛍光顕微鏡でスライドを観察します。イソレブグランジンに対するD11 AP染色の特異性を確認するために、4つの陰性対照実験を行うことができる。最初の陰性対照実験では、TBSTで希釈したD11 APまたはTBSTのみで組織をインキュベートします。
次に、希釈したD11 APと、D11 APリンカーなしでTBSTで希釈した細菌パリプラス体抽出物で組織をインキュベートします。競合アッセイのために、マウス血清アルブミンに付加されたisoLGおよびisoLGを8対1のモル比で調製します。D11 APをTBSTで1から10に希釈します。
次に、希釈したD11 APを50マイクログラム/ミリリットルのイソレブグランジン付加MSA、または非付加MSAとともに室温で1時間インキュベートします。イソレブグランジンMSAを含むD11 APまたは非付加MSAを含むD11 APを染色のために組織に追加します。関連する一本鎖フラグメント可変抗体D20を使用して、最終的な陰性対照セットの組織を染色します。
高血圧および正常血圧マウスにおける大動脈の免疫蛍光を、このプロトコルを用いて研究した。D11 APによる染色は、対照マウスと比較して、アンジオテンシンII誘発性高血圧症のマウスの大動脈におけるisoLGの濃度の増加を示した。D11 APは、高血圧および正常血圧のヒト患者の腸組織に存在するイソレブグランジンを検出するために使用されました。
高血圧患者の組織はイソレブグランジンの濃度が上昇していた。組織は、パリプラスコード抽出物およびD11 APなしで染色した。D11 APで染色した組織では、パリプラスミック抽出物染色組織と比較して明るい染色が観察され、染色がパリプラス体抽出物に存在する非結合細菌アルカリホスファターゼによるものではないことが確認されました。競合アッセイでは、isoLG競合製品とプレインキュベートしたD11 APで染色された組織は、イソレブグランジンに対するD11 APに対する特異性を示すD11 APで観察された染色と同様に、染色の減少を示しました。
陰性対照では、マウス大動脈をD11 APで染色すると、D20と比較して強い染色が得られ、高血圧大動脈のイソレブグランジンに対するD11 APの特異性を示しました。バックグラウンド染色を制限するには、組織に存在する内因性アルカリホスファターゼを不活性化することが重要です。
概要
本研究では、アルカリホスファターゼ標識D11抗体を用いた免疫蛍光法により、組織試料中のイソレブグランジンを測定する新しい手法を提示します。マウスおよびヒトの高血圧モデルを用い、イソレブグランジン検出の信頼性を高めるためのステップバイステップの手順を詳述します。
研究の主要構成要素
研究領域
- 心血管疾患
- 免疫学
- 組織解析
背景
- イソレブGLANDINは、主に心血管疾患をはじめとするいくつかの疾患に関与しています。
- 現在の検出法では二次抗体が必要であり、プロトコルが複雑になっています。
- 本研究では、二次抗体の必要性を省くことで、このプロセスを簡略化します。
使用された手法
- D11アルカリホスファターゼ融合タンパク質を用いた免疫蛍光染色
- マウスおよびヒトの組織サンプル
- 組織標本作製、抗原賦活化、および染色の詳細な段階的プロトコル
主な結果
- D11 AP染色により、高血圧の大動脈では対照群と比較してイソレブグランドジンのレベルが高いことが示されました。
- ヒト患者の組織においても、高血圧の個体でイソレブグランドジンの濃度が上昇していることが認められました。
- さまざまな対照実験を通じて、D11 APの特異性が確認されました。
結論
- 本研究は、イソレブグランドを検出するための信頼性の高い手法を提示しており、心血管研究に有用なツールを提供します。
- これらの知見は、高血圧および関連疾患におけるイソレブグランドの重要性を強調するものです。
よくある質問
産業界における重要性
組織におけるイソレブグランジンなどの反応性脂質メディエーターの検出は、心血管疾患における炎症経路を理解する上で極めて重要です。現在の手法は労力がかかり費用も高いため、標的バリデーションやメカニズム研究におけるスループットが制限されています。本免疫蛍光法は、IsoLG蓄積の直接的かつ特異的な可視化を可能にし、高血圧および関連疾患における仮説駆動型スクリーニングやトランスレーショナルなバイオマーカー探索を支援します。
バイオ医薬品研究開発における戦略的応用
初期探索およびターゲット検証
- 科学的価値： 疾患モデルにおける脂質過酸化のメカニズムの読み取りとして、IsoLG-タンパク質付加体形成の解析を可能にする。
- 運用の価値： 二次抗体の必要性を排除したダイレクトイメージングアプローチを提供し、アッセイの複雑さとばらつきを低減する。
- 予測的価値： ヒトおよびマウス組織におけるIsoLGの蓄積を高血圧表現型に関連付けることで、ターゲットのデリスキングをサポートする。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 科学的価値： 組織コンパートメントにおけるIsoLGの局在について、空間的に分解された定量的な蛍光リードアウトを生成します。
- 運用上の価値： 比色検出と蛍光検出の両方に対応したアルカリホスファターゼ発色剤を使用しているため、プラットフォームの柔軟性が確保されています。
- 拡張性： パラフィン包埋組織アーカイブと互換性があり、臨床検体の遡及的解析が容易になります。
トランスレーショナルおよび前臨床研究
- 翻訳の連続性： 高血圧マウスモデルとヒト患者組織の両方で有効性が実証されており、種を越えた妥当性が裏付けられています。
- バイオマーカーの整合性： 心血管疾患における酸化ストレスの潜在的な翻訳バイオマーカーとして、IsoLG負荷の評価を可能にします。
- メカニズムによるリスク低減： 病理生理学的状況におけるターゲット結合の可視化を可能にし、ターゲットバリデーションにおける因果推論を強化します。
パイプラインおよびワークフローの統合
本法は、ターゲット仮説の検証から前臨床バリデーションに至るディスカバリー・コンティニュアムに適合し、特に心血管プログラムにおける酸化ストレス経路の解析に有用です。
- 発見生物学： 関連組織での直接検出を可能にすることで、IsoLG関連メカニズムの機能的検証を支援します。
- スクリーニング： ラボ間でのアッセイ標準化に適した、再現性のある定量的なイメージング出力を生成します。
- 分析： 空間的および強度に基づくリードアウトを提供し、実験条件間でのIsoLG蓄積の比較を容易にします。
- トランスレーショナルリサーチ： 前臨床での知見をヒト組織解析へと結びつけ、リスク調整に基づいた進展の意思決定を支援します。
- エンタープライズ再利用： さまざまな疾患領域に適用可能な、脂質アドダクト検出のための再利用可能な免疫組織化学/免疫蛍光プラットフォームを構築します。
運用および企業への影響
- 科学的価値：IsoLGが介在するタンパク質架橋および炎症に関するメカニズム的な知見を提供します。
- 運用上の価値：二次抗体への依存を排除し、ワークフローを簡素化し、試薬ロット間のばらつきを低減します。
- 戦略的価値：酸化ストレスバイオマーカーの明確で特異的な読み取り結果を提供することで、より迅速な意思決定（go/no-go判断）を可能にします。
- ポートフォリオへの影響：脂質過酸化経路に関与するターゲットのリスクベースの優先順位付けを支援します。
実施上の留意点
- 免疫蛍光顕微鏡法および組織処理プロトコルの専門知識が必要です。
- アルカリホスファターゼ発色システムおよび適切な顕微鏡（共焦点または倒立顕微鏡）へのアクセスに依存します。
- ブロッキング、抗原賦活化、および洗浄ステップについて、ユーザー間での標準化が必要です。
- 新鮮凍結組織または凍結切片への適応には、プロトコルの最適化が必要な場合があります。
- 背景信号を最小限に抑えるため、内因性アルカリホスファターゼ活性を不活化させる必要があります。
