Name: ラット膝の周期的負荷誘発関節内軟骨病変モデルを生成するための非侵襲的方法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-05T14:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 4 s
Description: 学ぶ ラット膝関節への周期的圧縮負荷による非侵襲的軟骨病変誘導法。手術を伴わず、経験の浅い操作者でも再現可能な関節軟骨損傷モデルを構築し、変形性関節症の病態研究に応用できます。

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本研究の一部は、JSPS科研費助成(JP18H03129、JP18K19739)の助成を受けて行われました。 この研究はまた、Eunice Kennedy Shriver国立小児保健人間発達研究所(NICHD)、国立神経障害・脳卒中研究所(NINDS)、および国立衛生研究所の国立生物医学画像生物工学研究所(NIBIB)の支援を受けているAlliance for Regenerative Rehabilitation Research & Training(AR3T)からも資金提供を受けています。内容は著者の責任であり、必ずしも国立衛生研究所の公式見解を表すものではありません。

京都大学動物研究委員会(承認番号:医学教17616)により承認されました。
1.ラットの膝に in vivo 周期的圧迫を実行します
<ol><li>実験動物の麻酔を誘発する<ol><li>麻酔ボックス内の5%イソフルラン溶液を吸入することにより、12週齢のWistarラット(256.8 ± 8.7 g)に麻酔を誘発します。.</li>
		<li>メデトミジン、ミダゾラム、ブトルファノールを含む3種類の麻酔薬9の混合物をラット体重2 mg / kgで腹腔内注射し、右膝関節周辺を剃ります。.つま先ピンチへのペダル反射の欠如による十分な麻酔を確認します。</li>
	</ol></li>
	<li>麻酔をかけたラットを固定装置に取り付けます。<ol><li>麻酔をかけたラットを腹の上に置き(図1)、右膝を凹状の溝のある樹脂片に取り付けます。右後肢を股関節伸展、膝屈曲、足首伸展の位置に置き、膝を約140°曲げます。可動器具のくさび形の溝にラットのかかとを収容します。</li>
		<li>固定装置を応力/引張試験装置に移動します( 材料の表を参照)。ロードセルとの接触がないことを確認したら、応力/引張試験機制御ソフトウェア(材料表)を開き、[ キャリブレーション ]ボタンをクリックします。キャリブレーション後、フレームの上部をロードセルに慎重に取り付けます。膝関節をフレームにしっかりと取り付けたままにするには、可動式のメイン操作パネルの回転ノブを、予圧が5Nに達するまでゆっくりとオンにします。</li>
	</ol></li>
	<li>荷重方法を構築し、圧縮試験を設定します。<ol><li>メインメニューで、[新しいメソッドの作成]をクリックします|システムラベル。[テスト モード] を [サイクル] に設定し、[テスト タイプ] を [圧縮] に設定します。[センサー] ラベルをクリックし、[テスト] タブを選択して、制限が 60 N 以内であることを確認します。さらに、[ストローク]タブを選択し、制限が500mm以内であることを確認します。 注意: 上記の手順では、応力点に大きな変位がある場合、操作がすぐに停止します。</li>
		<li>テストコントロールラベルの下で、成長の起源を選択して、0.3%/フルスケールでメインプログラムを開始します。荷重サイクルの4つのセクションのうち、第1および第3セクションの制御ストローク速度を1mm/sに設定します。2番目のセクションの最大試験力を20Nに設定し、4番目のセクションの最小試験力を5Nに設定します。 「保持期間」をピーク負荷の場合は0.5秒、最小負荷の場合は10秒に設定します(図2)。 注意: この手順ではすべてのサイクルを定義するため、ジョイントサーフェスが互いに接触し、妥当な速度で移動していること、およびモーションが維持されていることを確認してください。</li>
		<li>ページの下部にある[ プリロード ]タブで、[オン]が オン になっていること、[ たわみ除去速度 ]が100 mm/minに設定され、 最大力 が5 Nであることを確認します。[ 試験片] ラベルで、[ 材料 ]を [金属]に設定します。 注: これらの詳細設定は、製造元ごとに異なる場合があります。</li>
		<li>[メイン] メニューの [メソッドとテストの選択] セクションで、ビルドしたメソッドを選択し、[開始] をクリックしてテストを開始します。 注意: 下部の表は、ピーク荷重と変位の実際の測定値を示しています。</li>
		<li>サイクル数を60に設定します。 注意: ロードセッション全体には60サイクルが含まれ、約12分続きます。対照群では、ラットは同じ条件下で12分間プレロードのために5Nプレロードを受けた。</li>
	</ol></li>
	<li>ロード後、ラットをケージに戻し、完全に回復するまで監視します。十分なスペースと食物の自由でケージ内で12〜12時間の明暗スケジュールを維持します 。 必要な実験期間の後、分析のために腹腔内または二酸化炭素吸入(1時間〜8週間)に注射された3つの麻酔薬の混合物の過剰摂取でラットを屠殺する。</li>
</ol>

<ol><li>De Souza, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-invasive+axial+loading+of+mouse+tibiae+increases+cortical+bone+formation+and+modifies+trabecular+organization%3A+a+new+model+to+study+cortical+and+cancellous+compartments+in+a+single+loaded+element%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Non-invasive axial loading of mouse tibiae increases cortical bone formation and modifies trabecular organization: a new model to study cortical and cancellous compartments in a single loaded element.</a> Bone. 37 (6), 810-818 (2005).</li>
<li>Poulet, B., Hamilton, R. W., Shefelbine, S., Pitsillides, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+a+novel+and+adjustable+noninvasive+murine+joint+loading+model%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+and+Rheumatism%22%5BJournal%5D)">Characterizing a novel and adjustable noninvasive murine joint loading model.</a> Arthritis and Rheumatism. 63 (1), 137-147 (2011).</li>
<li>Wu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+response+of+mouse+joint+tissue+to+noninvasive+knee+injury+suggests+treatment+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+and+Rheumatism%22%5BJournal%5D)">Early response of mouse joint tissue to noninvasive knee injury suggests treatment targets.</a> Arthritis and Rheumatism. 66 (5), 1256-1265 (2014).</li>
<li>Poulet, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intermittent+applied+mechanical+loading+induces+subchondral+bone+thickening+that+may+be+intensified+locally+by+contiguous+articular+cartilage+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+Cartilage%22%5BJournal%5D)">Intermittent applied mechanical loading induces subchondral bone thickening that may be intensified locally by contiguous articular cartilage lesions.</a> Osteoarthritis Cartilage. 23 (6), 940-948 (2015).</li>
<li>Ko, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progressive+cell-mediated+changes+in+articular+cartilage+and+bone+in+mice+are+initiated+by+a+single+session+of+controlled+cyclic+compressive+loading%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Orthopaedic+Research%22%5BJournal%5D)">Progressive cell-mediated changes in articular cartilage and bone in mice are initiated by a single session of controlled cyclic compressive loading.</a> Journal of Orthopaedic Research. 34 (11), 1941-1949 (2016).</li>
<li>Adebayo, O. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+subchondral+bone+properties+and+changes+in+development+of+load-induced+osteoarthritis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+Cartilage%22%5BJournal%5D)">Role of subchondral bone properties and changes in development of load-induced osteoarthritis in mice.</a> Osteoarthritis Cartilage. 25 (12), 2108-2118 (2017).</li>
<li>Ko, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+cyclic+compression+causes+cartilage+degeneration+and+subchondral+bone+changes+in+mouse+tibiae%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+and+Rheumatism%22%5BJournal%5D)">In vivo cyclic compression causes cartilage degeneration and subchondral bone changes in mouse tibiae.</a> Arthritis and Rheumatism. 65 (6), 1569-1578 (2013).</li>
<li>Ji, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+in+vivo+cyclic+compressive+loading+on+the+distribution+of+local+Col2+and+superficial+lubricin+in+rat+knee+cartilage%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Orthopaedic+Research%22%5BJournal%5D)">Effects of in vivo cyclic compressive loading on the distribution of local Col2 and superficial lubricin in rat knee cartilage.</a> Journal of Orthopaedic Research. 39 (3), 543-552 (2021).</li>
<li>Kawai, S., Takagi, Y., Kaneko, S., Kurosawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+three+types+of+mixed+anesthetic+agents+alternate+to+ketamine+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Animals%22%5BJournal%5D)">Effect of three types of mixed anesthetic agents alternate to ketamine in mice.</a> Experimental Animals. 60 (5), 481-487 (2011).</li>
<li>Iijima, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Destabilization+of+the+medial+meniscus+leads+to+subchondral+bone+defects+and+site-specific+cartilage+degeneration+in+an+experimental+rat+model%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+Cartilage%22%5BJournal%5D)">Destabilization of the medial meniscus leads to subchondral bone defects and site-specific cartilage degeneration in an experimental rat model.</a> Osteoarthritis Cartilage. 22 (7), 1036-1043 (2014).</li>
</ol>

著者は利益相反を宣言しません。

現在のプロトコルは初めて、マウス2などの小さなげっ歯類の関節内損傷モデルと同様に、ラットの外側大腿骨顆に負荷誘発軟骨病変のモデルを確立する方法を示しています。しかし、マウスの負荷プロトコルは重度の骨棘形成と十字靭帯病変を引き起こし、周期的圧迫の効果を評価するのに理想的ではありませんでした。現在のプロトコルは、はるかに低い負荷力でラットに限局性軟骨病変を作成しました。適切な大きさ、速度、および持続時間のストレスのみが骨組織に損傷を与えることなく軟骨を破壊できるため、正しい負荷方法の設定はプロトコルにとって重要です。
変位限界の設定(プロトコルステップ1.3.1)は、靭帯が破裂した場合、またはラットが負荷セッション中に麻酔から目覚めた場合に機器を直ちに停止するため、非常に重要です。最適な最大負荷およびラットの年齢はまだ決定されていない。しかし、予備実験では、50Nを超える荷重により、ラットの膝にACL破裂の可能性が高い。さらに、現在のモデルは、おそらく成長が起こるにつれて軟骨の硬さのために、高齢(>36週齢)ラットで再現するのが困難です。...

伝統的に、前十字靭帯(ACL)の切断または内側半月板の不安定化は、小動物の心的外傷後変形性関節症(PTOA)の調査に最適であると考えられてきました。近年、非侵襲的な周期的圧縮モデルがPTOAの研究に使用されています。このモデルはもともと機械的負荷に対する海綿骨の反応を調査するために設計され1、その後、PTOA研究2,3,4,5,6の非外科的動物モデルとして変更されました。理論的根拠は、一連の炎症反応を引き起こす周期的な外力を加えることによって関節軟骨を衝突させることです。しかし、このモデルはマウスにのみ適用されており、より大きな動物への負荷の適切な大きさは議論されていませんでした。
以前のモデルの別の問題は、大量のプロトコルに含まれるサイクルが多すぎるため、いくつかのサンプルで軟骨下骨の過度の肥厚、望ましくない副作用を引き起こしたことです7。そこで、大型動物に適した大きさで負荷の副作用が低い新しい周期圧縮法が開発されました8。現在の記事の全体的な目標は、ラットの非侵襲的周期的圧迫モデルのプロトコルを説明し、軟骨変性の代表的な結果を観察することです。現在のプロトコルは、ラットへの非侵襲的周期的圧縮モデルの適用に関心のある読者を助けるでしょう。

<table><tbody><tr><td>小動物用麻酔器</td><td>信濃製作所</td><td>SN-487-0T</td><td></td></tr><tr><td>オートグラフ AG-X</td><td>島津製作</td>所 <td>N.A.</td><td>プレシジョンユニバーサル/引張試験機</td></tr><tr><td>Fluoview FV10i顕微鏡</td><td>Olympus Corp</td><td>N.A.</td><td>全自動共焦点レーザー走査型顕微鏡</td></tr><tr><td>イソフルラン吸入液</td><td>ファイザージャパン株式会社</td><td>(01)14987114133400</td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEA Viability/Cytotoxicity Kit</td><td>サーモフィッシャー・サイエンティフィック・ジャパン</td><td>L3224</td><td>細胞の生存率を素早く簡単に判断できる2色アッセイ</td></tr><tr><td>TRAPEZIUM X Software</td><td>島津製作</td><td>所</td><td>Autograph AG-X用データ処理ソフトウェア</td></tr></tbody></table>

ラット膝の周期的負荷誘発関節内軟骨病変モデルを生成するための非侵襲的方法

A Non-Invasive Method for Generating the Cyclic Loading-Induced Intra-Articular Cartilage Lesion Model of the Rat Knee

原発性変形性関節症(OA)の病態生理は不明のままである。しかし、比較的若い年齢層におけるOAの特定の下位分類は、関節軟骨損傷および靭帯剥離の病歴と相関している可能性が高い。膝のOAの外科動物モデルは、心的外傷後OAの発症と進行を理解する上で重要な役割を果たし、この病気の新しい治療法の開発に役立ちます。しかし、非外科的モデルは、介入の評価に影響を与える可能性のある外傷性炎症を回避するために最近検討されている。 
この研究では、 in vivo 周期圧縮負荷によって誘発される関節内軟骨病変ラットモデルが開発され、研究者は(1)局所軟骨損傷を引き起こす可能性のある負荷の最適な大きさ、速度、および持続時間を決定することができました。(2)軟骨細胞の活力における心的外傷後時空間病理学的変化を評価する。(3)関節圧縮荷重に対する適応および修復メカニズムに関与する破壊的または保護的分子の組織学的発現を評価する。この報告では、ラットモデルにおけるこの新しい軟骨病変の実験プロトコルについて説明します。

20 Nの周期負荷を受けたサンプルの軟骨細胞の生存率の短期的変化(1時間および12時間)の代表的な結果が得られました。 図3に示すように、死骸軟骨細胞数(赤色蛍光)は外傷後12時間で増加した。逆に、生きた軟骨細胞の数(緑色蛍光)は減少し続け、患部に生きた軟骨細胞を含まないサンプルもありました。
組織学的には、20N動的荷重を受けたラット膝の関節軟骨が損傷しており、すべてのサンプルで外側大腿骨顆に1つの限局性病変ゾーンが確認されました(図4)。しかし、病変の大きさは8週間の観察期間中に徐々に増加しなかった。病変と影響を受けていない軟骨の界面に対応する境界が患部に観察された。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62660/62660fig01.jpg"> <s...

本稿では,ラットの大腿骨顆軟骨損傷を20N以上60回周期的に圧迫することにより生じたラット膝の周期的荷重誘発関節内軟骨病変モデルを提示する.

The pathophysiology of primary osteoarthritis (OA) remains unclear. However, a specific subclassification of OA in relatively younger age groups is likely ...

このプロトコールは、動物、より大きな動物において、いかなる外科的介入または動物の膝の構造的破壊もなしに軟骨損傷を引き起こすことが可能であることを示している。最大の利点は、経験がなくてもオペレーターが反復的であることが判明し、これはどの外科的方法でも達成するのが難しいことです。麻酔をかけたラットを固定装置に取り付けることから始めます。麻酔をかけたラットを腹の上に置き、右膝を凹溝のある樹脂片に取り付けてベースプレートに置きます。右後肢を股関節伸展、膝の屈曲、足首伸展の位置に置き、膝を約140度曲げます。可動器具のくさび形の溝にラットのかかとを収容します。固定装置を応力および引張試験装置に移動し、ロードセルとの接触がないことを確認します。応力および引張試験装置の制御ソフトウェアを開き、キャリブレーションボタンをクリックします。キャリブレーション後、フレームの上部をロードセルに慎重に取り付けます。可動式のメイン操作パネルの回転ノブを、予圧が5ニュートンに達するまでゆっくりとオンにして、膝関節をフレームにしっかりと取り付けたままにします。メインメニューで、[新しいメソッドとシステムラベルの作成]をクリックします。テストモードをサイクルに設定し、テストタイプを圧縮に設定します。センサーラベルをクリックし、テストタブを選択して、制限が60ニュートン以内であることを確認します。次に、ストロークタブを選択し、制限が500ミリメートル以内であることを確認します。テストコントロールラベルの下で、成長の起源を選択して、0.3%またはフルスケールでメインプログラムを開始します。1番目と3番目のセクションの制御ストローク速度を毎秒1ミリメートルに設定し、2番目のセクションの最大テスト力を20ニュートンに、4番目のセクションの最小テスト力を5ニュートンに設定します。全体の期間をピーク負荷の場合は 0.5 秒、最小負荷の場合は 10 秒に設定します。ページの下部にある[プリロード]タブで、[オン]がオンにチェックされ、たわみ除去速度が毎分100ミリメートルに設定され、最大力が5ニュートンであることを確認します。試験片ラベルで材料を金属として設定します。メインメニューの[メソッドとテストの選択]セクションで、ビルドしたばかりのメソッドを選択し、[開始]をクリックしてテストを開始します。サイクル数を60に設定します。ロード後にラットをケージに戻し、分析の時間になるまで十分なスペースと食物を自由に摂取したケージ内で12〜12時間の明るい暗いスケジュールを維持します。20ニュートンの周期負荷を受けたサンプルにおける軟骨細胞の生存率の短期的な変化を研究しました。死んだ軟骨細胞の数は、外傷後12時間で増加しました。逆に、生きている軟骨細胞の数は減少し続けました。20ニュートンの動的負荷を受けたラット膝の関節軟骨が損傷し、すべてのサンプルで外側大腿骨顆に1つの限局性病変ゾーンが確認されました。病変の大きさは8週間の観察期間中に徐々に増加しなかった。病変と影響を受けていない軟骨の界面に対応する境界が患部に観察される可能性があります。最も重要なことは、試験力とサイクル数の適切な設定です。この技術により、血液の関節被覆への機械的負荷を制御することができ、機械的負荷が変形性関節症の発症または予防にどのように影響するかを探る道を開くことができる。

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ラット膝の周期的負荷誘発関節内軟骨病変モデルを生成するための非侵襲的方法

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