患者由来腫瘍オルガノイドを用いたイン ビトロ アッセイのハイスループット

患者由来の腫瘍オルガノイドは、疾患の再現性を高め、腫瘍組織の構造と機能を正確に再現する。したがって、抗癌薬に対する患者の反応は、このモデルを用いて正確に評価することができる。腫瘍オルガノイドは、培養中のクラスター形成が大きいため、インビトロ高スループットアッセイシステムや細胞分析には適していません。

この技術を用いて、分子標的薬の評価のための簡単で正確なHTSが開発された。オルガノイド培養は2D培養とは大きく異なるため、最初は文化に混乱を感じるかもしれませんが、オルガノイドの形態変化を注意深く観察することが重要です。液体窒素貯蔵から凍結した卑劣を取り除いた後、患者由来の腫瘍オルガノイドを摂氏37度の水浴中で1分間静かに攪拌する。

水浴から下品を取り除き、70%エタノールで拭きます。その後、バイオセーフティキャビネットにバイアルを置きます。オルガノイド用培地を含む15ミリリットルのチューブに腫瘍オルガノイドを移す。

3ミリリットルの移入ピペットを使用して、腫瘍オルガノイドとミディアムを5回上下にピペットで軽く混合します。遠心分離によって腫瘍オルガノイドを下にペレット.上清を捨て、腫瘍オルガノイドペレットを5ミリリットルの新鮮な培地で再懸濁する。

腫瘍オルガノイド懸濁液をT25フラスコに移し、摂氏37度と二酸化炭素5%でインキュベートする。最初の通過の1週間後、2つのT25フラスコからの腫瘍オルガノイド懸濁液を2つの遠心分離管に移し、遠心分離によって腫瘍オルガノイドをペレットダウンさせる。腫瘍オルガノイドペレットの体積を推定し、1管当たりの新鮮な培地の2.5ミリリットルでペレットを再懸濁します。

腫瘍オルガノイド懸濁液を1本のチューブに溜めます。プールした懸濁液を10ミリリットルの新鮮な培地を含むT75フラスコに移し、摂氏37度と二酸化炭素5%でインキュベートします。24時間の中程度の変化の後、70マイクロメートルのメッシュフィルターを含むフィルターホルダーを装備した細胞の断片化および分散器を用いて腫瘍オルガノイドをミンチする。

15ミリリットルの腫瘍オルガノイド懸濁液を10倍希釈する。細胞懸濁液ディスペンサーを使用して、384ウェル超低アタッチメントスフェロイドマイクロプレートで希釈された腫瘍オルガノイド懸濁液の40マイクロリットルを種付けします。24時間後、液体ハンドラを使用して、20マイクロモルからウェル内の1.0ナノモルの最終濃度範囲で10の連続希釈液から0.04マイクロリットルの試験剤溶液を添加し、プレートを6日間インキュベートします。

インキュベーションの終了時に、細胞内ATP測定試薬を試験井戸に添加する。ミキサーを使用してプレートの内容物を混合し、約25°Cで10分間インキュベートします。プレートリーダーを使用して、細胞内ATP含有量を発光として測定します。

3回目の通路の24時間後、セルピッキングおよびイメージングシステム上の目的地プレートと同様に、40マイクロリットルの媒体を備えた384ウェル超低添付着ススフェロイドマイクロプレートを配置します。6ミリリットルの培養培地と遠心分離機を1,500倍Gで2分間製造し、気泡を除去します。ピッキングチャンバーに腫瘍オルガノイド懸濁液を4マイクロリットル加え、選液室をシステムにセットします。

セルクラスターが分散後1分間チャンバーの底に落ち着き、チャンバースキャンを開始します。セルクラスタを自動選択するには、システム上でピッキングサイズを140~160マイクロメートルに設定します。次に、スキャンした画像上の選択したセルクラスターの品質を確認し、選択チップを使用して目的地プレートに1ウェルあたり10個のセルクラスターを転送します。

現在の研究では、抗癌剤が患者由来の腫瘍オルガノイドに及ぼす影響を評価した。全ての抗癌剤に対する高感度は、曲線値が282未満の領域における2マイクロモル未満の半最大阻害濃度値によって示された。抗体依存性細胞毒性評価のために、2つの異なる抗体の存在下で腫瘍オルガノイドの細胞化率を測定した。

%細胞化は時間とともに増加した。エフェクターと標的細胞比を1対1のエフェクターとの6時間で行わなかった場合、細胞化は45%に達したが、細胞化は70%に達し、トラスツズマブを用いたナチュラルキラー細胞媒介細胞は、1対1のエフェクター細胞比で約60%、1時間の1時間で80%の割合であった。対照的に、セツキシマブは、ナチュラルキラー細胞媒介細胞に依存する用量の影響を及ぼした。

セツキシマブの最高濃度では、エフェクターで90%の細胞増殖が観察され、1対1の標的細胞比で観察され、100%細胞化が2対1の割合で観察され、セツキシマブの高い効果を示した。患者由来の腫瘍オルガノイドを用いた高スループットアッセイシステムは、潜在的な抗がん剤の評価よりも優れ、薬物評価の機会と個別化医療の進歩を提示します。