Name: 患者由来腫瘍オルガノイドを用いたイン ビトロ アッセイのハイスループット (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 25 s
Description: 学ぶ 患者由来腫瘍オルガノイドを用いたハイスループットアッセイ法で、抗がん剤の効果を正確に評価する手法です。ATP測定と抗体依存性細胞傷害性アッセイにより、個別化医療への応用が期待されます。

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本研究で使用される臨床標本を提供した患者さんに感謝します。本研究は、福島県のトランスレーショナル研究プログラムの助成金により支援されています。

ヒト由来物質に関する実験はすべてヘルシンキ宣言の下で行われ、福島医科大学倫理委員会によって事前に承認されました(承認番号1953年と2192年、承認日は2020年3月18日、2016年5月26日)。書面によるインフォームド・コンセントは、本研究で使用された臨床標本を提供したすべての患者から得られた。
1. PPOの文化
注: F-PPO は、さまざまな異種形態を示し、懸濁液培養で増殖する細胞クラスターを形成します (図 1)。さらに、F-PPOは6ヶ月以上培養することができ、将来の使用のために凍結保存することができる。
<ol><li>保存されたPPOの解凍(0日目)<ol>
<li>0日目の解凍および種子PPO(例えば、RLUN007、肺腺癌)(図1)。まず、B-27サプリメントの1%を含むPPO用培地の培地15mL( 材料表参照)を加え、表皮成長因子の30ng/mLを無菌50 mL遠心チューブに加えます。</li>
		<li>液体窒素貯蔵から凍結バイアルを取り除いた後、37°Cの水浴でPPOを2分間静かに攪拌する。次に、水浴からバイアルを取り出し、70%エタノールでバイアルを拭き取り、バイアルを生物学的安全キャビネットに移動させます。</li>
		<li>PPO用の15mLの培地を含むチューブにバイアルの内容物を移します。PPOとミディアムを3mLトランスファーピペットで5回軽くピペットで混ぜます。チューブを200xgで3分間~25°Cで遠心し、上清を捨てます。 PDOペレットを5mLの新鮮な培地に再び懸濁し、穏やかなピペットで25cm2フラスコ(材料表を参照)に移します。最後に、PTOを5%CO2で37°Cで培養する。</li>
	</ol>
</li>
	<li>週に 2 回 (日 3 から 7) のメディアを変更します。PDO懸濁液を遠心分離して細胞クラスターを沈殿させ、培地の4mL(体積80%)に置き換える。新鮮な培地の細胞を再中断します。 メモ:RLUN007の大部分は、直径100~500μmのセルクラスタとして表示されます。図 1Aに示すように、培地中のフェノール赤の色が黄色に変わると、より頻繁に培地を交換してください。交換の日に媒体が黄色に変わり、各セルクラスタが合流して直径500μm >の大きなクラスタを形成する場合、1:2の分割比で通過します。</li>
	<li>PPOのサブカルチャー(日8-28) 注:実際に単一細胞数を測定することの難しさを考えると、通過のタイミングは、適切な細胞クラスター密度と遠心分離後のPDOペレットのサイズに基づいて決定されます(図1B)。RLUN007の場合、PDOペレットの体積は解凍後約2週間で30μL(25cm2フラスコの飽和密度)に達します。<ol>
<li>25cm2フラスコ(P1)を2本の2本のフラスコ(P1)に移す場合は、PDO懸濁液を遠心管に移し、200xgで遠心分離機を200xgで約25°Cで2分間移動します。 PDOペレットの体積を推定し、上清を捨てます。5 mL ピペットを使用して PDO ペレットを 5 mL の新鮮な培地で再懸濁します。ピペットは低速で5回優しく上下します。次に、PDO懸濁液(2.5mL)の体積の半分を2つのフラスコに移し、各フラスコに2.5mLの新鮮な培地を加えます。細胞を5%CO2で37°Cで培養する。</li>
		<li>2つの25cm2フラスコから1つの75cm2フラスコ(P2)への移管のために、2つのフラスコからのPDO懸濁液を2つの遠心管に移し、PDOを200 x gで約25°Cで2分間遠心分離する。 次に、PDOペレットの体積を推定し、ペレットを2.5mLの新鮮な培地(チューブ当たり)で再懸濁する。その後、PDO懸濁液を一方のチューブと他方のチューブに組み合わせ、10mLの新鮮な培地を含む75cm2フラスコに移します。細胞を5%CO2で37°Cで培養する。サブ培養PPOを2つの25cm2フラスコから、最初の通路の約1週間後に1つの75cm2フラスコに移す(図1C)。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 成長阻害 HTS
注: PPOに対する抗癌剤の増殖抑制活性は、 図2に示すように、細胞内ATP含有量を測定することによって評価される。このステップは、市販の細胞生存アッセイキットを使用して実行されます( 材料表を参照)。
<ol><li>0日目に、PPO(RLUN007など)をフラスコで培養し、アッセイに十分な数の細胞クラスターが利用できるようになるまで行います。1日前に、PDO懸濁液を75cm2フラスコから15mLチューブに移し、遠心分離機を200xgで2分間移し、PDOペレットの体積を測定します。 次に、PDOペレットを15mLの新鮮な培地に再び懸濁し、75cm2フラスコに戻します。細胞を5%CO2で37°Cで培養する。 注:必要なPDOペレットの量は、PDOの希釈速度とアッセイに使用される384ウェルプレートの数によって異なります。RLUN007では、384ウェルプレート10個にシードするために200μLのセルペレット体積が必要です。</li>
	<li>1日目(培地交換後24時間)に、70μmメッシュフィルタを含むフィルタホルダーを使用して、細胞の断片化および分散装置( 表を参照)を使用してPPOをミンチします。次いで、PDO懸濁液の15mLを10倍希釈した。PDO懸濁液のシード40 μLを、セルサスペンションディスペンサーを使用して384ウェル超低添付スフェロイド(丸底)マイクロプレート( 材料表を参照)に入れます( 材料表を参照)。 注: 細胞クラスターを細かく刻む場合は、市販のセルの断片化および分散装置を使用することをお勧めします( 資料表を参照)。</li>
	<li>播種後の24時間(2日目)に、PPOを0.04 μLのテスト剤溶液で、液体ハンドラを使用して20μM〜1.0 nM(10シリアル希釈)の最終濃度範囲で液体処理器を使用して処理します( 材料表を参照)。</li>
	<li>8日目(被験物質処理後144時間)に、細胞内ATP測定試薬を試験井戸に添加する。ミキサーでプレートを混ぜ、25°Cで10分間インキュベートします。 プレートリーダーを使用して、細胞内ATP含有量を発光として測定します( 材料表を参照)。</li>
	<li>セルの生存率を計算するには、テスト井戸の ATP の量を、車両を含む制御井戸の量で、背景を減算して除算します。6日間にわたる成長率を計算するには、シーディング後24時間の車両制御井戸での車両制御井戸内のATP量を除算する。</li>
	<li>生物学的データ解析ソフトウェアを用いて、線量応答曲線から50%の阻害濃度(IC50)および曲線下面積(AUC)値を計算する(材料表参照)。Z ファクターは、1 (無限分離) から <0 までの範囲の無次元パラメータで、Z = 1 - (3σc+ + 3σc-) / |μc+ - μc-| で定義され、σc+σ、σ-、μc+、および μc- は、高(c++)と低(c-c-コントロール)の標準偏差(σ)と平均(μ)です。</li>
</ol>3. 細胞の摘出と成長抑制のためのイメージングシステムを備えたHTS
注:プロトコル2を使用してデータに大きな偏差がある場合(アッセイ時の変動係数[CV]が20%を超える場合)、選択されたサイズのPPOは、セルピッキングおよびイメージングシステムを使用して96ウェルまたは384ウェルプレートに播種することができます(図2)。このプロトコルは、前のセクションのステップ 2.1 および 2.2 で説明したものと同じです。このステップは、市販のセルピッキングおよびイメージングシステムを使用して実行されます( 表の材料参照)。
<ol><li>1日目には、40 μLの培地/ウェルの投射先プレートを持つ384ウェル超低接続スフェロイドマイクロプレートと、セルピッキングおよびイメージングシステムのデスティネーションプレートをセットします。</li>
	<li>6 mLの培養培地と遠心分離機を1,500 x gで6 mLで、気泡を除去するために、ピッキングチャンバー(材料表を参照)を充填します。培地に懸濁したPDO(PDOペレット容量、4μL)をピッキングチャンバーに追加し、システムにセットします。</li>
	<li>セルクラスターがチャンバーの底に落ち着くように、少なくとも1分間チャンバーを立て、その後分散液を続ける。その後、チャンバーのスキャンを実行します。</li>
	<li>セルクラスタの自動選択を行うシステムで、ピッキングサイズを140-160 μm(面積15,386-20,000 μm2)に設定します。次に、スキャンした画像上の選択したセルクラスターの品質を確認し、選択チップ(「材料表」を参照)を使用して、ウェルごとに 10 個のセル クラスターを宛先プレートに転送します。</li>
	<li>手順 2.3 以降のプロトコルステップを実行します。</li>
</ol>4. HTS抗体依存性細胞傷害性
メモ:このステップは、電気インピーダンス測定器である市販 のシステム(材料表を参照)を使用して実行されます。モノクローナル抗体およびナチュラルキラー(NK)細胞を用いた抗体依存性細胞傷害(ADCC)によるPTOの細胞化を評価するために使用される(図3)。NK細胞は、メーカーの指示に従って、NK細胞製造キット( 材料表を参照)を用いて末梢血単核細胞から作製されます。
<ol><li>ADCC活性の測定<ol>
<li>0日目には、96ウェルプレート( 材料表を参照)に50 μLの10 μg/mLフィブロネクチン溶液(0.5 μg/well)を一晩4°Cでコーティングします。</li>
		<li>1日目に、フィブロネクチン溶液を除去した後、50μLの培養培地を各ウェルに加えて、バックグラウンドインピーダンスを測定する。</li>
		<li>播種する前に、5 mLの細胞培養解離試薬(材料表を参照)をPDO(RLUN007:75cm2フラスコのPDOペレット100μL)に加え、CO2インキュベーターを37°Cでインキュベートして20分間培養してPDOを分散させます。トリプシンを止めるには、5 mLの培地、遠心分離機を加え、解離試薬を除去します。40 μmのセルストレーナーを通して新鮮な培地とフィルターでPPOをリンスします(材料表を参照)。</li>
		<li>細胞生存率分析器を使用してセルの数をカウントします (「 材料表」を参照)。</li>
		<li>PDO懸濁液を貯留槽に移し、マルチチャンネルピペットを使用して混合します。PDO懸濁液を96ウェルプレートの5 x 104 細胞/ウェルのウェルに追加します。各ウェルには、100 μL の最終ボリュームが含まれています。その後、プレートを生物学的安全キャビネットに約25°Cで30分間置きます。</li>
		<li>37 °CのCO2 インキュベーターでプレートを器具に移します。 インピーダンス信号の変化を15分ごとにセルインデックスとして記録します。</li>
		<li>PDO播種と同じ日に37°Cの水浴中のNK細胞を解凍します。バイアルからNK細胞用培地10mL(材料表参照)を含む15mLチューブに細胞を移し、遠心分離機を約25°Cで5分間300xgで移動します。 上清を捨て、新鮮な培地の10mLで細胞ペレットを再懸濁します。セルカウント後、細胞密度を1 x 106セル/mLに調整し、75cm2フラスコに移します。NK細胞を37°Cで5%CO2インキュベーターで培養する。</li>
		<li>2日目に、滅菌V-底96ウェルプレートの最終濃度の10倍の抗体溶液(リン酸緩衝生理食塩基)を調製します。</li>
		<li>各ウェルから60 μLの培地を取り出し、10 μLのトラスツズマブまたはセツキシマブ溶液(10 μg/mL、1 μg/mL、0.1 μg/mL)をPDUに加えます。プレートをインキュベーターの計器に戻し、セルインデックスを1時間記録します。</li>
		<li>NK細胞懸濁液を50mLチューブに移し、セル数を数えます。細胞を5分間300 x g で遠心分離し、PDOs用の培地でNK細胞密度を1 x 106 細胞/mL、2 x 106 細胞/mLに調整します。</li>
		<li>ターゲット(RLUN007)セル比1:1または2:1のエフェクター(NK)セルに50μLのNK細胞懸濁液を加えます。抗体の最終濃度は1 μg/mL、0.1 μg/mL、0.01 μg/mLです。プレートを約25°Cで15分間保ち、プレートを器具に戻します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>データ収集と分析<ol>
<li>解析ソフトウェアを使用してセルインデックスを%細胞分析値に変換します( 材料表を参照)。</li>
		<li>細胞化率とは、NK細胞と標的細胞(PTO)単独で殺される標的細胞の割合をコントロールとして指す。各時点でのサンプルウェルのインデックスから、NK細胞のみを含むウェルのセルインデックスを引きます。抗体の添加直前の細胞指標に各値を正規化します。次の式を使用して正規化された細胞指数を%細胞増殖率に変換します: % 細胞増殖性 = (1 - 正規化された細胞指数 [標本ウェル]) / 正規化された細胞インデックス (ターゲット単独ウェル) x 100.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

富士フイルムワコバイオソリューションズ株式会社は、ライセンス譲渡によるF-PDOおよびF-PDOメディアの商業オーナーである富士フイルムワコピュアケミカルズの子会社です。

PDUの特徴は、培養中やアッセイ中に単一細胞に酵素的に分離されず、培養中の細胞クラスターを維持するということです。したがって、細胞数は顕微鏡下で正確に数えることができない。この問題を解決するために、細胞数は、50〜200μLのレベルでマークされたチューブを有する細胞を含む遠心チューブを裏打ちすることによって視覚的に決定される(図1B)。さらに、25cm2フラスコで培養した細胞クラスターのペレット体積を目視で測定することは困難であるため、通過時間は、赤から黄色への色変化が赤から黄色に変化し、単一細胞またはデブリの顕著な増加を指標として通過する時間と比較して決定した(図1A、C)。これがPPOの合格点です。PDOペレットの量は、各培地変化で遠心分離後に視覚的に測定される。ペレット体積が増加しなくなり、培地交換後の日に培地が黄色に変わると、培地は濃度で飽和していると考えられ、通過処理が行われる。ペレットの体積は、PDO ごとに定義されます。PDOが増殖しない場合、培地交換時に培地量が80%から50%に変化し、培養中にPDOの密度が増加します。
PDUに適したHTSを開発しました。そのスループットは、PDOの1つの75 cm2 フラスコを使用して行われる少なくとも10〜20の384ウェルプレートであり、1日あたりのプレートの処理数は少なくとも50です。また、PDUを用いたHTSによる各種抗がん剤の評価結果は既に報告されている。
HTSを行う場合、セル断片化や分散装置を用いたF-PPOの細量化によるメッシュフィルタの目詰まりは、フィルタのメッシュサイズを100μmに変更することで、最初に対処される。次のステップは、ガラス容器に塗布されるPDO懸濁液の体積を減らすことである。HTS用の被験物質溶液を調製する場合、低分子化合物は通常ジメチルスルホキシドに溶解し、抗体はリン酸緩衝生理食塩水に溶解する。被験物質として適切な溶媒を用い、使用した溶媒から制御データが得られる。
以下は、アッセイデータの変動性に対処する方法の説明です。384ウェルプレートを用いた試験データに大きなばらつきがある場合は、アッセイプレートを96ウェルプレート形式に変更する必要があります。PDO希釈係数(シード細胞クラスター数)も、プレートを播種した後に調べる。最後に、細胞のピッキングおよびイメージングシステムは、アッセイのためのPTOのサイズを選択するために使用することができる。チャンバにPPOを追加する前に、PPOを正しく認識できるように、単一細胞および小細胞クラスターを低速遠心分離によって除去する必要があります。チャンバにPPOを加えた後に単一細胞または小細胞クラスターが見える場合、複数の分散を行って単一細胞を除去することができます。次に、細胞のピッキングおよびイメージングシステムは、プレートを暖かく保つ機能を有するが、この機能は、システムが長期間働いているときに培養培地が蒸発するため使用されない。最後に、セルクラスタの体積は平面イメージによって認識されるため、不明です。さらに、複数の PDO が重複している場合、1 つの PDO が正しく認識されません。ただし、移動後にスキャンした画像でチェックすることで、削除機能を使用して不要なPPOを削除することができます。
電気インピーダンス測定器は、一般に、細胞増殖時のインピーダンスの変化を監視するために、接着対象癌細胞に使用されます。したがって、非接着性PPOのセルインデックスの変化は検出されません。この問題を解決するためには、PDOの種類に応じてPDO密度や酵素処理(細胞解離酵素や処理時間)などの播種条件を調べる必要があります。プレート内のウェルは、PPOを播種するための適切な細胞外マトリックスでコーティングする必要があります。PDOの種類に応じて、PDOは酵素処理なしで播種されます。RLUN007は、PPOを酵素処理で分散させた後、96ウェルプレートにPPOを播種してインピーダンスを測定するために使用されました。RLUN007を37°Cで20分間細胞培養解離試薬で処理し、細胞を分散させ、96ウェルプレートのウェルに取り付けました。解約されたRLUN007細胞が即座に凝集体を形成することを考えると、ストレーナーを使用して濾過した直後にプレートにシードすることが望ましい。細胞懸濁液をチューブからリザーバに移した後、貯留槽を2~3回ゆっくりと右から左に移動させ、プレートに播種する前に5回上下にパイプを入れた。懸濁液はウェルに添加する各々と混合した。プレートは、30分間(PPO用)または15分間(NK細胞用)の生物学的安全キャビネットに置かれ、細胞がウェル内に均等に分配されるようにしました。第2の重要な点は、抗体およびNK細胞による治療は、細胞指数が高原に達し、値が0.5以上になる前に、時間を計るべきである。RLUN007の場合、メッキ後のアッセイ開始に最適な時間は20~22時間で、播種用のセル数は5×104セル /ウェルです。
一般に、腫瘍オルガノイドの培養およびアッセイは、Matrigelなどの細胞外マトリックスを使用して、トリプシンやコラゲラーゼなどの腫瘍組織足場または酵素を作成してオルガノイド3、4、5、6、7を破壊する。この方法の利点は、培養およびアッセイ(電気インピーダンス測定器を用いたアッセイを除く)の間に細胞外マトリックスや酵素処理が必要とされない点で、人件費やコストを大幅に削減できる点です。さらに、この方法はHTSアッセイシステムや各種測定システムに比較的容易に適応できます。しかし、細胞外マトリックスの使用は、細胞の足場として機能し、組織における形態形成、分化、およびホメオスタシスに影響を与える可能性があるため、いくつかの研究目的で望ましい。
本研究では、EGFR阻害剤に臨床的に感受性を有するEGFR突然変異(L858R)を有するPPO(RLUN007)及びEGFR遺伝子の高発現(データは示されていない)を用いて、EGFR阻害剤を評価した。EGFR阻害剤に対するRLUN007の感受性は、他の肺癌由来F-PPO13の感度よりも高いことが実証された(図4)。したがって、腫瘍組織の特性を保持するPPOを用いたHTSは、潜在的な抗癌剤の評価に優れ、薬物評価の機会と個別化医療の進歩を提示する。HTSは薬剤の初期スクリーニングには適しているが、腫瘍微小環境を再現しないため、生体内での薬物の有効性を評価できない。そこで、動物モデルがない場合に血管内皮細胞や他の間質細胞や臓器オンチップ技術との共培養により生体内のヒト腫瘍組織を模倣できるインビトロシステムが開発中である。

ヒトがん細胞株は、がんの生物学を研究し、抗がん剤を評価するために広く受け入れられています。しかし、これらの細胞株は、それらの形態、遺伝子変異、および遺伝子発現プロファイルが長期間にわたって培養中に変化する可能性があるため、必ずしもそれらの元の組織の元の特性を維持する必要はありません。さらに、これらの細胞株の大部分は、単層で培養されるか、またはマウス異種移植片として使用され、いずれも腫瘍組織1、2を物理的に表していない。したがって、抗癌剤の臨床有効性は、癌細胞株で観察されたものと同じではないかもしれない。そこで、患者由来の腫瘍異種移植片や患者由来の腫瘍オルガノイド(PPO)や腫瘍組織の構造や機能を正確に再現する腫瘍スフェロイドモデルを用いたex vivoアッセイなどのインビトロシステムが開発されている。証拠の増加は、これらのモデルが対応する癌組織に直接匹敵することによって抗癌剤に対する患者の反応を予測することを示唆している。これらのin vitroシステムは、異なる腫瘍組織タイプに対して確立されており、薬物スクリーニング用の関連高スループットアッセイシステム(HTS)も3、4、5、6、7に開発されている。患者または患者由来腫瘍異種移植片から得られた原発性腫瘍の異種ex vivoオルガノイド培養は、培養の容易さと、間質組織8、9、10における細胞の複雑さを維持する能力のために、近年かなりの牽引力を得ている。これらのモデルは、がんの生物学の理解を深め、インビトロでの薬物有効性の評価を促進することが期待されます。
最近、福島トランスレーショナル研究プロジェクトの下で、F-PDOに指定されたさまざまな種類の腫瘍組織から一連の新しいPDOが作成されました。PPOは、ソース腫瘍と同様の形態を有する大細胞クラスターを形成し、6ヶ月以上培養することができる11。比較組織学と包括的な遺伝子発現解析は、PPOの特徴が、培養条件下で長期増殖した後でさえ、その源腫瘍組織の特徴に近いことを示した。さらに、96ウェルおよび384ウェルプレートのPDOの種類ごとに適切なHTSが確立されました。これらのアッセイは、いくつかの分子標的剤および抗体を評価するために使用した。ここでは、子宮内膜癌に用いられる標準的な化学療法薬(パクリタキセルおよびカルボプラチン)を、パクリタキセルおよびカルボプラチンに反応しなかった患者由来のF-PDOを用いて評価した。したがって、このPDOに対するパクリタキセルおよびカルボプラチンの細胞増殖阻害活性は弱かった(IC50:>10μM)。さらに、以前の研究では、化学療法薬および分子標的剤に対するいくつかのF-PPOの感受性が臨床有効性11、12、13と一致することが報告されている。最後に、抗癌剤によって引き起こされるPPOの高次構造の変化を、3次元細胞分析システム12,13を用いて分析した。PDOベースのHTSを用いた抗癌剤の評価の結果は、これらの薬剤について得られた臨床結果と同等である。ここでは、PDOモデルを用いて抗がん剤および免疫療法の効力を評価するために使用できる、より単純で正確なHTSのためのプロトコルが提示される。

<table><tbody><tr><td>384ウェル超低アタッチメント回転楕円体マイクロプレート</td><td>Corning</td><td>4516</td><td>HTS</td></tr><tr><td>40-&micro用プレート;m セルストレーナー</td><td>コーニング</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>AdoptCell-NKキット</td><td>コージンバイオ</td><td>16030400</td><td>キット NK細胞産生用</td></tr><tr><td>がん細胞増殖培地 プラス</td><td>富士フイルム和光純薬</td><td>032-25745</td><td>F-PDO用培地</td></tr><tr><td>ALyS505N-175</td><td>Cell Science &Technology Institute</td><td>10217P10</td><td>Medium for NK cells</td></tr><tr><td>CELL HANDLER</td><td>Yamaha</td> <td>Motor-Cell</td> <td>picking and imaging system</td></tr><tr><td>CellPet FT</td> <td>JTEC-Cell</td> <td>fragmentation and dispersion equipment</td><td></td></tr> <tr><td>CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay</td><td>Promega</td><td>G9683</td><td>Cell Viability luminescent Assay, intracellular ATP measuring reagent</td></tr><tr><td>Echo 555</td><td>Labcyte</td><td>-</td><td>リキッドハンドラー</td></tr><tr><td>EnSpire</td><td>PerkinElmer-Plate</td><td></td> <td>reader</td></tr><tr><td>E-plate VIEW 96</td><td>Agilent</td><td>300601020</td><td>プレートは、xCELLigence RTCAシステム、</td></tr><tr><td>フィブロネクチン溶液</td>、<td>富士フイルム和光純薬</td>、<td>063-05591</td><td>xCELLigence RTCAシステム用プレートコーティング</td></tr>、<tr><td>F-PDO</td><td>で細胞ベースのアッセイを行うために特別に設計されています富士フイルム和光純薬または住商ファーマシューティカルズインターナショナル</td><td>-</td><td>F-PDOは、富士フイルム和光純薬または住商ファーマシューティカルズインターナショナル</td></tr><tr><td>Morphitソフトウェア、バージョン6.0</td>から購入できます <td>エッジソフトウェアコンサルタント</td><td></td><td>生物学的データ分析ソフトウェア</td></tr><tr><td>Multidrop Combi</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>5840300</td><td>細胞懸濁液ディスペンサー</td></tr><tr><td>プレシジョンチャンバー</td><td>ヤマハJLE9M65W230発動機</td><td></td><td>CELL HANDLER</td></tr><tr><td>Precision Tip</td> ヤマハ<td>発JLE9M65W300</td><td></td><td>CELL HANDLERを使用した細胞クラスターピッキング用マイクロチップ</td></tr><tr><td>RLUN007</td><td>富士フイルム和光純薬または住商ファーマシューティカルズ International</td><td></td><td>肺腫瘍由来 F-PDO</td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12604021</td><td>Cell culture解離試薬</td></tr><tr><td>Ultra-Low Attachment 25 cm&sup2;フラスコ</td><td>コーニング</td><td>4616</td><td>PDO用培養フラスコ</td></tr><tr><td>超低アタッチメント 75 cm&sup2;フラスコ</td><td>コーニング</td><td>3814</td><td>PDO</td></tr><tr><td>Vi-CELL XR 細胞生存率アナライザーシステム</td><td>用 ベックマン・コールター</td><td>-</td><td>細胞生存率アナライザー</td></tr><tr><td>xCELLigence 免疫療法ソフトウェア、バージョン 2.3</td><td>ACEA Bioscience-xCELLigence</td><td></td> <td>RTCA システム用 分析ソフトウェア</td></tr><tr><td>xCELLigence RTCA System</td><td>ACEA Bioscience</td><td>-</td><td>電気インピーダンス測定器細胞溶解</td></tr></tbody></table>

患者由来腫瘍オルガノイドを用いたイン ビトロ アッセイのハイスループット

High-Throughput In Vitro Assay using Patient-Derived Tumor Organoids

患者由来の腫瘍オルガノイド(PPO)は、従来の細胞培養モデルよりも疾患の再現性が高い前臨床癌モデルであることが期待されている。PPOは、腫瘍組織のアーキテクチャと機能を正確かつ効率的に再現するために、さまざまなヒト腫瘍から正常に生成されています。しかし、PPOは、抗がん剤のサイズが不均一であり、培養中に大きなクラスターを形成するため、抗がん剤を評価する際に96ウェルまたは384ウェルプレートを使用した インビトロ ハイスループットアッセイシステム(HTS)または細胞分析には不適当です。これらの培養およびアッセイは、Matrigelなどの細胞外マトリックスを使用して腫瘍組織足場を作成します。そのため、PPOは、低スループットと高コストを有し、適切なアッセイシステムを開発することは困難であった。この問題に対処するために、PTOを使用して、よりシンプルで正確なHTSを確立し、抗がん剤と免疫療法の効力を評価しました。384ウェルプレートで培養された固形腫瘍から確立されたPPOを使用する in vitro HTSが作成されました。HTSはまた、96ウェルプレートで培養されたPPOを用いた免疫応答を表す抗体依存性細胞傷害活性の評価のために開発された。

抗がん剤を評価するためにPDOと384ウェルマイクロプレートを用いて高度に正確なHTSを開発し、各PDOのHTSの開発は、以前に報告された10、11、12、13。HTSの性能は、CVとZ'ファクターを計算して評価した。Z'-factorは、アッセイの品質と性能の検証のために広く受け入れられている方法であり、この値が&gt;0.514の場合、アッセイはHTSに適している。RLUN007を用いた384ウェルプレートアッセイの制御データム点は、CV値5.8%、計算されたZ'ファクター0.83で、ほとんどばらつきを示さなかった。これらの結果は、このアッセイがHTSに対して高い性能を有することを示す。HTSを用いた抗がん剤に対するPTOの感受性を調べるには、 8つの抗癌剤で治療されたRLUN007、具体的には、表皮成長因子受容体(EGFR)阻害剤(アファチニブ、エルロチニブ、ゲフィチニブ、ラパチニブ、オシメルチニブ、ロシレチニブ)およびパクリタキセル(非小肺癌の標準的な臨床処置である)およびミトミシンクチシンを用いて増殖抑制を評価した。各PDOに対する抗癌剤のIC50およびAUC値を図4に示す。RLUN007は、すべてのEGFR阻害剤および他の抗癌剤に対して高感度(IC50&lt;2 μM、AUC&lt;282)を示した。すべてのデータについて計算されたシグモイド曲線は、抗癌剤の増殖抑制活性を正確に測定できることを示した。
細胞の選別およびイメージ投射システムは、上記の方法論を用いてデータが大きく異なる場合に使用される。細胞の選抜および画像化システムは、細胞クラスターを損傷することなく正確に選び、細胞クラスタサイズを整列してアッセイシステムから細胞の破片を除外することで、正確なHTSアッセイを可能にします。システムが使用されなかった場合、CV 値は 26.0% 、Z'ファクター値は 0.23 (データは表示されません) でした。しかし、CVとZファクターの値は、システムを使用してそれぞれ6.4%と0.81で改善されました。
細胞の数、形態、および付着を長期間監視する電気インピーダンス測定装置を用いて、ADCC活性を有するPTOの細胞化を調べるため、96ウェルプレート内のエフェクター細胞として抗体(トラスツズマブおよびセツキシマブ)を用いて処理したRLUN007を用いてインピーダンス信号の変化を評価した。標的細胞のみからなる対照と比較して、細胞化率は時間とともに増加した。抗体を含まないE:1(図5A,C)または2:1(図5B,D)のE:T比で6時間後に45%または75%に達した。トラスツズマブを用いたNK細胞媒介細胞増殖症は、それぞれ1:1(図5A、1μg/mL)と2:1(図5B、1μg/mL)の比率で約60%、90%であった。対照的に、セツキシマブはNK細胞介在性細胞増殖に対して用量依存的な影響を及ぼした(図5C,D)。セツキシマブの最高濃度では、RLUN007はそれぞれ1:1と2:1の比率で90%と100%で破壊されました(図5C、D)。トラスツズマブの効果はセツキシマブよりも弱く、細胞毒性はわずか60%であった。これらの結果は、PDOアッセイシステムがリアルタイムインピーダンスベースの技術を用いてADCC活性を評価できることを示している。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62668/62668fig1v5.jpg"> 図1: PDO カルチャの重要なポイント (A) 媒体の色の変化。(B) PDO濃度 50-200 μLのレベルでマークされたチューブを持つ PDO を含む遠心管を裏打ちすることによりペレットサイズからのPDOの量の測定。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62668/62668fig1v5large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62668/62668fig02.jpg"> 図2:384ウェルマイクロプレートを用いたハイスループットアッセイシステムの作成に用いたプロトコルの概要 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62668/62668fig02large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62668/62668fig03.jpg"> 図3:ADCC活性のハイスループットアッセイのためのプロトコルの概要 ADCC, 抗体依存性細胞毒性;NK、ナチュラルキラー。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62668/62668fig03large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62668/62668fig04.jpg"> 図4:抗がん剤による増殖抑制のためのハイスループットアッセイシステム 抗癌剤に対するRLUN007の用量応答曲線細かく取られたPPOは384ウェルプレートに播種した。これらは、抗癌剤の10の異なる濃度(10μMと1.5 nMの間)で6日間治療した。データは三重化実験の標準偏差±平均を表します。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62668/62668fig04large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62668/62668fig05.jpg"> 図5:ADCC活性に対するハイスループットアッセイ (A,B)トラスツズマブ(C,D)セツキシマブ(A,C)エフェクターセルに対するRLUN007の1:1の比率。(B,D)RLUN007の比率を持つ細胞化:エフェクターセル1:2。活性は、エフェクター細胞の添加後12時間測定した。データは、3つの反復サンプルの平均±標準偏差として提示されます。ADCCは、抗体依存性細胞毒性を示す。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62668/62668fig05large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>

非常に正確な インビトロ ハイスループットアッセイシステムは、がん組織と同様に患者由来の腫瘍オルガノイド(PDU)を使用して抗がん剤を評価するために開発されましたが、96ウェルプレートと384ウェルプレートを備えた インビトロ ハイスループットアッセイシステムには適していません。

Patient-derived tumor organoids (PDOs) are expected to be a preclinical cancer model with better reproducibility of disease than traditional cell culture ...

患者由来の腫瘍オルガノイドは、疾患の再現性を高め、腫瘍組織の構造と機能を正確に再現する。したがって、抗癌薬に対する患者の反応は、このモデルを用いて正確に評価することができる。腫瘍オルガノイドは、培養中のクラスター形成が大きいため、インビトロ高スループットアッセイシステムや細胞分析には適していません。この技術を用いて、分子標的薬の評価のための簡単で正確なHTSが開発された。オルガノイド培養は2D培養とは大きく異なるため、最初は文化に混乱を感じるかもしれませんが、オルガノイドの形態変化を注意深く観察することが重要です。液体窒素貯蔵から凍結した卑劣を取り除いた後、患者由来の腫瘍オルガノイドを摂氏37度の水浴中で1分間静かに攪拌する。水浴から下品を取り除き、70%エタノールで拭きます。その後、バイオセーフティキャビネットにバイアルを置きます。オルガノイド用培地を含む15ミリリットルのチューブに腫瘍オルガノイドを移す。3ミリリットルの移入ピペットを使用して、腫瘍オルガノイドとミディアムを5回上下にピペットで軽く混合します。遠心分離によって腫瘍オルガノイドを下にペレット.上清を捨て、腫瘍オルガノイドペレットを5ミリリットルの新鮮な培地で再懸濁する。腫瘍オルガノイド懸濁液をT25フラスコに移し、摂氏37度と二酸化炭素5%でインキュベートする。最初の通過の1週間後、2つのT25フラスコからの腫瘍オルガノイド懸濁液を2つの遠心分離管に移し、遠心分離によって腫瘍オルガノイドをペレットダウンさせる。腫瘍オルガノイドペレットの体積を推定し、1管当たりの新鮮な培地の2.5ミリリットルでペレットを再懸濁します。腫瘍オルガノイド懸濁液を1本のチューブに溜めます。プールした懸濁液を10ミリリットルの新鮮な培地を含むT75フラスコに移し、摂氏37度と二酸化炭素5%でインキュベートします。24時間の中程度の変化の後、70マイクロメートルのメッシュフィルターを含むフィルターホルダーを装備した細胞の断片化および分散器を用いて腫瘍オルガノイドをミンチする。15ミリリットルの腫瘍オルガノイド懸濁液を10倍希釈する。細胞懸濁液ディスペンサーを使用して、384ウェル超低アタッチメントスフェロイドマイクロプレートで希釈された腫瘍オルガノイド懸濁液の40マイクロリットルを種付けします。24時間後、液体ハンドラを使用して、20マイクロモルからウェル内の1.0ナノモルの最終濃度範囲で10の連続希釈液から0.04マイクロリットルの試験剤溶液を添加し、プレートを6日間インキュベートします。インキュベーションの終了時に、細胞内ATP測定試薬を試験井戸に添加する。ミキサーを使用してプレートの内容物を混合し、約25°Cで10分間インキュベートします。プレートリーダーを使用して、細胞内ATP含有量を発光として測定します。3回目の通路の24時間後、セルピッキングおよびイメージングシステム上の目的地プレートと同様に、40マイクロリットルの媒体を備えた384ウェル超低添付着ススフェロイドマイクロプレートを配置します。6ミリリットルの培養培地と遠心分離機を1,500倍Gで2分間製造し、気泡を除去します。ピッキングチャンバーに腫瘍オルガノイド懸濁液を4マイクロリットル加え、選液室をシステムにセットします。セルクラスターが分散後1分間チャンバーの底に落ち着き、チャンバースキャンを開始します。セルクラスタを自動選択するには、システム上でピッキングサイズを140~160マイクロメートルに設定します。次に、スキャンした画像上の選択したセルクラスターの品質を確認し、選択チップを使用して目的地プレートに1ウェルあたり10個のセルクラスターを転送します。現在の研究では、抗癌剤が患者由来の腫瘍オルガノイドに及ぼす影響を評価した。全ての抗癌剤に対する高感度は、曲線値が282未満の領域における2マイクロモル未満の半最大阻害濃度値によって示された。抗体依存性細胞毒性評価のために、2つの異なる抗体の存在下で腫瘍オルガノイドの細胞化率を測定した。%細胞化は時間とともに増加した。エフェクターと標的細胞比を1対1のエフェクターとの6時間で行わなかった場合、細胞化は45%に達したが、細胞化は70%に達し、トラスツズマブを用いたナチュラルキラー細胞媒介細胞は、1対1のエフェクター細胞比で約60%、1時間の1時間で80%の割合であった。対照的に、セツキシマブは、ナチュラルキラー細胞媒介細胞に依存する用量の影響を及ぼした。セツキシマブの最高濃度では、エフェクターで90%の細胞増殖が観察され、1対1の標的細胞比で観察され、100%細胞化が2対1の割合で観察され、セツキシマブの高い効果を示した。患者由来の腫瘍オルガノイドを用いた高スループットアッセイシステムは、潜在的な抗がん剤の評価よりも優れ、薬物評価の機会と個別化医療の進歩を提示します。

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

がん研究

インビトロスクリーニングのために患者由来の異種移植片(PDX)を使用してオルガノイドを作成する方法が記載され、インビボ/インビトロモデルのペアが一致する結果となる。PDX腫瘍は、機械的または酵素的に小片に収穫/処理され、その後、元のPDXに対して通過し、凍結保存され、特徴付けられる腫瘍オルガノイドを成長させるCleversの方法が続いた。...

がん薬理学研究のためのPDXとPDX由来オルガノイドのインビボ/インビトロ患者由来モデルペアの作成

このプロトコールは、NSCLC患者由来オルガノイドモデルにおける標的シグナル伝達阻害剤に対する薬物感受性の標準化された評価を記載している。...

EGFR変異型NSCLC患者由来オルガノイドにおける標的療法に対する感受性のプロファイリング

このプロトコルは、中処理から高スループットのオルガノイド薬物スクリーニングのための半自動化された方法と、顕微鏡に依存しない自動画像分析ソフトウェアを説明し、マルチパラメトリックの単一オルガノイド薬物反応を定量化および視覚化して、腫瘍内の不均一性をキャプチャします。...

バルクおよび単一オルガノイド分析のための広視野生細胞イメージングを用いたマルチパラメトリック腫瘍オルガノイド薬物スクリーニング(英語)

患者由来の乳房腫瘍切除術または正常な乳房組織からヒト乳房オルガノイドを確立するための詳細なプロトコルがここに提供される。このプロトコルは、ヒト患者由来の乳房オルガノイドを培養、凍結、解凍するための包括的なステップバイステップの手順を提供します。...

患者由来乳房オルガノイドの確立と培養

患者由来の卵巣がんオルガノイドを用いた治療薬試験の実施に使用できるプロトコルを提示します。...

前臨床薬物検査のための卵巣癌患者由来オルガノイドモデル

腫瘍オルガノイドは、がん研究と個別化医療へのアプローチに革命をもたらしました。これらは、臨床的に関連性のある腫瘍モデルであり、研究者は診療所で腫瘍の一歩先を行くことができます。このプロトコルは、新鮮な膵臓腫瘍組織サンプルおよび膵臓腺癌起源の患者由来の異種移植片から腫瘍オルガノイドを確立します。...

膵臓癌由来腫瘍オルガノイドおよび線維芽細胞の新鮮組織からの樹立

この研究では、組織チョッパーを利用して患者由来の膠芽腫の3次元オルガノイドを自動的に生成する方法を紹介します。この方法は、治療試験のためにそのようなオルガノイドを得るための適切かつ効果的なアプローチを提供する。...

組織チョッパーを用いたex vivo患者由来神経膠腫オルガノイドの培養

患者由来の腫瘍オルガノイドは、基礎研究およびトランスレーショナル研究のための高度なモデルシステムです。この手法では、異なるオルガノイド表現型の同時速度論的評価のためのマルチプレックス蛍光生細胞イメージングの使用について詳しく説明します。...

がんの患者由来オルガノイドモデルにおける薬物反応のための多重化生細胞イメージング(英語)

このプロトコルは、腫瘍浸潤リンパ球 (TIL) と共培養された患者由来の結腸直腸癌 (CRC) オルガノイド...

患者由来大腸腫瘍オルガノイドと腫瘍浸潤リンパ球(TIL)の共培養系の確立

CRC の PDX 由来器官毛細細胞に緑色蛍光タンパク質 (GFP) レンチ ウイルス粒子の効率的な伝達のためのプロトコルを示す本普及のひと大腸癌の高感度検出 (CRC)...

GFP レンチ ウイルス導入オルガノイド培養患者由来大腸腫瘍によって生成される微小の高感度検出

学ぶ 患者由来腫瘍オルガノイドを用いたハイスループットアッセイ法で、抗がん剤の効果を正確に評価する手法です。ATP測定と抗体依存性細胞傷害性アッセイにより、個別化医療への応用が期待されます。

患者由来腫瘍オルガノイドを用いたインビトロアッセイのハイスループット

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