Name: タンパク質チオール酸化の多重化定量のための同重体タンデム質量タグ標識と組み合わせた樹脂支援キャプチャ(英語) (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 16 s
Description: 学ぶ タンパク質チオール酸化の多重化定量法。樹脂支援キャプチャと同重体タンデム質量タグ標識を組み合わせ、質量分析により酸化システイン残基を同定・定量します。レドックスプロテオミクス研究に有用です。

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作業の一部は、NIH助成金R01 DK122160、R01 HL139335、およびU24 DK112349によってサポートされました。

動物またはヒトのサンプル/組織に関連するプロトコルに記載されているすべての手順は、ヒトおよび動物の研究倫理委員会の制度的ガイドラインによって承認され、それに従いました。
1. サンプルの均質化/溶解
<ol><li>凍結組織サンプル<ol><li>凍結組織(~30 mg)を、あらかじめ冷やしたカミソリの刃と鉗子を使用してドライアイス上でスライドさせてガラス顕微鏡上でミンチします。ミンチ組織を700 μLのバッファーA( 表1を参照)を含むプレチルド5 mL丸底ポリスチレンチューブに移し、光から保護された氷上で30分間インキュベートします。</li>
		<li>30秒間、またはハンドヘルド組織ホモジナイザーで完全に均質になるまで組織を破壊します。サンプルを氷の上に置き、泡をさらに10分間鎮静させます。 注意: ドライアイスの上に置かれたアルミニウム天板は、組織の初期処理/ミンチのための安定した作業面とプラットフォームを提供します。</li>
	</ol></li>
	<li>あるいは、100 mm培養皿中の接着細胞培養物を出発材料として使用します。<ol><li>細胞を氷上に保ち、血清学的ピペットを使用して、100 mM NEMを含む10 mLの氷冷PBSで細胞を2回すすぎます。</li>
		<li>1 mLの冷ホモジナイズ/溶解バッファーを加え、硬質セルスクレーパーで激しく掻き取って細胞を溶解します。マイクロピペットを使用してライセートを2 mL遠沈管に移します。 注:リンスバッファーと溶解バッファーは、異なるサイズの培養容器に応じてスケーリングできます。通常、2〜500万個のセルが必要です。ただし、これは特定の細胞タイプの溶解効率とタンパク質収量によって異なります。ホモジナイズバッファーは、全チオールについて分析されるサンプルに対してNEMなしで調製することができる。</li>
	</ol></li>
	<li>得られたホモジネート(ステップ1.1.2または1.2.2)をマイクロピペットを使用して2 mL遠沈管に移し、4°Cで10分間、全速力(≥16,000 × g)で遠心分離します。</li>
	<li>マイクロピペットを使用して上清(細胞培養の場合は~700 μLまたは~1 mL)を5 mLのコニカルマイクロ遠心チューブに移し、850 rpmで振とうしながら暗所で55°Cで30分間インキュベートします。</li>
	<li>ガラス血清学的ピペットを使用して、4 mLの氷冷アセトンをサンプルに加え、-20°Cで一晩インキュベートして、タンパク質の沈殿と過剰な N-エチルマレイミドの除去を行います。</li>
</ol>2. 樹脂アシストキャプチャ
<ol><li>沈殿したタンパク質ペレットをアセトンで2回洗浄し、20,500 × g で4°Cで10分間遠心分離し、アセトンをデカントし、マイクロピペットを使用して残りのアセトンを除去し、ガラス血清学的ピペットを使用して3 mLの新鮮な氷冷アセトンを加えます。数回反転させて混ぜます。2回目の洗浄後、ペレットを1〜2分間風乾させ、再懸濁が困難になる可能性があるため、過度に乾燥させないように注意してください。</li>
	<li>マイクロピペットを使用して、1mLのバッファーB( 表1を参照)を追加し、出力250Wおよび短時間のボルテックスを有するバス超音波処理器を使用して、一度に15〜30秒間の繰り返し超音波処理を用いてタンパク質を可溶化する。メーカーのプロトコルに従って、ビシンコニン酸(BCA)アッセイを使用してタンパク質濃度を測定します。</li>
	<li>さらなる処理のためにサンプル間でタンパク質濃度を標準化し、NEMを完全に除去するには、マイクロピペットを使用して500 μgのタンパク質を0.5 mL 10 kDa遠心フィルターに移し、再懸濁バッファーで最終容量500 μLに調整します。</li>
	<li>遠心フィルター内の容量が100μL未満になるまで、室温で14,000 × g で遠心分離します。 収集チューブ内のフィルターを反転させてサンプルを収集します。1,000 × g で2分間遠心分離し、バッファーCを使用して最終容量500 μLに調整します( 表1を参照)。</li>
	<li>マイクロピペットを使用して20 μLの500 mMジチオスレイトール(DTT)を最終濃度20 mMまで添加し、850 rpmで振とうしながらサンプルを37°Cで30分間インキュベートすることにより、タンパク質チオールを減らします。</li>
	<li>還元後、マイクロピペットを使用してサンプルを0.5 mLの10 kDa遠心フィルターに移し、室温で14,000 × g で15分間、または遠心フィルター内の容量が100 μL未満になるまで遠心分離します。 バッファーD( 表1を参照)を加えて、遠心フィルター内の容量を500 μLにします。<ol><li>ステップ2.6で500μLへの添加と遠心分離を3回繰り返し、4回目の遠心分離後、回収チューブ内でフィルターを反転させ、1,000× g で2分間遠心分離してサンプルを回収します。</li>
	</ol></li>
	<li>メーカーのプロトコルに従ってBCAアッセイを使用してタンパク質濃度を測定します。</li>
	<li>このバッファー交換の際、マイクロ天秤を用いて適量の樹脂(30mg/サンプル)を秤量し、50mL遠沈管に移してチオール親和性樹脂を調製します。次に、血清学的ピペットを使用して、最終濃度30 mg/mLの樹脂の水を加え、室温で1時間インキュベートしながら攪拌して、樹脂を適切に水和させます。 注:上記のチオール親和性樹脂は、メーカーによって製造中止になりました。このチオール親和性樹脂の可能な代替品が市販されている。ただし、この置換品の結合能力は約5倍少なくなります( 補足情報を参照)。あるいは、チオール親和性樹脂は、2−(ピリジルジチオ)エチルアミン塩酸塩および N−ヒドロキシスクシンイミド活性化樹脂を用いて合成することができる( 補足情報を参照)。<ol><li>樹脂の水和後、スピンカラムを真空マニホールド上に置き、マイクロピペットを使用して500 μLの樹脂スラリーを各カラムに移します。水分を除去するために真空を適用します。この手順を1回繰り返して、カラムあたり合計30 mgの樹脂を得ました。あるいは、このステップとすべての樹脂洗浄および溶出ステップに真空マニホールドを使用する代わりに、1,000 × g で2分間遠心分離します。 注:1000 μLピペットチップの端を切断してボアサイズを大きくすると、樹脂の移動に役立ちます。ピペッティングの間に粉砕して、樹脂が懸濁したままであり、均一で等量の樹脂が各カラムに移されるようにすることが重要です。</li>
		<li>マイクロピペットで500μLの超純水を加え、真空を加えて樹脂を洗浄し、水分を除去します。これを5回繰り返します。その後、500 μLのバッファーEで樹脂を5回洗浄します( 表1を参照)。 注:あるいは、1,000 x g で2分間遠心分離を、後続のすべての洗浄ステップで真空マニホールドの代わりに使用することもできます。進行中のすべての洗浄ステップは、500μLの容量で実行されます。洗浄バッファーをカラムに加えるときは、樹脂の飛沫や損失を避けながら、樹脂を完全に再懸濁させるのに十分な力で慎重に添加してください。これにより、樹脂の完全かつ効率的な洗浄が可能になります。</li>
	</ol></li>
	<li>マイクロピペットを使用して、還元した各サンプルから150 μgのタンパク質を新しいチューブに移し、最終容量の120 μLのバッファーCに調整します( 表1を参照)。マイクロピペットを使用してタンパク質溶液を樹脂を含む詰まったスピンカラムに移し、カラムにキャップを置き、850 rpmで振とうしながら室温で2時間インキュベートします。</li>
	<li>樹脂を25 mM HEPES、pH 7.0で5回洗浄します。8 M尿素;続いて2 M NaClで5回;続いて、80%アセトニトリル(ACN)と0.1%トリフルオロ酢酸(TFA)で5回続きます。最後に、ステップ2.8.2で説明されているように、25 mM HEPES、pH 7.7で5回、プラグを交換します。 注:サンプルは、ステップ4.1に記載されているように、タンパク質レベルでの分析(SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)、ウェスタンブロットなど)のためにここで溶出できます。</li>
</ol>3. オンレジントリプシン消化とTMTラベリング
<ol><li>最終容量がサンプルあたり少なくとも120 μLになるように、バッファーC( 表1を参照)に0.5 μg/μLの濃度で可溶化することにより、サンプルあたり6〜8 μgの十分なシーケンシンググレードの修飾トリプシン溶液を調製します。マイクロピペットを使用して、このトリプシン溶液120 μLをサンプルに加え、850 rpmで振とうしながら37°Cで一晩インキュベートします。 注:消化効率を高めるために、トリプシン溶液を除去して新しい溶液と交換することにより、翌日追加の消化ステップを含め、2時間消化を続けることができます。</li>
	<li>樹脂を25 mM HEPES、pH 7.0で5回洗浄します。続いて5回2 M NaCl;続いて80%ACNで0.1%TFAで5回続きます。続いて、25 mM HEPES、pH 7.7で3回行った。最後に、50 mMトリエチルアンモニウム重炭酸バッファー(TEAB)で樹脂を2回洗浄し、プラグを交換します。</li>
	<li>TMT標識試薬を調製するには、まず室温まで温めてから、遠心分離機を16,000 × gで短時間スピンダウンします。マイクロピペットを使用して、TMT標識試薬の各バイアルに150 μLの無水ACNを追加します。バイアルを室温で850 rpmに設定されたサーモミキサーで5分間インキュベートし、試薬を完全に可溶化します。16,000 × g で短時間ボルテックスしてスピンダウンし、試薬を回収します。</li>
	<li>マイクロピペットを使用して、洗浄した樹脂に100 mM TEABを40 μL加え、次に溶解したTMT試薬70 μLを加え、850 rpmで振とうしながら室温で1時間インキュベートします。残りのTMT試薬は-80°Cで保存してください。 注:各生物学的サンプルに割り当てられた個々のTMTラベルに注意してください(図1)。</li>
	<li>前述のように、0.1% TFAを含む80%ACNで5回、100 mM重炭酸アンモニウムバッファー(ABC)、pH 8.0で3回、水で2回レジンを洗浄し、プラグを交換します。</li>
</ol>4. ペプチド溶出
<ol><li>マイクロピペットを用いて100 mM ABC、pH 8.0の20 mM DTTを100 μL添加して標識ペプチドを各カラムに溶出し、850 rpmに設定したサーモミキサー上で室温で30分間インキュベートします。 注意: DTTの添加後、樹脂は凝集します。樹脂をピペットチップで破壊して、塊を破壊し、ペプチドの完全な溶出を確実にすることができます。</li>
	<li>このインキュベーションの後、固相抽出(SPE)用の真空マニホールドにカラムを置き、真空を適用して、サンプルを5 mLマイクロ遠心チューブに溶出します。この手順を一度繰り返します。</li>
	<li>最後に、100 μLの80%ACNと0.1%TFAを加え、室温で10分間インキュベートし、同じ5 mL遠沈管に溶出します。すべての画分を同じ5 mLマイクロ遠心チューブに集めます。 注:サンプルの損失を防ぐために、溶出には低結合チューブを使用し、単一の5 mLチューブの容量は4.0 mL以下に維持する必要があります。</li>
	<li>溶出したサンプルを乾燥するまで真空濃縮器に入れます。乾燥ペプチドを-80°Cで保存し、後で再懸濁します。 注:サンプルは個別に溶出することもでき、サンプルを組み合わせる前に、アリコートを除去してSDS-PAGEで分析し、ペプチドレベルで分析することができます。</li>
</ol>5. ペプチドアルキル化および脱塩/クリーンアップ
<ol><li>マイクロピペットを使用して、pH 8.0(500 μL以下)の少量の100 mM ABCバッファーを加えて、乾燥したペプチドを再懸濁します。250 Wの出力と渦を持つバス超音波処理器を使用して一度に15〜30秒間繰り返し超音波処理を使用して、2mLチューブに可溶化して転送します。 注:添加する100 mM ABC、pH 8.0の容量は、150 mMのモル濃度でDTTを再懸濁するために必要な容量に基づいています。ユーザーは、手順 4.1 で最初に追加された内容に基づいて、サンプルに存在する DTT の量を決定する必要があります。</li>
	<li>マイクロピペットを使用してABCに溶解したヨードアセトアミド(IAA)の濃縮ストック溶液(600 mM)を加えて、DTT:IAAのモル比を1:4にし、サンプルをRTで850 rpmで振とうしながら1時間インキュベートします。</li>
	<li>マイクロピペットを使用して濃縮TFA(10%)を加えてサンプルをpH < 3に酸性化し、製造元の指示に従って逆相クリーンアップを使用してサンプル脱塩を実行します。</li>
	<li>きれいなペプチドを乾燥するまで真空濃縮器に入れます。乾燥ペプチドは、さらに分析されるまで-80°Cで保存してください。</li>
</ol>6. 液体クロマトグラフィー-タンデム質量分析
<ol><li>250Wの出力を有するバス超音波処理器を使用し、3%ACNを含む20〜40μLの水中でボルテックスすることにより、一度に15〜30秒間超音波処理を繰り返すことにより、乾燥ペプチドを再懸濁する。メーカーのプロトコルに従ってBCAアッセイを実行してペプチド濃度を決定します。</li>
	<li>前述のように逆相LCとMS/MSでサンプルを分離し6、400〜2000のm/z範囲でMS1スペクトルを記録します。高エネルギー衝突解離(HCD)を利用して、等圧標識ペプチドの分析のためのレポーターイオン強度情報を取得します。機器の運転条件27,30およびMSデータの分析27,31の詳細については、以前のレポートの方法のセクションを参照してください。 注:異なるLC-MS/MSシステムまたは設定を使用して、ペプチドサンプルを分析することができます。ペプチド同定のカバレッジと感度は、使用される特定のシステムと設定によって異なります。</li>
</ol>

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</ol>

著者は、金銭的またはその他の利益相反を宣言しません。

樹脂支援捕捉は、システイン残基の酸化的修飾の研究のために、様々なサンプルタイプおよび生物学的系にわたって利用されている25、29、30。この方法では、SDS-PAGEおよびウェスタンブロット分析を使用したタンパク質およびペプチド、ならびに質量分析を使用した個々のシステイン部位を含む、複数のレベルおよび読み出しでサンプルの評価が可能になります。試料の種類または最終エンドポイントにかかわらず、この方法は最終的にシステイン含有タンパク質およびペプチドの非常に効率的かつ特異的な濃縮を可能にする38。RACを用いて、摂動後の異なるモデル系における最大数千のシステイン部位の酸化状態の変化を特定しました。
疲労筋収縮を受けたマウスでは、2,200のS-グルタチオニル化部位が同定され、半数以上がS-グルタチオニル化のレベルを有意に...

恒常性条件下では、細胞は活性酸素、窒素、または硫黄種を生成し、代謝やシグナル伝達などのプロセスを促進するのに役立ちます1,2,3、原核生物と真核生物の両方にまで及びます。これらの反応性種の生理学的レベルは、「ユーストレス」としても知られる適切な細胞機能に必要です1,4。対照的に、酸化剤と抗酸化物質のバランスを崩す酸化剤の増加は、酸化ストレス、または「苦痛」1を引き起こし、細胞の損傷につながる可能性があります。酸化剤は、タンパク質、DNA、RNA、脂質などのさまざまな生体分子を修飾することにより、生物学的経路にシグナルを伝達します。特に、タンパク質のシステイン残基は、システイン上のチオール基に起因して酸化を起こしやすい反応性の高い部位であり、異なる種類の酸化剤に対して反応性を示す5。これにより、ニトロシル化(SNO)、グルタチオニル化(SSG)、スルフェニル化(SOH)、ペルスルフィド化(SSH)、ポリスルフィド化(SSnH)、アシル化、ジスルフィドなど、システインに対するさまざまな可逆的レドックスベースの翻訳後修飾(PTM)が生じます。システイン酸化の不可逆的な形態には、スルフィニル化(SO2H)およびスルホニル化(SO3H)が含まれる。
システイン残基の可逆的酸化修飾は、さらなる不可逆的酸化を防止する保護的役割を果たすか、または下流の細胞経路のシグナル伝達分子として役立ち得る6,7。一部のチオールレドックスPTMの可逆性により、システイン部位は「レドックススイッチ」として機能し8,9、これらの部位の酸化還元状態の変化はタンパク質機能を変化させ、一過性プロセスにおける役割を調節します。酸化還元PTMs10の調節効果は、触媒作用12、タンパク質間相互作用13、立体配座変化14、金属イオン配位15、または薬理学的阻害剤結合16を含むタンパク質機能11の多くの側面において観察されている。さらに、レドックスPTMは、転写17、翻訳18、または代謝19などの経路を調節するタンパク質のシステイン部位に関与しています。酸化還元PTMがタンパク質の機能と生物学的プロセスに与える影響を考えると、酸化還元状態の摂動に応答してシステイン部位が受ける酸化の程度を定量化することが重要です。
酸化還元状態が変化したシステイン部位の同定は、通常の条件と摂動状態の間の部位特異的レベルでの酸化状態の比較に焦点を当てています。フォールド変化測定は、どのシステイン部位が研究にとって生理学的に重要であるかをユーザーが解釈するのに役立つため、どの部位が大幅に変化しているかを判断するためによく使用されます。あるいは、特定のサンプルタイプにわたる可逆的なチオール酸化の化学量論的測定は、細胞酸化に関する生理学的状態の全体像を示しますが、これは見過ごされ、十分に活用されていないことが多い重要な測定値です。修飾化学量論は、修飾チオールの割合を総タンパク質チオール(修飾および未修飾)に対する比率として定量することに基づいています20,21。その結果、化学量論的測定は、特に質量分析を使用する場合、倍率変化よりも正確な測定を提供します。酸化の増加の重要性は、化学量論を使用して特定のシステイン部位のPTM占有率を決定することにより、より容易に確認できます。たとえば、チオール酸化の3倍の増加は、わずか1%から3%、または30%から90%の大きな遷移に起因する可能性があります。占有率が1%しかない部位の酸化が3倍に増加しても、タンパク質の機能にはほとんど影響しない可能性があります。ただし、休止状態で30%の占有率を持つサイトの3倍の増加は、より実質的に影響を受ける可能性があります。化学量論的測定は、総酸化チオールとタンパク質グルタチオニル化(SSG)およびニトロシル化(SNO)を含む特定の酸化修飾との間で実行されると、特定の修飾タイプに関する比率および定量的情報を明らかにすることができる。
可逆チオール酸化は通常、低存在量の翻訳後修飾であるため、これらの修飾を含むタンパク質を生物学的サンプルから濃縮するために複数のアプローチが開発されています。Jaffreyらが考案したビオチンスイッチ技術(BST)22と呼ばれる初期のアプローチには、未修飾のチオールをアルキル化によってブロックし、可逆的に修飾されたチオールを新生の遊離チオールに還元し、新生の遊離チオールをビオチンで標識し、標識タンパク質をストレプトアビジン親和性プルダウンによって濃縮する複数のステップが含まれます。この技術は、多くの研究でSNOおよびSSGのプロファイリングに使用されており、他の形態の可逆チオール酸化のプローブに適合させることができます23,24。BSTは、さまざまな形態の可逆的チオール酸化のプローブに利用されてきましたが、このアプローチの懸念の1つは、非ビオチン化タンパク質のストレプトアビジンへの非特異的結合によって濃縮が影響を受けることです。私たちの研究室で開発された別のアプローチである樹脂支援捕獲(RAC)25,26(図1)は、ビオチン-ストレプトアビジン系を介したチオール基の濃縮の問題を回避します。
可逆的に酸化されたチオールの還元に続いて、新生遊離チオールを有するタンパク質は、遊離チオール基を共有結合的に捕捉するチオール親和性樹脂によって濃縮され、BSTよりもシステイン含有タンパク質のより特異的な濃縮を可能にする。RACと、アイソバリック標識および質量分析の最近の進歩のマルチプレックスパワーを組み合わせることで、プロテオーム全体のレベルで可逆的に酸化されたシステイン残基の濃縮、同定、定量のための堅牢で高感度なワークフローが作成されます。質量分析の最近の進歩により、チオールレドックスプロテオームのより深いプロファイリングが可能になり、タンパク質チオール酸化の原因と結果の両方の理解が深まりました27。部位特異的な定量データから得られた情報は、可逆的酸化修飾の機構的影響および下流効果のさらなる研究を可能にする28。このワークフローを利用することで、SSGのレベルが年齢に関して異なる老化などの通常の生理学的イベントに対する可逆的なシステイン酸化の生理学的影響についての洞察が得られました。SSGに対する老化効果は、ミトコンドリア機能を高め、老化マウスのSSGレベルを低下させる新規ペプチドであるSS-31(エラミプレチド)を使用して部分的に逆転し、若いマウスにより類似したSSGプロファイルを持つようになりました29。
ナノ粒子曝露に起因する病態生理学的状態は、マウスマクロファージモデルにおいてSSGが関与することが示されている。RACと質量分析を組み合わせて使用することで、SSGレベルが酸化ストレスの程度とマクロファージ貪食機能の障害に直接相関していることが示された。データはまた、異なる程度の酸化ストレスを誘発する異なる工学的ナノ材料に応答する経路特異的な違いを明らかにした30。この方法は、原核生物種でもその有用性を証明しており、チオール酸化に関する光合成シアノバクテリアの日周周期の影響を研究するために適用されました。電子伝達、炭素固定、解糖など、いくつかの重要な生物学的プロセスにわたるチオール酸化の広範な変化が観察されました。さらに、直交検証により、いくつかの重要な機能部位が修飾されていることが確認され、これらの酸化的修飾の調節的役割が示唆された6。
ここでは、標準化されたワークフローの詳細を説明し(図1)、タンパク質の総酸化システインチオールの濃縮とその後の標識および化学量論定量に対するRACアプローチの有用性を実証します。このワークフローは、細胞培養物27,30および全組織(例えば、骨格筋、心臓、肺)29,31,32,33を含む異なるサンプルタイプにおける酸化還元状態の研究において実施されている。ここには含まれていないが、RACプロトコルは、前述のように、SSG、SNO、およびS-アシル化を含む特定の形態の可逆的酸化還元修飾の調査にも容易に適合させる25,29,34。

<table><tbody><tr><td>2-(ピリジルジチオ)エチルアミン塩酸塩</td><td>Med Chem Express</td><td>HY-101794</td><td>社内樹脂合成用試薬</td></tr><tr><td>2.0 mL LoBind遠心分離管</td><td>Eppendorf</td><td>22431048</td><td></td></tr><tr><td>5.0 mL LoBind遠心分離管</td><td>Eppendorf</td><td>30108310</td><td></td></tr><tr><td>5.0 mL丸底チューブ</td><td>Falcon</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Acetone Fisher Scientific</td><td>A949-1</td><td></td></tr><tr><td>アセトニトリル</td><td>Σ Aldrich</td><td>34998</td><td></td></tr><tr><td>活性化チオール;セファロース&nbsp;4B</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8512</td><td>チオールアフィニティー樹脂の代替品</td></tr>候補 <tr><td>Amicon Ultra 0.5 mL 遠心フィルター</td><td>ミリポア Sigma</td><td></td> UFC5010BK <td></td></tr><tr><td>重炭酸アンモニウム</td><td>Sigma Aldrich</td><td>09830</td><td></td></tr><tr><td>ビシンコン酸 (BCA)</td><td>Thermo Scientific</td><td>23227</td><td>タンパク質アッセイ試薬</td></tr><tr><td>遠心分離機</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>遠心分離機</td><td>エッペンドルフ</td><td>5415R</td><td></td></tr><tr><td>ジチオスレイトール (DTT)</td><td>Thermo Scientific</td><td>20291</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>HEPES バッファー</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>ホモジナイザー</td><td>BioSpec 製品</td><td>985370</td><td></td></tr><tr><td>ヨードアセチミド (IAA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I1149</td><td></td></tr><tr><td>N-エチルマレイミド</td><td>Sigma Aldrich</td><td>4259</td><td></td></tr><tr><td>NHS活性化セファロース 4 Fast Flow</td><td>Cytiva</td><td>17-0906-01</td><td>自社樹脂合成用試薬</td></tr><tr><td>QIAvac 24 Plus 真空マニホールド</td><td>Qiagen</td><td>19413</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L6026</td><td></td></tr><tr><td>超音波処理機</td><td>ブランソン</td><td>1510R-MT</td><td></td></tr><tr><td>スピンカラム</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td>69705</td><td></td></tr><tr><td>Strata C18-E逆相カラム</td><td>フェノメネックス</td><td>8B-S001-DAK</td><td>ペプチド脱塩</td></tr><tr><td>サーモミキサー</td><td>エッペンドルフ</td><td>5355</td><td></td></tr><tr><td>チオプロピルセファロース6B</td><td>GEヘルスケア</td><td>17-0420-01</td><td>チオールアフィニティー樹脂;※チオプロピルセファロース6B樹脂は、メーカーにより製造中止となりました(詳細はプロトコール参照)。</td></tr><tr><td>TMT 等圧ラベル (16 プレックス)</td><td>Thermo Scientific</td><td>A44522</td><td>ペプチド標識試薬; 複数のフォーマットで利用可能</td></tr><tr><td>重炭酸トリエチルアンモニウム緩衝液 (TEAB)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T7408</td><td></td></tr><tr><td>トリフルオロ酢酸 (TFA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T6508</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Promega</td><td>V5820</td><td></td></tr><tr><td>尿素</td><td>Sigma Aldrich</td><td>U5378</td><td></td></tr><tr><td>Vacufuge Plus speedvac</td><td>Eppendorf</td><td>22820001</td><td>真空濃縮器</td></tr><tr><td>Vortex ミキサー</td><td>Scientific Industries</td><td>SI-0236</td><td></td></tr></tbody></table>

タンパク質チオール酸化の多重化定量のための同重体タンデム質量タグ標識と組み合わせた樹脂支援キャプチャ(英語)

Resin-Assisted Capture Coupled with Isobaric Tandem Mass Tag Labeling for Multiplexed Quantification of Protein Thiol Oxidation

タンパク質チオールの可逆的酸化修飾は、最近、細胞機能の重要なメディエーターとして浮上しています。ここでは、タンデム質量タグ(TMT)同重体標識および液体クロマトグラフィー-タンデム質量分析(LC-MS/MS)と組み合わせて、酸化タンパク質チオールのマルチプレックス確率法をプロテオームレベルで定量できる、樹脂支援捕捉(RAC)を利用した定量的レドックスプロテオミクス法の詳細な手順について説明します。酸化システイン残基に関する部位特異的な定量情報は、そのような修飾の機能的影響に関するさらなる洞察を提供します。 
このワークフローは、培養細胞(哺乳類、原核生物など)や組織全体(心臓、肺、筋肉など)など、多くのサンプルタイプに適応でき、最初に溶解/ホモジナイズされ、人工酸化を防ぐために遊離チオールがアルキル化されます。酸化されたタンパク質チオールは、チオール親和性樹脂によって還元および捕捉されるため、タンパク質/ペプチドを追加で移すことなく、消化、標識、洗浄手順を実行できるため、ワークフローのステップが合理化および簡素化されます。最後に、標識ペプチドを溶出し、LC-MS/MSで分析して、プロテオーム全体にわたるチオール酸化に関連する包括的な化学量論的変化を明らかにします。この方法は、タンパク質チオール酸化に関連する生理学的および病態生理学的状態下での酸化還元依存性調節の役割の理解を大幅に向上させます。

プロトコルの完了は、以前に酸化されたシステイン含有ペプチドの非常に特異的な濃縮をもたらし、多くの場合、&gt;95%の特異性を有する27,35,36。しかしながら、プロトコルのいくつかの重要なステップは、特別な注意を必要とする、例えば、人工酸化および人工的に酸化されたチオールの非特異的濃縮を禁止するサンプル溶解/均質化前の遊離チオールの初期ブロッキング25。サンプルは、プロトコルのいくつかの段階で、タンパク質とペプチドの両方のSDS-PAGE分析を含むさまざまな方法で分析できます。SDS-PAGEは、全チオールサンプルが処理/刺激による異なるレベルの酸化を決定するためのサンプル間のレシオメトリック比較を可能にするサンプルの定性分析を可能にします(図2A)。個々のタンパク質の酸化レベルをさらに調査するために、SDS-PAGEゲルをウェスタンブロッテ...

タンパク質チオール酸化は、通常の生理学的および病態生理学的条件下で重要な意味を持ちます。レジンアシストキャプチャー、アイソバリック標識、質量分析を利用して、タンパク質の可逆的に酸化されたシステイン残基の部位特異的同定と定量を可能にする定量的レドックスプロテオミクス法の詳細について説明します。

Reversible oxidative modifications on protein thiols have recently emerged as important mediators of cellular function. Herein we describe the detailed ...

このプロトコルは、タンパク質の酸化シスチン残基の部位特異的同定を可能にする方法を記載する。この方法では、酸化シスチン残基の定量的および部位特異的データをさまざまなサンプルタイプから生成できます。補助捕捉手順を開始するには、沈殿したタンパク質ペレットをアセトンで2回洗浄し、20, 500 G、摂氏4度で10分間遠心分離します。次に、アセトンをデカントし、マイクロピペットで残りのアセトンを取り除きます。ガラス血清学的ピペットを使用して、3ミリリットルの新鮮な氷冷アセトンをチューブに加え、チューブを数回反転させてよく混合します。2回目の洗浄後、ペレットを乾燥させすぎずに1〜2分間風乾させます。1ミリリットルのバッファーBを乾燥タンパク質ペレットに加える。タンパク質を可溶化するには、短いボルテックスとともに、一度に15〜30秒間、250ワットの出力を有するバス超音波処理器でペレットを繰り返し超音波処理する。ビシンコニン酸またはBCAアッセイを実行して、タンパク質濃度を測定します。タンパク質濃度を標準化するには、500マイクログラムのタンパク質サンプルを0.5ミリリットル、10キロダルトンの遠心フィルターに移し、再懸濁バッファーでサンプルを500マイクロリットルまで容量アップします。遠心フィルター内の容量が100マイクロリットル未満になるまで、室温で14, 000 Gでタンパク質バッファー混合物を遠心分離します。収集チューブ内のフィルターを反転させてサンプルを収集します。サンプルを1000 Gで2分間遠心分離し、バッファーCを加えて最終容量500マイクロリットルにします。タンパク質チオールを減らすには、20マイクロリットルの500ミリモルのジチオスレイトールまたはDTTをサンプルに加えて最終濃度20ミリモルとし、850RPMで振とうしながら摂氏37度で30分間サンプルをインキュベートします。還元後、遠心フィルター内の容量が100マイクロリットル未満になるまで、室温で14, 000 Gでサンプルを0.5ミリリットルの10キロダルトン遠心フィルターに遠心分離します。バッファーDを加えて容量を500マイクロリットルにし、遠心分離を繰り返します。4回目の遠心分離後、回収チューブ内のフィルターを反転させてサンプルを回収し、1000Gで2分間遠心分離する。次に、BCAアッセイを使用してタンパク質濃度を測定します。次に、スピンカラムを真空マニホールド上に置き、マイクロピペットを用いて、調製したばかりのチオールアフィニティー樹脂スラリー500マイクロリットルを各カラムに移した。水分を除去するために真空を適用します。この手順を1回繰り返して、カラムあたり30ミリグラムの樹脂を取得します。500マイクロリットルの超純水で樹脂を5回洗浄し、真空を適用して水を除去し、次に新しいチューブ E.In 500マイクロリットルのバッファーで5回洗浄し、最終容量が120マイクロリットルになるまで、150マイクログラムの還元タンパク質サンプルにバッファーCを追加します。タンパク質溶液を、樹脂を含む詰まったスピンカラムに移します。キャップをカラムに置き、850rpmで振とうしながら室温で2時間インキュベートする。原稿に記載されているように樹脂を洗います。プラグを交換してください。樹脂上でのトリプシン消化を行うには、新たに調製した120マイクロリットルのトリプシン溶液をサンプルに加え、850 RPMで振とうしながら、摂氏37度で一晩カラムをインキュベートします。翌日、原稿に記載されているように樹脂を複数回洗浄し、プラグを交換します。マイクロピペットを使用して、洗浄した樹脂に40マイクロリットルの100ミリモルのトリエチルアンモニウム重炭酸塩緩衝液を加えます。次いで、溶解したタンデム質量タグまたはTMT標識試薬70マイクロリットルを加え、850RPMで振とうしながら室温で1時間インキュベートする。残りのTMT試薬は摂氏マイナス80度で保管してください。レジンを洗浄し、プラグを交換します。20ミリモルのDTTを含むpH 8.0の100ミリモル炭酸水素アンモニウムバッファーを100マイクロリットル加えてTMT標識ペプチドをカラムに添加し、サーマルミキサー上でカラムを室温で850RPMで30分間インキュベートします。インキュベーション後、カラムを真空マニホールドに置き、真空を適用してサンプルを5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに溶出して溶出を行います。この手順を1回繰り返してから、100マイクロリットルの80%アセトニトリルと0.1%トリフルオロ酢酸をカラムに加えます。カラムを室温で10分間インキュベートした後、同じ5ミリリットルの遠沈管でサンプルを溶出します。溶出したサンプルを乾燥するまで真空濃縮器に入れます。その後、乾燥ペプチドをさらに使用するまで摂氏マイナス80度で保管します。RAW264.7細胞からのペプチドサンプルの定性分析はSDS-PAGEで実施され、サンプルは処理による異なるレベルの酸化を決定することによって比較されました。その後、分離したタンパク質をウェスタンブロットで調査し、個々のタンパク質の酸化レベルをさらに調査しました。シスチン含有ペプチドの報告されたイオン強度を液体クロマトグラフィータンデム質量分析法により分析した。iTRAQのチオール酸化化学量論により、個々のシスチン部位レベルで標識された富化および酸化ペプチドを定量した。タンパク質ペレットを乱すことなくアセトンを慎重に除去します。タンパク質ペレットが完全に可溶化され、正確に定量され、樹脂がスピンカラムに正確に割り当てられていることを確認してください。洗浄ステップ中は必ずレジンを再懸濁してください。濃縮されたタンパク質およびペプチドのさらなる評価は、SDS-PAGEおよび染色、ウェスタンブロッティングおよび質量分析によって行うことができる。

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

細胞がストレス状況に遭遇すると活性酸素種のレベルが上昇している。ここでは、3'-3...

同位体タグ質量分析法を用いたチオールレドックスプロテオームのプロファイリング

ここでは、 シロイヌナズナの細胞培養というラベルのN 15、完全に標識されていないとの混合物をベース洗剤に耐性と洗剤の可溶性膜にし、 生体内で植物の形質膜の分画するための堅牢な方法が記載されている。手順は、シグナリングプロセスを理解するために、比較プロテオミクス研究のために適用される。...

比較プロテオーム解析のための代謝標識および膜分画<em&gt;シロイヌナズナ</em&gt;サスペンション細胞培養

還元ジメチル化（REDIラベリング）によるペプチドの安定同位体標識は、正確な質量分析に基づく定量的プロテオミクスのための迅速、安価な戦略である。ここでは、ほぼすべてのサンプルタイプに適用することができるのRediアプローチを使用してタンパク質混合物の調製および分析のためのロバストな方法を示す。...

安定同位体標識するための還元ジメチル化を用いた定量的プロテオミクス

組み合わせ前駆同位体標識およびアイソバリックタグ（cPILOT）は、アイソバリックタグのサンプル多重化機能を強化し、定量プロテオミクス戦略です。このプロトコルは、アルツハイマー病のモデルマウスと野生型対照からの組織へのcPILOTの適用を説明しています。...

拡張サンプル複合前駆同位体標識と同重体タグ付けを使用して組織の多重化（cPILOT）

正確に高分解能質量分析計を接続した液体クロマトグラフィーによる定圧ラベリング、広範な分別、バイオインフォマティクス...

定圧ラベリング、豊富な液体クロマトグラフィー、質量分析法、およびソフトウェアによる定量化して深いプロテオームをプロファイリング

このワークフローは、定量的なグローバルプロテオーム分析のために、複数のタンパク質翻訳後修飾(PTM)を同時に時間効率とコスト効率の高い濃縮のパフォーマンスを説明します。このプロトコルは、ペプチドレベルPTM濃縮を複数の結合抗体で利用し、続いてデータ非依存の獲得質量分析を行い、PTMクロストークに関する生物学的洞察を得る。...

定量化とサイトローカリゼーションのための2つの翻訳後修飾の同時アフィニティエンリッチメント

タンパク質抽出、定量、沈殿、消化、標識、プロテオミクス施設への提出、データ分析の各ステップの詳細情報を含む最適化されたタンデム質量タグ(TMT)標識プロトコルを提示します。...

プロテオミクス施設提出のためのTMTサンプル調製とその後のデータ分析

前駆体同位体標識とアイソバリックタグ(cPILOT)は、利用可能なアイソバリックタグで同時に分析できるサンプル数を増やすことができる、強化されたサンプル多重化戦略です。ロボットプラットフォームの組み込みにより、実験のスループット、再現性、定量的精度が大幅に向上しました。...

組み合わせ前駆体等位同位体ラベリングとアイソバリックタギング(cPILOT)を使用した自動サンプル多重化

タンパク質の高速光化学酸化は、タンパク質の構造特性を示す新たな手法です。異なる溶媒添加剤およびリガンドは、ヒドロキシルラジカル清掃特性を多様に有している。異なる条件でタンパク質構造を比較するために、反応で生成されたヒドロキシルラジカルのリアルタイム補償が反応条件を正常化するために必要である。...

タンパク質トポグラフィ変化の測定のためのタンパク質の高速光化学酸化におけるリアルタイム補正の実現

記載されたプロトコルは、ラベルベースとラベルフリー定量の2つのアプローチを用いて、組織サンプルの最適化された定量プロテオミクス分析を提供します。ラベルベースのアプローチは、より正確なタンパク質定量の利点を有する一方で、ラベルフリーアプローチはより費用対効果が高く、コホートの何百ものサンプルを分析するために使用されます。...

組織サンプルの質量分析ベースのショットガンプロテオミクスの包括的ワークフロー

学ぶ タンパク質チオール酸化の多重化定量法。樹脂支援キャプチャと同重体タンデム質量タグ標識を組み合わせ、質量分析により酸化システイン残基を同定・定量します。レドックスプロテオミクス研究に有用です。

タンパク質チオール酸化の多重化定量のための同重体タンデム質量タグ標識と組み合わせた樹脂支援キャプチャ(英語)

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