Name: トップダウン質量分析によるタンパク質の立体構造特性評価のためのキャピラリー電気泳動ベースの水素/重水素交換 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 45 s
Description: 学ぶキャピラリー電気泳動ベースの水素/重水素交換法によるタンパク質立体構造解析。共存するタンパク質種を分離し、トップダウン質量分析で一次測定で構造差を評価する効率的な手法です。

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この研究は、中国国家自然科学財団(NSFC 21974069)からの助成金によって支援されました。著者らはまた、中国の深セン湾研究所の細胞分析研究所からも支援を受けた。生物医学的機能材料の江蘇省共同イノベーションセンター;南京師範大学(中国)の江蘇省生物医学材料主要研究所。

<ol><li>Kaltashov, I. A., Bobst, C. E., Pawlowski, J., Wang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry-based+methods+in+characterization+of+the+higher+order+structure+of+protein+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmaceutical+and+Biomedical+Analysis%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry-based methods in characterization of the higher order structure of protein therapeutics.</a> Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 184, 113169(2020).</li>
<li>Engen, J. R., Botzanowski, T., Peterle, D., Georgescauld, F., Wales, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developments+in+hydrogen%2Fdeuterium+exchange+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Developments in hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 93 (1), 567-582 (2021).</li>
<li>Pan, J., Han, J., Borchers, C. H., Konermann, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformer-specific+hydrogen+exchange+analysis+of+Abeta%281-42%29+oligomers+by+top-down+electron+capture+dissociation+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Conformer-specific hydrogen exchange analysis of Abeta(1-42) oligomers by top-down electron capture dissociation mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 83 (13), 5386-5393 (2011).</li>
<li>Pan, J., Han, J., Borchers, C. H., Konermann, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+dynamics+of+small+soluble+Abeta%281-40%29+oligomers+studied+by+top-down+hydrogen+exchange+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Structure and dynamics of small soluble Abeta(1-40) oligomers studied by top-down hydrogen exchange mass spectrometry.</a> Biochemistry. 51 (17), 3694-3703 (2012).</li>
<li>Pan, J., Borchers, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Top-down+structural+analysis+of+posttranslationally+modified+proteins+by+Fourier+transform+ion+cyclotron+resonance-MS+with+hydrogen%2Fdeuterium+exchange+and+electron+capture+dissociation%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Top-down structural analysis of posttranslationally modified proteins by Fourier transform ion cyclotron resonance-MS with hydrogen/deuterium exchange and electron capture dissociation.</a> Proteomics. 13 (6), 974-981 (2013).</li>
<li>Wang, G., Abzalimov, R. R., Bobst, C. E., Kaltashov, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformer-specific+characterization+of+nonnative+protein+states+using+hydrogen+exchange+and+top-down+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United.+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Conformer-specific characterization of nonnative protein states using hydrogen exchange and top-down mass spectrometry.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United. States of America. 110 (50), 20087-20092 (2013).</li>
<li>Mironov, G. G., Clouthier, C. M., Akbar, A., Keillor, J. W., Berezovski, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+analysis+of+enzyme+structure+and+activity+by+kinetic+capillary+electrophoresis-MS%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Simultaneous analysis of enzyme structure and activity by kinetic capillary electrophoresis-MS.</a> Nature Chemical Biology. 12 (11), 918-922 (2016).</li>
<li>Shen, Y., Zhao, X., Wang, G., Chen, D. D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+hydrogen%2Fdeuterium+exchange+during+proteoform+separation+enables+characterization+of+conformational+differences+between+coexisting+protein+states%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Differential hydrogen/deuterium exchange during proteoform separation enables characterization of conformational differences between coexisting protein states.</a> Analytical Chemistry. 91 (6), 3805-3809 (2019).</li>
<li>Kontopidis, G., Holt, C., Sawyer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invited+review%3A+%CE%B2-lactoglobulin%3A+binding+properties%2C+structure%2C+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Dairy+Science%22%5BJournal%5D)">Invited review: β-lactoglobulin: binding properties, structure, and function.</a> Journal of Dairy Science. 87 (4), 785-796 (2004).</li>
<li>Qin, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+of+the+Tanford+transition+of+bovine+%CE%B2-lactoglobulin%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Structural basis of the Tanford transition of bovine β-lactoglobulin.</a> Biochemistry. 37 (40), 14014-14023 (1998).</li>
<li>Qin, B. Y., Bewley, M. C., Creamer, L. K., Baker, E. N., Jameson, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+implications+of+structural+differences+between+variants+A+and+B+of+bovine+beta-lactoglobulin%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Science%22%5BJournal%5D)">Functional implications of structural differences between variants A and B of bovine beta-lactoglobulin.</a> Protein Science. 8 (1), 75-83 (1999).</li>
<li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+capillary+isoelectric+focusing+mass+spectrometry+analysis+of+peptides%2C+proteins%2C+and+monoclonal+antibodies+with+a+flow-through+microvial+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">High resolution capillary isoelectric focusing mass spectrometry analysis of peptides, proteins, and monoclonal antibodies with a flow-through microvial interface.</a> Analytical Chemistry. 90 (15), 9495-9503 (2018).</li>
<li>Busch, M. H. A., Kraak, J. C., Poppe, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellulose+acetate-coated+fused-silica+capillaries+for+the+separation+of+proteins+by+capillary+zone+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography+A%22%5BJournal%5D)">Cellulose acetate-coated fused-silica capillaries for the separation of proteins by capillary zone electrophoresis.</a> Journal of Chromatography A. 1695 (2), 287-296 (1995).</li>
<li>Zhao, X., Shen, Y., Tong, W., Wang, G., Chen, D. D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deducing+disulfide+patterns+of+cysteine-rich+proteins+using+signature+fragments+produced+by+top-down+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Deducing disulfide patterns of cysteine-rich proteins using signature fragments produced by top-down mass spectrometry.</a> Analyst. 143 (4), 817-823 (2018).</li>
<li>Sutera, S. P., Skalak, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+history+of+Poiseuille%27s+law%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Fluid+Mechanics%22%5BJournal%5D)">The history of Poiseuille's law.</a> Annual Review of Fluid Mechanics. 25 (1), 1-20 (1993).</li>
<li>Wang, G., Kaltashov, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Approach+to+characterization+of+the+higher+order+structure+of+disulfide-containing+proteins+using+hydrogen%2Fdeuterium+exchange+and+top-down+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Approach to characterization of the higher order structure of disulfide-containing proteins using hydrogen/deuterium exchange and top-down mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 86 (15), 7293-7298 (2014).</li>
<li>Wang, G., Johnson, A. J., Kaltashov, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+electrospray+ionization+mass+spectrometry+as+a+tool+for+characterization+of+small+soluble+protein+aggregates%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Evaluation of electrospray ionization mass spectrometry as a tool for characterization of small soluble protein aggregates.</a> Analytical Chemistry. 84 (3), 1718-1724 (2012).</li>
<li>Fellers, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ProSight+Lite%3A+graphical+software+to+analyze+top-down+mass+spectrometry+data%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">ProSight Lite: graphical software to analyze top-down mass spectrometry data.</a> Proteomics. 15 (7), 1235-1238 (2015).</li>
<li>Cai, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MASH+Suite+Pro%3A+A+comprehensive+software+tool+for+top-down+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">MASH Suite Pro: A comprehensive software tool for top-down proteomics.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 15 (2), 703-714 (2016).</li>
<li>Paterson, G. R., Hill, J. P., Otter, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+%CE%B2-lactoglobulin+A%2C+B+and+C+variants+of+bovine+whey+using+capillary+zone+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography+A%22%5BJournal%5D)">Separation of β-lactoglobulin A, B and C variants of bovine whey using capillary zone electrophoresis.</a> Journal of Chromatography A. 700 (1), 105-110 (1995).</li>
<li>Wang, G., Kaltashov, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Approach+to+characterization+of+the+higher+order+structure+of+disulfide-containing+proteins+using+hydrogen%2Fdeuterium+exchange+and+top-down+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Approach to characterization of the higher order structure of disulfide-containing proteins using hydrogen/deuterium exchange and top-down mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 86 (15), 7293-7298 (2014).</li>
<li>Nicolardi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On-line+electrochemical+reduction+of+disulfide+bonds%3A+improved+FTICR-CID+and+-ETD+coverage+of+oxytocin+and+hepcidin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+for+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">On-line electrochemical reduction of disulfide bonds: improved FTICR-CID and -ETD coverage of oxytocin and hepcidin.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 24 (12), 1980-1987 (2013).</li>
<li>Adhikari, S., Xia, Y., McLuckey, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Top-down+analysis+of+disulfide-linked+proteins+using+photoinduced+radical+reactions+and+ET-DDC%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Top-down analysis of disulfide-linked proteins using photoinduced radical reactions and ET-DDC.</a> International Journal of Mass Spectrometry. 444, 116173(2019).</li>
<li>Rush, M. J. P., Riley, N. M., Westphall, M. S., Coon, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Top-down+characterization+of+proteins+with+intact+disulfide+bonds+using+activated-ion+electron+transfer+dissociation%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Top-down characterization of proteins with intact disulfide bonds using activated-ion electron transfer dissociation.</a> Analytical Chemistry. 90 (15), 8946-8953 (2018).</li>
<li>Zhong, X., Maxwell, E. J., Chen, D. D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+transport+in+a+micro+flow-through+vial+of+a+junction-at-the-tip+capillary+electrophoresis-mass+spectrometry+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Mass transport in a micro flow-through vial of a junction-at-the-tip capillary electrophoresis-mass spectrometry interface.</a> Analytical Chemistry. 83 (12), 4916-4923 (2011).</li>
</ol>

D. D. Y. Chenは、フロースルーマイクロバイアルCE-MSインターフェースを商業化しているKnowledge for Health Institute for Biomoleculesの創設者の一人です。他の著者は開示するものは何もありません。

CEキャピラリーの内壁を被覆する目的には、CEプロセス13中の電気浸透流およびタンパク質吸収の最小化が含まれる。電気浸透流は、中性または反対に荷電した種を検出器に駆動する能力のために、小分子の従来のCE分析に有益であるが、溶液中で同様のサイズおよび正味電荷を有するタンパク質種の分離効率を損なう。キャピラリーをHPCでコーティングすると、キャピラリの内壁上のシラノール基によって引き起こされる電気浸透流が最小限に抑えられます。さらに、これらのシラノール基をマスキングすると、タンパク質との相互作用が減少し、毛細血管内のタンパク質の移動が遅くなったり、完全に保持されたりすることを防ぎます。
電気泳動の間、分析物とBGEからの陽イオンと陰イオンの両方が電気泳動マイグレーションを受ける。MSと結合すると、CEキャピラリーの負電圧側におけるBGEのリザーバは、異なる組成のCE−MS界面と交換される。リザーバから正電圧側でキャピラリーに新鮮なBGEを特定の流量で連続的に注入する圧力を加えると、キャピラリー全体のBGE含有量の濃度勾配が最小限に抑えられ...

異なる立体構造、結合、または修飾状態のタンパク質種を区別し、それらの構造的差異を特徴付けることは、分子認識から酵素触媒作用に至るまで、生物学的事象に関与するこれらの種間の遷移経路をモニターし、これらの事象の根底にあるメカニズムを理解するために重要である。従来の生物物理学的技術は、不十分な分解能および溶液中の動的情報の損失などの制限のために、完全な解決策を提供しない。質量分析(HDX MS)と組み合わせた水素/重水素交換は、意図的に導入された2H2O溶液からのタンパク質の不安定な水素原子と2Hとの間の交換を介して、タンパク質の構造的および立体構造的特徴を重水素(2H)で標識する技術である。水素結合に関与するプロトンは、タンパク質内部で溶媒から隔離されているものや、容易に交換しない1。このように、交換可能な部位における交換速度は、その高次構造への関与に大きく依存するため、1Hと2Hの異なる原子質量に基づいて2H取り込みの程度と速度をプローブするMSによって、タンパク質構造を高い空間分解能で明らかにすることができる。ここ数十年にわたり、HDX MSはタンパク質の立体構造とダイナミクス2を研究するための卓越した技術となっています。
HDX MSの古典的なボトムアップアプローチでは、異なる立体構造、結合、または修飾状態のタンパク質種のアンサンブルは、無傷のタンパク質レベルで分離することなくタンパク質分解されるため、複雑な重水素含有量で得られたタンパク質分解断片を分析することによって個々の種を特徴付けることは不可能です。対照的に、トップダウンアプローチでは、異なる重水素含有量を組み込んだ異なるタンパク質状態またはプロテオフォームは、MSスキャンにおいて無傷のタンパク質塊の複数の分布を生じる。これにより、適切な質量フィルタ(四重極など)を用いた各質量分布に対応するイオンの質量選択と、その後のタンデムMS分析3、4、5、6におけるそれらの立体構造の違いの特性評価によって、個々の種を分離することができる。しかしながら、この戦略におけるタンパク質状態またはプロテオフォームの分離効率は、それらの対応する質量分布の違いの程度によって制限される。
キャピラリー電気泳動(CE)は、溶液相におけるそれらの異なる電荷および流体力学的サイズに基づいてタンパク質種を高効率で分離する手段を提供する7。CEとHDXを組み合わせることで、溶液相におけるタンパク質状態またはプロテオフォームのさらなる分離が可能になります。さらに、CEキャピラリーの容量が小さいため、完全に重水素化された溶液をバックグラウンド電解質溶液(BGE)、すなわちランニングバッファーとして利用でき、キャピラリーをタンパク質サンプルのHDXリアクターとしてレンダリングできます。電気泳動プロセスにおけるタンパク質とプロトン性試薬間の電気泳動移動度の違いにより、CE中にHDXを実施すると、残留非重水素化含有量が最小限に抑えられたタンパク質分析物の重水素化環境がほぼ完全になり、HDXデータを使用した構造解析の感度が向上します。そのため、CEベースの差動HDXアプローチをトップダウンMSと組み合わせて開発し、タンパク質の高次構造を状態またはプロテオフォーム特異的な方法で特徴付けました8。
このホワイトペーパーでは、材料調製、実験手順、およびデータ分析の手順を詳述することによって、このアプローチのプロトコルについて説明します。メソッドのパフォーマンスまたはデータ品質に影響を与える可能性のある要因は、短いメモにリストされています。ここで提示される代表的な結果には、乳中に存在する主要な乳清タンパク質であるウシβ-ラクトグロブリン(β-lg)の異なるタンパク質および天然変異体の混合物の差動HDXデータが含まれる9。我々は、CEベースのHDXおよびそれらの立体構造の変異体特異的特性評価中に、β-lgの2つの豊富な変異体、すなわちAおよびB10,11の分離効率、再現性、および2H標識性能を実証する。

<table><tbody><tr><td>酢酸アンモニウム</td><td>フィッシャーケミカル</td><td>A / 3446 / 50</td><td>&ge99%</td></tr><tr><td>CESI 8000 plus キャピラリー電気泳動システム</td><td>Sciex, 米国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>遠心分離機</td><td>Eppendorf</td><td>5406000097</td><td></td></tr><tr><td>遠心フィルター</td><td>Merck</td><td>UFC201024</td><td>10 kDa カットオフ</td></tr><tr><td>酸化重水素</td><td>エネルギー ケミカル</td><td>E090001</td><td>99.9 % D</td></tr><tr><td>ギ酸</td><td>Acros Organics</td><td>&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>270480250溶融シリカガラスキャピ</td><td>ラリーPolymicro Technologies</td><td>1068150017</td><td>ID 50&mu;メートル、外径360&mu;メートル</td></tr><tr><td>のガスクロマトグラフィー</td><td>アジレント</td><td>GC6890N</td><td></td></tr><tr><td>塩酸</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>258148</td><td></td></tr><tr><td>ヒドロキシプロピルセルロース</td><td>アラジン</td><td>H113415</td><td>MW 100000</td></tr><tr><td>マグネチックスターラー</td><td></td><td>DLAB 8030101212</td><td></td></tr><tr><td>メタノール</td><td>フィッシャーケミカル</td><td>A456-4</td><td>MSグレードの</td></tr><tr><td>微量 UV-Vis分光光度計</td><td>DeNovix</td><td>84677JK7731</td><td></td></tr><tr><td>ミオグロビン</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M1882</td><td></td></tr><tr><td>Orbitrap Fusion Lumos 質量分析計</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック社(米国</td><td></td><td></td></tr>) <tr><td>PA 800 Plus 医薬品分析 CEシステム</td><td>ベックマン・コールター社(米国</td><td></td><td></td></tr>) <tr><td>Q Exactive UHMR質量分析計</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック社(ドイツ)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ナトリウム&nbsp;水酸化物</td><td>シグマAldrich</td><td>S5881</td><td></td></tr><tr><td>ユビキチン</td><td>Sigmaアルドリッチ</td><td>U6253</td><td></td></tr><tr><td>超音波装置</td><td>シエンツ</td><td>SB-5200</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-ラクトグロブリン</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>L0130</td><td></td></tr></tbody></table>

トップダウン質量分析によるタンパク質の立体構造特性評価のためのキャピラリー電気泳動ベースの水素/重水素交換

Capillary Electrophoresis-based Hydrogen/Deuterium Exchange for Conformational Characterization of Proteins with Top-down Mass Spectrometry

溶液中で共存する複数のタンパク質状態の立体構造不均一性の解決は、分子認識から酵素触媒作用に至るまで、タンパク質治療薬の特性評価および生物学的機能に重要な立体構造遷移経路の決定における主要な障害の1つであり続けている。水素/重水素交換(HDX)反応とトップダウン質量分析(MS)分析を組み合わせることで、タンパク質の高次構造とダイナミクスをコンフォーマー特異的な方法で特徴付ける手段を提供します。この技術の立体構造分解能は、インタクトなタンパク質レベルでタンパク質状態を分離し、HDX反応中に残留する非重水素化プロトン含有量を最小限に抑える効率に大きく依存します。 
ここでは、立体配座分解能の向上を目的としたHDX MSアプローチのキャピラリー電気泳動(CE)ベースのバリアントについて説明します。このアプローチでは、タンパク質は、キャピラリー電気泳動分離中に重水素化バックグラウンド電解質溶液(BGE)を通って移動しながらHDX反応を受ける。溶液中に共存する異なるタンパク質状態またはプロテオフォームは、それらの異なる電荷対サイズ比に基づいて効率的に分離することができる。タンパク質とプロトン性溶媒分子との間の電気泳動移動度の差は、残留非重水素化溶媒を最小限に抑え、HDXプロセス中にほぼ完全な重水素化環境をもたらす。フロースルーマイクロバイアルCE-MSインターフェースは、噴霧器の出口で急冷および変性修飾剤溶液と迅速に混合した後、溶出タンパク質種の効率的なエレクトロスプレーイオン化を可能にする。オンラインのトップダウンMS分析は、溶出された無傷のタンパク質種の全球重水素化レベルを測定し、続いてそれらの気相断片の重水素化を測定する。このホワイトペーパーでは、牛乳中に共存する天然のタンパク質バリアントを含む、システム用の差動HDXにおけるこのアプローチを実証します。

BGEの注入圧力を変えることで、分離効率と遊走時間の両方を調整でき、分離するタンパク質のHDX反応時間に相当します(図3)。注入圧力が低いほど、実験期間を犠牲にしてCEピークの分離が良好になります(図3A)。マイグレーション/HDX反応時間が長くなると、タンパク質分析物の重水素化レベルが高くなります(図3B-D)。HDXの時間スケール(分)では、重水素化の差は、高速交換可能なサイトではなく、構造的に保護されたサイトでの交換範囲の違いを主に反映する必要があります。どちらのタンパク質種によっても示される重水素化時間関数の傾向によれば、遊走時間差が重水素化差の主な寄与者である可能性は低い。実際、ホロミオグロビンおよびアポミオグロビン(Mb)8の微分CE-HDXにおいて、先に溶出されたapo-Mbはholo-Mbよりも高い重水素化レベルを示し、立体構造差...

ここでは、キャピラリー電気泳動ベースの水素/重水素交換(HDX)アプローチとトップダウン質量分析を組み合わせたプロトコルを紹介します。このアプローチは、同時差動HDXおよび電気泳動分離を行うことによって、異なる状態および異なるプロテオ形態のタンパク質を含む、異なるタンパク質種間の高次構造の違いを特徴付ける。

Resolving conformational heterogeneity of multiple protein states that coexist in solution remains one of the main obstacles in the characterization of ...

この方法により、異なるコンフォーマーまたはバリアントを含む共存するタンパク質種の分離と、それらの高次構造の違いのオンライン特性評価を単一のCEMS測定で完了することができます。電気泳動効果を利用して、HDX反応のためのほぼ100%の持続時間環境を提供し、トップダウンMS分析のためのHDX中の共存タンパク質種の直交分離を提供します。キャピラリー電気泳動の事前調整、水素交換、またはCE HDXセットアップから始めます。50%メタノール、49%水および1%ギ酸の混合物中で超音波処理を使用して、室温で少なくとも30分間、マイクロバイアルCE-MS界面を通る流れをきれいにする。HPC修正キャピラリーをキャピラリー電気フェレーシスまたはCE装置に取り付けます。オートサンプラーを使用して、キャピラリーをバックグラウンド電解質溶液またはBGEで10分間すすぎ、BGEで満たしたままにします。適当な長さの未変性溶融シリカキャピラリーチューブを改質剤溶液用の注入チューブとして使用する。ユニオンと適切なスリーブを使用して、調整剤チューブを鈍い温度で気密ガラスシリンジに接続し、注入ポンプを使用して改質剤溶液でチューブを少なくとも10分間すすぎます。対応する溶液をロードしたHPCコード化されたCEキャピラリーおよびモディファイアチューブの出口を、洗浄されたCE-MSインターフェースに挿入します。調整剤溶液が界面の先端に達するように、注入ポンプでシリンジを前進させる。組み立てられたCE-MS界面を質量分析計のナノ電子噴霧イオン化源ハウジング上に取り付ける。CE-MSインターフェースに3~5キロボルトのスプレー電圧を印加します。改質剤溶液に注入ポンプを毎分0.1〜10マイクロリットルの範囲の流量で注入し、CE-MSインターフェースの先端で安定したエレクトロスプレーを確保します。BGEとオートサンプラーを含むサンプルバイアルを配置し、後でブランク電気泳動図とブランク質量スペクトルを取得するために使用されます。注入量と注入パラメータの関係を使用して注入量を推定する。オートサンプラーを用いて試料溶液を2つのPSIで適当な期間注入する。0〜2PSIの範囲の注入圧力で20キロボルトの電気泳動電圧を印加することによってCE分離を開始し、電気泳動を得る。一方、イオン電流グラフが時間の関数として取得され、対応するMSスキャンが自動的に単一のスペクトルに結合されないクロマトグラフィーモードでMSデータを取得する。空白の電気泳動図と質量スペクトルを基準として保存します。所望の濃度のタンパク質試料溶液を含む試料バイアルをオートサンプラーに入れ、電気泳動的に分離された重水素標識タンパク質種の電気泳動およびMS1スペクトルを取得する。目的の種に対して、同じ実行内でMS1スペクトルを取得した後、または後続の別の実行でタンデムMs.測定を実行します。各測定後、キャピラリーをBGEで20PSIの圧力で少なくとも10分間フラッシュします。CEMSインターフェースとすべてのチューブを清掃し、実験の完了時に保管してください。HDXエンドポイントサンプルのデータセットをMSで直接注入モードで取得します。低い注入圧力は、CEピークのより良い分離をもたらしたが、実験の遊走時間と持続時間の両方の増加をもたらした。HDXの反応時間が長くなると、タンパク質分析物の持続時間が短くなりました。β免疫グロブリンまたはβIGのAおよびB分散は、それらの配列中のわずか2アミノ酸残基によって異なり、EIC由来電気泳動図において2つの適切に分離されたピークを生じさせた。重水素標識された差異は、イオンの明確な質量分布をもたらした。CイオンよりもZイオンの相対的存在量が少ない数値は、CS82とCS176との間のフラグメンテーション効率を制限するベータIGの確認における固有のジソフィ化結合のために観察された。ベータIGAから産生されるフラグメントイオンの大部分、およびベータIGBは、同様の程度の重水素取り込みを示す。しかしながら、β IGAからの配列変動部位をカバーするより大きなセグメントは、β IGBよりも有意に大きい程度に脱送された。BGEのpHは、サンプルの等電点に応じて調整され、タンパク質凝集を防ぎ、複合体を維持しながら分離を容易にします。

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PAK2活性化のアミド水素/重水素交換とMALDI - TOF質量分析

タンパク質の立体構造とダイナミクスは、タンパク質の構造と機能の関係を理解するための鍵となります。高分解能質量分析と組み合わせた水素の交換は、タンパク質のコンフォメーションのダイナミクスを研究だけでなく、接触インタフェースおよびアロステリック効果を含むタンパク質 - リガンドとタンパク質 - タンパク質相互作用を特徴付けるための汎用的な方法である。...

水素交換質量分析法を用いてタンパク質のダイナミクスを分析する

ここでは、固体粉末中のタンパク質に対する固体アミド水素/重水素交換質量分析(ssHDX-MS)および固体光分解標識質量分析(ssPL-MS)の詳細なプロトコルを紹介します。この手法は、アモルファス固体におけるタンパク質の立体構造と相互作用に関する高分解能情報を提供し、製剤設計に役立つ可能性があります。...

質量分析は、凍結乾燥粉末中のタンパク質の構造と相互作用を研究するためのアプローチ

コンフォメーションの柔軟性は、タンパク質の機能に重要な役割を果たしています。本明細書において、我々は、規則及び不規則タンパク質に機能を駆動急速な構造変化をプロービングするための水素 - 重水素交換に結合された時間分解エレクトロスプレーイオン化質量分析法の使用を記載しています。...

時間分解エレクトロスプレーイオン化水素 - 重水素交換質量分析タンパク質の構造とダイナミクスを学ぶために

生物がその有効期間中に発生する最も困難なストレス条件の 1 つは酸化物質の蓄積を含みます。酸化ストレス時に細胞は分子シャペロンに大きく依存します。HDX MS...

Hsp33 の酸化還元規制シャペロン活性を定義および水素重水素交換質量分析法による Hsp33 の構造変化をマッピング

詳細なプロトコルは、分離、同定、キャピラリー ゾーン電気泳動-エレクトロ スプレー イオン化タンデム質量分析法 (CZE-ESI MS/ミリ秒) を使用して蛋白質のサンプルの proteoforms の特性に記述されています。単純な蛋白質のサンプルの proteoforms の高分解能特性と複雑なプロテオーム サンプルで proteoforms...

キャピラリー ゾーン電気泳動タンデム質量分析法による大規模なトップダウン プロテオミクス

ランチペプチド合成酵素は、ペプチド天然物の生合成中に多段階反応を触媒する。ここでは、ランチペプチド合成酵素の立体ダイナミクス、ならびにペプチド天然物生合成に関与する他の同様の酵素を研究するために使用できる、連続的なボトムアップ、水素重水素交換質量分析(HDX-MS)ワークフローについて述べています。...

ペプチド生合成酵素を調べた水素重水素交換質量分析(HDX-MS)プラットフォーム

単量体α-シヌクレインの構造アンサンブルは、その生理学的機能および物理化学的特性に影響を及ぼす。本プロトコルは、ミリ秒の水素/重水素交換質量分析およびその後のデータ分析を実行して、生理学的条件下でこの本質的に無秩序なタンパク質のモノマー上の立体構造情報を決定する方法を記載する。...

生理学的条件下でのα-シヌクレイン構造ダイナミクスの研究のためのミリ秒水素/重水素交換質量分析

ここでは、下流の調節エレメント拮抗モジュレータ、マイクロ秒およびミリ秒ダイナミクスおよびニューロンカルシウムセンサーへのカルシウムアソシエーションに関連付けられている構造変化のエネルギー論をモニターするために、DM-nitrophen、ケージドカルシウム化合物と組み合わせて光熱ビーム偏向技術の適用を報告。...

光熱ビーム偏向によって分離したタンパク質におけるミリ秒以下構造変化

この論文は、シュリーレン写真と質量分析を使用して、周囲イオン源のガス流を可視化するためのプロトコルを提示します。...

シュリーレン写真の使用とアンビエント質量分析の可視化

学ぶキャピラリー電気泳動ベースの水素/重水素交換法によるタンパク質立体構造解析。共存するタンパク質種を分離し、トップダウン質量分析で一次測定で構造差を評価する効率的な手法です。

トップダウン質量分析によるタンパク質の立体構造特性評価のためのキャピラリー電気泳動ベースの水素/重水素交換

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