トップダウン質量分析によるタンパク質の立体構造特性評価のためのキャピラリー電気泳動ベースの水素/重水素交換
2021年6月8日
ここでは、キャピラリー電気泳動ベースの水素/重水素交換(HDX)アプローチとトップダウン質量分析を組み合わせたプロトコルを紹介します。このアプローチは、同時差動HDXおよび電気泳動分離を行うことによって、異なる状態および異なるプロテオ形態のタンパク質を含む、異なるタンパク質種間の高次構造の違いを特徴付ける。
この方法により、異なるコンフォーマーまたはバリアントを含む共存するタンパク質種の分離と、それらの高次構造の違いのオンライン特性評価を単一のCEMS測定で完了することができます。電気泳動効果を利用して、HDX反応のためのほぼ100%の持続時間環境を提供し、トップダウンMS分析のためのHDX中の共存タンパク質種の直交分離を提供します。キャピラリー電気泳動の事前調整、水素交換、またはCE HDXセットアップから始めます。
50%メタノール、49%水および1%ギ酸の混合物中で超音波処理を使用して、室温で少なくとも30分間、マイクロバイアルCE-MS界面を通る流れをきれいにする。HPC修正キャピラリーをキャピラリー電気フェレーシスまたはCE装置に取り付けます。オートサンプラーを使用して、キャピラリーをバックグラウンド電解質溶液またはBGEで10分間すすぎ、BGEで満たしたままにします。
適当な長さの未変性溶融シリカキャピラリーチューブを改質剤溶液用の注入チューブとして使用する。ユニオンと適切なスリーブを使用して、調整剤チューブを鈍い温度で気密ガラスシリンジに接続し、注入ポンプを使用して改質剤溶液でチューブを少なくとも10分間すすぎます。対応する溶液をロードしたHPCコード化されたCEキャピラリーおよびモディファイアチューブの出口を、洗浄されたCE-MSインターフェースに挿入します。
調整剤溶液が界面の先端に達するように、注入ポンプでシリンジを前進させる。組み立てられたCE-MS界面を質量分析計のナノ電子噴霧イオン化源ハウジング上に取り付ける。CE-MSインターフェースに3~5キロボルトのスプレー電圧を印加します。
改質剤溶液に注入ポンプを毎分0.1〜10マイクロリットルの範囲の流量で注入し、CE-MSインターフェースの先端で安定したエレクトロスプレーを確保します。BGEとオートサンプラーを含むサンプルバイアルを配置し、後でブランク電気泳動図とブランク質量スペクトルを取得するために使用されます。注入量と注入パラメータの関係を使用して注入量を推定する。
オートサンプラーを用いて試料溶液を2つのPSIで適当な期間注入する。0〜2PSIの範囲の注入圧力で20キロボルトの電気泳動電圧を印加することによってCE分離を開始し、電気泳動を得る。一方、イオン電流グラフが時間の関数として取得され、対応するMSスキャンが自動的に単一のスペクトルに結合されないクロマトグラフィーモードでMSデータを取得する。
空白の電気泳動図と質量スペクトルを基準として保存します。所望の濃度のタンパク質試料溶液を含む試料バイアルをオートサンプラーに入れ、電気泳動的に分離された重水素標識タンパク質種の電気泳動およびMS1スペクトルを取得する。目的の種に対して、同じ実行内でMS1スペクトルを取得した後、または後続の別の実行でタンデムMs.測定を実行します。
各測定後、キャピラリーをBGEで20PSIの圧力で少なくとも10分間フラッシュします。CEMSインターフェースとすべてのチューブを清掃し、実験の完了時に保管してください。HDXエンドポイントサンプルのデータセットをMSで直接注入モードで取得します。
低い注入圧力は、CEピークのより良い分離をもたらしたが、実験の遊走時間と持続時間の両方の増加をもたらした。HDXの反応時間が長くなると、タンパク質分析物の持続時間が短くなりました。β免疫グロブリンまたはβIGのAおよびB分散は、それらの配列中のわずか2アミノ酸残基によって異なり、EIC由来電気泳動図において2つの適切に分離されたピークを生じさせた。
重水素標識された差異は、イオンの明確な質量分布をもたらした。CイオンよりもZイオンの相対的存在量が少ない数値は、CS82とCS176との間のフラグメンテーション効率を制限するベータIGの確認における固有のジソフィ化結合のために観察された。ベータIGAから産生されるフラグメントイオンの大部分、およびベータIGBは、同様の程度の重水素取り込みを示す。
しかしながら、β IGAからの配列変動部位をカバーするより大きなセグメントは、β IGBよりも有意に大きい程度に脱送された。BGEのpHは、サンプルの等電点に応じて調整され、タンパク質凝集を防ぎ、複合体を維持しながら分離を容易にします。
完全なトランスクリプトを表示し、数千本の科学動画にアクセス
概要
本プロトコルでは、キャピラリー電気泳動を用いた水素/重水素交換（HDX）法とトップダウン質量分析を組み合わせた手法について解説します。この手法により、差分HDXと電気泳動分離を同時に行うことで、異なる状態やプロテオフォームを含む様々なタンパク質種間における高次構造の違いを特性評価することが可能です。
研究の主要構成要素
科学分野
- 生化学
- 質量分析法
- タンパク質化学
背景
- キャピラリー電気泳動（CE）は、バイオ分子を分離するための強力な手法です。
- 水素/重水素交換（HDX）は、タンパク質のダイナミクスと構造に関する知見を提供します。
- トップダウン質量分析により、完全長のタンパク質およびそのバリアントの解析が可能です。
- この手法を用いることで、1回の測定で複数のタンパク質コンフォーマーを分析することができます。
研究目的
- タンパク質の高次構造を解析するための手法を開発すること。
- 共存するタンパク質種の分離を容易にすること。
- 電気泳動分離により、HDX測定の効率を高めること。
使用した方法
- キャピラリー電気泳動装置のプレコンディショニング。
- メタノール・水・ギ酸混合液を用いたCE-MSインターフェースの超音波洗浄。
- バックグラウンド電解質溶液によるキャピラリーの洗浄。
- 電気泳動中の制御環境下でのHDX反応の実施。
主な結果
- 異なるタンパク質コンフォーマーの分離に成功した。
- 単一のCEMS測定による構造的な違いの特性評価。
- オンライン分析における本手法の効率性を実証した。
- タンパク質種のダイナミクスに関する知見を提供した。
結論
- CE HDX法は、タンパク質構造の研究に有効です。
- このアプローチは、さまざまな種類のタンパク質や状態に適用可能です。
- これにより、タンパク質のダイナミクスを分析するための効率的なプロセスが提供されます。
よくある質問
産業界における重要性
タンパク質医薬品のコンフォーメーションの不均一性を解消することは、特に共存するタンパク質状態の高次構造およびダイナミクスを特性評価する上で、バイオ製薬の研究開発における極めて重要な課題です。このキャピラリー電気泳動ベースの水素/重水素交換（CE-HDX）法により、1回の測定でタンパク質の構造的差異をコンフォーマー特異的に分析することが可能となり、初期探索段階におけるターゲットバリデーションおよびメカニズムのデリスキングを支援します。電気泳動分離とトップダウンMSを統合することで、本アプローチはタンパク質の挙動に対する予測精度を高め、リード化合物同定時におけるGo/No-go判断の根拠を提供します。
バイオファーマR&Dにおける戦略的応用
初期探索およびターゲットバリデーション
- 科学的価値：タンパク質変異体とプロテオフォーム間の構造的な差異を解明することで、治療仮説の検証を可能にする。
- 運用の価値：コンフォーマー特異的な高次構造解析を通じて、機能的なターゲットバリデーションを支援する。
- 予測的価値：生物学的機能に関連する構造力学を明らかにすることで、ターゲット選択の信頼性を向上させる。
スクリーニングおよびアッセイの開発
- アッセイの準備：共存する状態を分離および特性解析することで、ダウンストリームのスクリーニングに適した生物学的に適切なタンパク質システムを調製します。
- 定量的出力：タンパク質のコンフォーマーの定量的比較を可能にする、グローバルおよびフラグメントレベルの重水素化測定値を提供します。
- 再現性：HDX中の残留プロトン性溶媒を最小限に抑え、一貫した結果を得るためにほぼ完全な重水素化環境を構築します。
トランスレーショナルおよび前臨床研究
- トランスレーショナルな連続性：溶液中でのタンパク質ダイナミクスを特性評価することにより、探索段階で得られた立体構造の知見を前臨床検証へと結びつけます。
- メカニズムに基づくリスク低減：タンパク質変異体における構造と機能の関係を明確にし、リード最適化における不確実性を軽減します。
- バイオマーカーの整合：疾患関連システムにおける機能的アウトカムに関連する立体構造バイオマーカーの同定を支援します。
パイプラインおよびワークフローの統合
この手法は、初期のターゲットバリデーションからリード化合物の同定に至るディスカバリーの連続的なプロセスに適合し、そこでは立体構造の解明がタンパク質工学やスクリーニングキャンペーンに活用されます。
- 探索生物学： 天然に近い条件下で共存するタンパク質のコンフォーマーを分離・分析することで、仮説検証を支援します。
- スクリーニング： タンパク質種に対して再現性のある定量的な構造リードアウトを提供し、アッセイの標準化を可能にします。
- 分析学： 全体的な重水素化レベルおよびフラグメント特異的な取り込みパターンを提供し、タンパク質状態の比較分析を容易にします。
- トランスレーショナルリサーチ： 構造ダイナミクスを機能的な結果に結びつけ、リスク調整された進展上の意思決定を支援します。
- 企業内での再利用： 複数のターゲットやプロジェクトにわたるタンパク質の不均一性を特性評価するための、再利用可能なプラットフォームとして機能します。
運用および企業への影響
- 科学的価値： コンフォメーションの不均一性を解消することで、タンパク質の挙動に関する予測の信頼性を向上させます。
- 運用的価値： 自動化されたCE-MSの統合と溶媒アーティファクトの最小化により、再現性とスケーラビリティを向上させます。
- 戦略的価値： タンパク質標的におけるメカニズムの不確実性を低減し、go/no-go判断の質を向上させます。
- ポートフォリオへの影響： 構造安定性とダイナミクスに基づいた、リスク調整後のタンパク質候補の優先順位付けを可能にします。
実施上の考慮事項
- キャピラリー電気泳動、質量分析、およびタンパク質のHDX（水素・重水素交換）の原理に関する専門知識が必要です。
- CE-MSインターフェースの互換性、背景電解質の最適化、および修飾液の送液に依存します。
- HDXのクエンチング、変性、およびMS測定パラメータのチーム間での標準化が必要です。
- 電気泳動条件下でのタンパク質のサイズ、電荷、および溶解性の変動に伴う適応上の検討が含まれます。
- 低注入圧力では分離能が向上しますが、分析時間が延長されるため、解析時間に制限があります。
