Name: ミトコンドリア病モデルのためのヒト脳オルガノイドの生成 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 9 s
Description: 学ぼう、ヒトiPS細胞由来脳オルガノイドを用いたミトコンドリア病モデリングプロトコル。高価なバイオリアクター不要で、ミトコンドリア機能評価と神経細胞マーカー解析により、治療標的の同定を支援します。

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ミリアム・ビュニングの技術サポートに感謝します。我々は、ドイツ・フォルシュングスゲミンシャフト(DFG)(PR1527/5-1からA.P.)、スパークとベルリン衛生研究所(BIH)(BIH検証資金からA.P.)、ユナイテッド・水戸からの支援を認める コンドリア病財団(UMDF)(リー症候群国際コンソーシアム補助金A.P.)、大学病院デュッセルドルフ(Forschungskommission UKDからA.P.)、ドイツ連邦教育研究省(BMBF)(e:バイオ若手研究者は、AZ 031L0211をA.P.に付与します。C.R.R.の研究室での作業は、DFG(FOR 2795 「ストレス下のシナプス」、Ro 2327/13-1)によってサポートされました。

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著者らは、競合する財政的利益や非財政的利益を宣言しない。

本論文では、ヒトiPSC由来の脳オルガノイドの再現性のある生成と、ミトコンドリア病のモデル化に用いることを説明する。ここで説明するプロトコルは、以前に公開された work20 に基づいて変更されます。本プロトコルの大きな利点の1つは、各オルガノイドを足場マトリックスに手動で埋め込む必要がなされないことである。実際、マトリックス溶液は、細胞培養培地に単に溶解される。さらに、オルガノイドはインキュベーター内の軌道シェーカー上に配置された標準的な組織培養6ウェルプレートで培養することができるので、高価なバイオリアクターを採用する必要はありません。この手順はまた、様々な個々のラインに由来する異なるオルガノイドを含む複数のプレートの並列栽培を可能にし、それによって実験のスループットを高め、異なるオルガノイドの成長プロファイルに出現する潜在的な違いをモニタリングすることを可能にする。我々は、一貫した結果で、健康なコントロールに由来する異なるiPSCとミトコンドリア病の影響を受ける個人を用いてこのプロトコルをテストした。
ミトコンドリア病のモデル化...

ミトコンドリア病は、代謝の内生誤差の最大のクラスを表します1.それらは、酸化リン酸化(OXPHOS)2、呼吸連鎖集合体、ミトコンドリアダイナミクス、ミトコンドリアDNA転写または複製を含む異なるミトコンドリアプロセスを破壊する遺伝子変異によって引き起こされる。エネルギー要件を有する組織は、特にミトコンドリア機能不全4の影響を受ける。したがって、ミトコンドリア病の患者は、典型的には早期発症の神経学的症状を発症する。
現在、ミトコンドリア病の影響を受ける小児に対する治療法はない5。ミトコンドリア病の薬剤開発の大きな障害は、ヒト疾患コース6を再現する有効なモデルの欠如である。現在研究されている動物モデルのいくつかは、患者7に存在する神経学的欠陥を示さない。したがって、ミトコンドリア病の神経病理学の根底にあるメカニズムはまだ完全には理解されていない。
最近の研究では、ミトコンドリア病の影響を受けた患者からiPSCを生成し、これらの細胞を使用して患者特異的神経細胞を得た。例えば、ミトコンドリア病に伴う遺伝的欠陥、リー症候群、細胞内の収差を生じさせるのが分かっており、細胞内の生体エネルギー8,9、タンパク質合成10、及びカルシウム恒常性9,11に収差を生じる。これらの報告は、ミトコンドリア病で起こる神経障害に関する重要な機械化的手がかりを提供し、これらの不治病の創薬への道を開いた12。
しかし、2次元(2D)文化は、3D臓器13の建築の複雑さと地域組織の調査を可能にしません。このことから、患者固有のiPSCs14 に由来する3D脳オルガノイドを使用することで、研究者はさらなる重要な情報を得ることができ、それによってミトコンドリア病が神経系の発達および機能にどのような影響を与えるかを解剖するのに役立つ可能性がある15。ミトコンドリア病を調べるiPSC由来の脳オルガノイドを用いた研究は、ミトコンドリア病の神経発達成分を解明し始めている。 
ミトコンドリア病に関連する変異を運ぶ脊髄オルガノイドは、ミトコンドリア脳症、乳酸アシドーシス、および脳卒中様エピソード症候群(MELAS)、神経新生の欠陥および遅れた運動ニューロン分化を示した16。ミトコンドリア病患者由来の皮質オルガノイドは、リー症候群、サイズの縮小、神経上皮芽発生の欠損、皮質アーキテクチャの喪失を示した17。リー症候群患者の脳オルガノイドは、疾患欠陥がミトコンドリア代謝にコミットできない神経前駆細胞のレベルで開始し、異常な神経細胞の分岐および形態形成を引き起こすことを示した。したがって、神経前駆物質はミトコンドリア病の細胞治療標的を表し、ミトコンドリア機能を促進する戦略は神経系の機能的発達を支え得る。
脳オルガノイドの使用は、ミトコンドリア病の神経発達成分を明らかにするのに役立つかもしれません.ミトコンドリア病は、主に早期発症神経変性症として考えられる5。しかし、神経発達上の欠陥は、発達遅延および認知障害を含むミトコンドリア病の影響を受ける患者にも存在する19。患者固有の脳オルガノイドは、これらの側面に対処し、ミトコンドリア病が人間の脳の発達にどのような影響を与えるかを解明するのに役立つ可能性があります。ミトコンドリア機能障害は、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病などの他のより一般的な神経疾患においても病態的役割を果たす可能性がある4。したがって、脳オルガノイドを用いた神経発達におけるミトコンドリア欠損の影響を解明することは、これらの疾患の研究にも役立つかもしれない。本論文では、ミトコンドリア病の疾患モデル化に使用できる再現性脳オルガノイドを生成するための詳細なプロトコルについて説明する。

<table><tbody><tr><td>2-メルカプトエタノール</td><td>Gibco</td><td>31350-010</td><td></td></tr><tr><td>Affinity Designer</td><td>Serif (Europe) Ltd</td><td></td><td>レイアウトソフトウェア;ベクトル グラフィックス エディター</td></tr><tr><td>アレクサ フルーア 488 ロバ アンチモルモット</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>SAB4600033-250UL</td><td>1:300</td></tr><tr><td>アレクサ フルオ 488 ロバ アンチマウス</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>A-31571</td><td>1:300</td></tr><tr><td>アンチマイシン A</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>1397-94-0</td><td></td></tr><tr><td>アンチベータ - チューブリン III (TUJ-1)</td> <td>シグマ アルドリッチ</td><td>T8578</td><td>1:2000</td></tr><tr><td>アルゴン レーザー</td><td>メレスグリオ</td><td></td><td>他のレーザー、例えば、488を発するダイオードレーザーは問題ありませんが、</td></tr><tr><td>アスコルビン酸</td><td>シグマ</td><td>A92902</td><td></td></tr><tr><td>B-27とビタミンA</td>ギ<td>ブコ</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>バクト寒天</td><td>ベクトンディキンソン</td><td></td><td>PBSで3%、-20°Cで溶液を保存します。C</td></tr><tr><td>BDNF</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-0811</td><td></td></tr><tr><td>cAMP</td><td>Sigma</td><td>D0627</td><td></td></tr><tr><td>Cell Star cell culture 6 well plate</td><td>Greiner-Bio-One</td><td>657160</td><td></td></tr><tr><td>Chemically Defined Lipid Concentrate</td><td>Gibco</td><td>11905031</td><td></td></tr><tr><td>Confocal レーザー走査型顕微鏡 C1</td><td>Nikon Microscope Solutions</td><td></td><td>モジュール式共焦点顕微鏡システム</td></tr><tr><td>Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement membrane matrix, Phenol Red-free, LDEV-free</td><td>Corning</td><td>356231</td><td>Matrix component</td></tr><tr><td>CyQUANT Cell Proliferation Assay Kit</td><td>Thermo Fisher</td><td>C7026</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>ThermoFisher</td><td>31330038</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2660-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Donkey anti-goat Cy3</td><td>Merckミリポア</td><td>AP180C</td><td>1:300</td></tr><tr><td>ロバ アンチマウス Cy3</td><td>メルク ミリポア</td><td>AP192C</td><td>1:300</td></tr><tr><td>ロバ アンチウサギ Cy3</td><td>メルク ミリポア</td><td>AP182C</td><td>1:300</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>ギブコ</td><td>14190250</td><td></td></tr><tr><td>DS-Q1Mc カメラ</td><td>ニコン顕微鏡ソリューション</td><td></td><td></td></tr><tr><td>エクリプス 90i 直立広視野顕微鏡</td><td>ニコン顕微鏡ソリューション</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eclipse E 600FN 直立顕微鏡</td><td>Nikon Microscope Solutions</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eclipse Ts2 倒立顕微鏡</td><td>Nikon Microsope Solutions</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EZ-C1 Silver Version 3.91</td><td>Nikon Microscope Solutions</td><td></td><td>共焦点顕微鏡用イメージングソフトウェア</td></tr><tr><td>FCCP</td><td>Sigma Aldrich</td><td>370-86-5</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>Gibco</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>GDNF</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-291</td><td></td></tr><tr><td>Glasgow MEM</td><td>Gibco</td><td>11710-035</td><td></td></tr><tr><td>ガラスパスツールピペット</td><td>ブランド</td><td>747715</td><td>逆</td></tr><tr><td>グルタマックス</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>ヘリウムネオンレーザー</td><td>メレスグリオ</td><td></td><td>他のすべてのレーザー、例えば、594を発するダイオードレーザーは問題ありません, too</td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Merck</td><td>H3149-25KU</td><td></td></tr><tr><td>HERACell 240i CO2 インキュベーター</td><td>Thermo Scientific</td><td>51026331</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Invitrogen</td><td>H3570</td><td>1:2500</td></tr><tr><td>Image J 1.53c</td><td>Wayne Rasband National Institute of Health</td><td></td><td>画像処理ソフトウェア</td></tr><tr><td>Injekt Solo 10 mL/ Luer</td><td>Braun</td><td>4606108V</td><td></td></tr><tr><td>ノックアウト血清交換</td><td>Gibco</td><td>10828010</td><td></td></tr><tr><td>レーザー (407 nm)</td><td>Coherent</td><td></td><td>他のレーザー、例えば、407を放射するダイオードレーザーは問題ありません、あまりにも</td></tr><tr><td>Map2</td><td>Synaptic Systems</td><td>No. 188004</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>Maxisafe 2030i</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MEM NEAA</td><td>Gibco</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR Plus</td><td>Stemcell Technology</td><td>85850</td><td>iPSC medium</td></tr><tr><td>Multifuge X3R Centrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td>10325804</td><td></td></tr><tr><td>MycoAlert Mycoplasma Detection Kit</td><td>Lonza</td><td># LT07-218</td><td></td></tr><tr><td>N2 Supplement</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>Needle for single usage (23G x 1"TW)</td><td>Neoject</td><td>10016</td><td></td></tr><tr><td>NIS-Elements Aadvanced Research 3.2</td><td>Nikon</td><td></td><td>イメージングソフトウェア</td></tr><tr><td>オリゴマイシン A</td><td>Sigma Aldrich</td><td>75351</td><td></td></tr><tr><td>オービタルシェーカー ハイドルフ ユニマックス 1010</td><td>ハイドルフ</td><td>543-12310-00</td><td></td></tr><tr><td>PAP ペン</td><td>Sigma</td><td>Z377821-1EA</td><td>スライド上に疎水性バリアを描くため。</td></tr><tr><td>パパイン解離システムキット</td><td>ワージントン</td><td>LK003150</td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>メルク</td><td>818715</td><td>PBSで4%、溶液を-20°Cで保存します。C</td></tr><tr><td>パスツールピペット 7mL</td><td>VWR</td><td>612-1681</td> 3 <td>mLまで目盛り付き</td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>プラン Apo VC 20x / 0.75 エア DIC N2&nbsp; &infin;/0.17 WD 1.0</td><td>Nikon Microscope Solutions</td><td></td><td>ドライマイクロスコープ 対物</td></tr>レンズ <tr><td>Plan Apo VC 60x / 1.40 oil DIC N2 &infin;/0.17 WD 0.13</td><td>Nikon Microscope Solutions</td><td></td><td>油浸顕微鏡対物</td></tr><tr><td>ポリスチレンペトリ皿(100 mm)</td><td>Greiner Bio-One</td><td>664161</td><td></td></tr><tr><td>細胞ストレーナーキャップ付きポリスチレン丸底チューブ(5 mL)</td><td>Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>塩化カリウム</td><td>Roth</td><td>6781.1</td><td></td></tr><tr><td>ProLong ガラス退色防止Moutant</td><td>Invitrogen</td><td>P36980</td><td></td></tr>定<tr><td>性的濾紙</td><td>VWR</td><td>516-0813</td><td></td></tr><tr><td>ロック インヒビティオール</td><td>メルク</td><td>SCM075</td><td></td></tr><tr><td>ロテノン</td><td>シグマ</td><td>83-794</td><td></td></tr><tr><td>S100&beta;</td><td>Abcam</td><td>Ab11178</td><td>1:600</td></tr><tr><td>SB-431542</td><td>ケイマンケミカルカンパニー</td><td>13031</td><td></td></tr><tr><td>メスの刃</td><td>ハインツ ヘレンツ ハンブルク</td><td>1110918</td><td></td></tr><tr><td>SMI312</td><td>バイオレジェンド</td><td>837904</td><td>1:500</td></tr><tr><td>重炭酸ナトリウム</td><td>メルク/シグマ</td><td>31437-1kg-M</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>ロス</td><td>3957</td><td></td></tr><tr><td>ナトリウムリン酸二水素</td><td>Applichem 131965</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ピルビン酸ナトリウム</td><td>Gibco</td><td>11360070</td><td></td></tr><tr><td>SOX2</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>Sc-17320</td><td>1:100</td></tr><tr><td>StemPro Accutase 細胞解離試薬</td><td>Gibco/StemPro</td><td>A1110501</td><td>試薬</td></tr><tr><td>A 瞬間接着剤 ゲル</td><td>UHU</td><td>63261</td><td>接着ゲル</td></tr><tr><td>SuperFrost Plus</td><td>VWR</td><td>631-0108</td><td></td></tr><tr><td>単回使用用シリンジ (1 mL)</td><td>BD Plastipak</td><td>300015</td><td></td></tr><tr><td>TB2 Thermoblock</td><td>Biometra</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TC Plate 24 Well</td><td>Sarstedt</td><td>83.3922</td><td></td></tr><tr><td>TC Plate 6 Well</td><td>Sarstedt</td><td>83.392</td><td></td></tr><tr><td>TGFbeta3</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-094-007</td><td></td></tr><tr><td>Tissue Culture Hood</td><td>ThermoFisher</td><td>51032711</td><td></td></tr><tr><td>TOM20</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-11415</td><td>1:200</td></tr><tr><td>Triton-X</td><td>Merck</td><td>X100-5ML</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 0.5M EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>15575020</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome Microm HM 650 V</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>生産が終了しましたが、他の調整可能なミクロトームも問題ありません。</td></tr><tr><td>ビブレータ ウィルキンソン クラシック カミソリ ブレード</td><td>ウィルキンソン ソード</td><td>70517470</td><td></td></tr><tr><td>ワットマン ベンチコート</td><td>メルク/シグマ</td><td>28418852</td><td></td></tr><tr><td>Wnt アンタゴニスト I</td><td>EMD ミリポア</td><td>コーポレーション 3378738</td><td></td></tr><tr><td>XF 96 細胞外フラックス分析装置</td><td>タツノオ</td>トシゴ バイオサイエンス <td>100737-101</td><td></td></tr><tr><td>XF アッセイ DMEM ミディアム</td><td>タツノオトシゴ バイオサイエンス</td><td>103680-100</td><td></td></tr><tr><td>XF Calibrant Solution</td><td>タツノオ</td>トシゴ バイオサイエンス <td>100840-000</td><td></td></tr><tr><td>XFe96 FluxPak (96ウェルマイクロプレート)</td><td>タツノオ</td>トシゴ バイオサイエンス <td>102416-100</td><td></td></tr></tbody></table>

ミトコンドリア病モデルのためのヒト脳オルガノイドの生成

Generation of Human Brain Organoids for Mitochondrial Disease Modeling

ミトコンドリア病は、代謝の生まれ変わりエラーの最大のクラスを表し、現在不治です。これらの疾患は、根本的なメカニズムが解明されたままの神経発達上の欠陥を引き起こす。主要な障害は、患者に見られる早期発症神経障害を再現する効果的なモデルの欠如である。誘導多能性幹細胞(iPSC)の技術の進歩により、神経系の発達と組織に対する疾患の影響を調べるための3次元(3D)脳オルガノイドの生成が可能になります。これらの著者を含む研究者は、最近、ミトコンドリア障害をモデル化するためにヒト脳オルガノイドを導入しました。本論文は、ヒトiPSC由来の脳オルガノイドの堅牢な生成と、ミトコンドリアの生体エネルギープロファイリングおよびイメージング分析におけるその使用に関する詳細なプロトコルを報告する。これらの実験は、脳オルガノイドを使用して代謝および発達の機能不全を調査することを可能にし、ミトコンドリア病の神経病理学を解剖するための重要な情報を提供するかもしれない。

ここで説明するプロトコルは、丸型オルガノイドの堅牢な生成を容易にする(図1A)。生成されたオルガノイドには、軸索(SMI312)および樹状突起(微小管関連タンパク質2(MAP2))に特異的なタンパク質マーカーを使用して視覚化できる成熟したニューロンが含まれています(図1B)。成熟したオルガノイドは、神経細胞(MAP2陽性)だけでなく、グリア細胞(例えば、アストロサイトマーカーS100カルシウム結合タンパク質B(S100ß)に陽性)も含む(図1B)。
共焦点顕微鏡を用いて、切れた脳オルガノイドを解析することで、細胞型や細胞構造の詳細な分布や組織を特定し、監視することが可能です。これは、ミトコンドリア病が神経系の発達にどのような影響を与えるかについての新しい洞察を提供する可能...

ヒト誘導多能性幹細胞由来の脳オルガノイドの生成とミトコンドリア病のモデル化におけるその使用に関する詳細なプロトコルについて述べています。

Mitochondrial diseases represent the largest class of inborn errors of metabolism and are currently incurable. These diseases cause neurodevelopmental ...

このプロトコルは、ミトコンドリア病を研究するために脳オルガノイドを使用することを目的としています。ミトコンドリアの特性評価において再現性のある脳オルガノイドを生成するために開発されました。この方法は、高価なバイオリアクターと時間のかかる埋め込み手順を必要としません。したがって、実装とアップスケールが容易です。このプロトコルは、再現性脳オルガノイドを生成し、そのミトコンドリアの特性をテストすることを可能にします.これは、治療不可能なミトコンドリア病の介入標的の同定につながる可能性があります。まず、6ウェルプレートにコーティングされたiPSC培地でフィーダーフリー条件でヒトiPSCを培養し、加湿組織培養インキュベーターで摂氏37度と5%の二酸化炭素を保ちます。iPSCを80%合流で通過し、酵素を含まない剥離媒体を使用して、1~4~12の比率で対応しています。細胞生存率を高めるために、各分割後に10個のマイクロモルロ関連プロテインキナーゼまたはROCK阻害剤を加える。80%iPSCをゼロ日に解約します。皮質分化培地1またはCDM1を準備し、細胞に加える前に室温で事前に温めます。IPSCを含む井戸をPBSで洗浄し、死んだ細胞や破片を除去します。各ウェルに500マイクロリットルの予熱化試薬Aを加え、摂氏37度で5分間インキュベートします。顕微鏡で確認して、細胞の剥離を確認します。iPSC培地を1ミリリットル加え、試薬Aを希釈して活性を中和する。1,000マイクロリットルピペットを使用して、上下に配管して細胞を解体し、細胞懸濁液を15ミリリットルの遠心分離管に移します。iPSCを室温で5分間5分間Gの125倍に静かに遠心し、上清を慎重に吸引して細胞ペレットを乱さないようにします。1ミリリットルのCDM1でペレットを再懸濁して、単一の細胞懸濁液を得て、細胞数を数える。20マイクロモルロック阻害剤、3マイクロモルWNTカテニン阻害剤またはIWR-1、および5マイクロモルSB-431542を補ったCDM1の100マイクロリットルあたり9,000iPSCで播種培地を調製します。96ウェルV底板にウェルあたり100マイクロリットルの播種培地を加えます。プレートを加湿した組織培養インキュベーターで摂氏37度、二酸化炭素5%に保ちます。神経球を生成するには、初日に、定義された滑らかな境界を持つ丸い細胞集合体が形成されていることを観察する。集計の周囲の死んだセルに注意してください。37°Cと5%の二酸化炭素で培養を継続します。3日目には、側面を3回タップしてプレートを攪拌して死んだ細胞を取り外し、20マイクロモルROCK阻害剤、3つのマイクロモルIWR-1、および5つのマイクロモルSB-431542を補ったCDM1の100マイクロリットルを各ウェルに加えます。プレートをインキュベーター

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ミトコンドリア病モデルのためのヒト脳オルガノイドの生成

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