NO-Redox生物学研究のための骨髄由来マクロファージの単離と 体外 培養
2022年5月31日
このプロトコルは、NO-酸化還元生物学を研究するために、テトラヒドロビオプテリン(BH4)および誘導性一酸化窒素合成酵素(iNOS)欠損初代マウスマクロファージを培養するために確立されている。この研究は、実験結果と結果の解釈を混乱させる可能性のある従来の単離および培養方法に見られるBH4およびその他の人工物の潜在的な汚染を減らすことに焦点を当てています。
このプロトコールは、酸化還元機構との干渉を避けるために、低レベルのBH4および硝酸塩を含む慎重に定義された培地および血清を使用して、iNOSまたはBH4欠損マウスからの骨髄由来マクロファージを培養するのに役立ちます。培養プロセスにおける潜在的な汚染物質のレベルを慎重に制御することにより、一酸化窒素干渉を制限し、モデルシステムの精度と再現性を確保することができます。この方法は、ビオプテリン、一酸化窒素、およびこれらの必須化合物に関連する下流因子の正確な測定を可能にする。
この手順を実演するのは、私たちの研究室のポスドク研究員であるThomas Nichol博士です。まず、脚を70%エタノールに2分間入れて、毛皮や残留物を洗い流します。次に、脚を清潔で無菌の細菌学的ペトリ皿に移します。
刃で骨の長さに沿って慎重にこすり、腱を切り裂き、骨から筋肉を取り除きます。骨から筋肉が取り除かれたら、膝のすぐ下の脛骨の上部にある骨端を切り取ります。脛骨は、腓骨との交差点のすぐ上の下端で切断することができる。
最後に、膝関節と股関節のすぐ手前にある大腿骨の両端の骨端を切り取ります。骨髄を洗い流すには、10ミリリットルのシリンジに10ミリリットルのPBSを入れ、針に取り付けます。次に、針を骨の髄腔に挿入する。
1〜2ミリリットルのPBSで静かに洗い流し、針を上下に動かします。次いで、懸濁液を1ミリリットルのシリンジに5〜10回出し入れして解凝集させる。懸濁液を1ミリリットルのシリンジに集め、70マイクロメートルのセルストレーナーに通して清潔な50ミリリットルの遠沈管に入れます。
最後に、サンプルを氷の上に置きます。後で使用するために骨髄を凍結するには、細胞を1000Gで室温で5分間遠心分離する。上清を捨て、赤色ペレットを2ミリリットルの不凍液に再懸濁する。
その後、摂氏80度で一晩インキュベートします。凍結した場合は、サスペンションを摂氏 37 度で急速に解凍します。細胞懸濁液を、3ミリリットルのDMEM/F-12培地を含む清浄な滅菌チューブに移す。
次に、遠心分離により細胞をペレット化する。上清を捨て、ペレットを調製したDMEM/F-12培地3ミリリットルに再懸濁する。細胞をカウントし、調製したDMEM/F-12培地中の非TCコーティングされたプラスチック製品にプレートします。
次に、細胞を摂氏37度で5%の二酸化炭素でインキュベートする。5日目に、DMEM/F-12培地の元の容量の50%を加えて細胞に供給します。6日目に、調製したGM-CSFを終濃度50ナノグラム/マイクロリットルに細胞培養培地に直接添加して細胞を刺激する。
7日目に、細胞からすべての培地を除去します。次いで、予め加温したPBSで細胞を短時間洗浄し、2%低エンドトキシンFBS、1Xペニシリンまたはストレプトマイシン、L-グルタミン、M-CSFあたり25ナノグラム、およびGM-CSFマイクロリットルあたり50ナノグラムを含むDMEM/F-12培地を加える。最後に、細胞を培地中で一晩インキュベートし、マクロファージをM0表現型に活性化する。
M1表現型の場合、LPSあたり100ナノグラム、およびマイクロリットルあたり10ナノグラムのIFN-γで細胞を刺激する。M2表現型の場合、1マイクロリットルあたり100ナノグラムのIL-4で細胞を刺激する。細胞を一晩インキュベートする。
8日目に、細胞は研究者のニーズに応じて収穫または下流処理の準備が整います。10%FBSを補充した培地は、M-CSFおよびGM-CSF、またはLCMにかかわらず、類似の亜硝酸塩およびテトラヒドロビオプテリンを有していた。しかし、総ビオプテリンレベルはLCM補充培地で高かった。
しかしながら、異なるLCMバッチ間でより多くの変動性は観察されなかった。PCRは野生型マウスで1030塩基対産物を示し、一方GCHノックアウトマウスは1392塩基対産物を産生し、臨界エクソンの切除を確認した。タモキシフェン処理はノックアウト細胞中のGCHタンパク質を消失させた。
ノックアウトおよびコントロール細胞は、LPSおよびIFN刺激後も依然としてiNOSを産生した。条件付きGCHノックアウトマウスから培養したBMDMは、テトラヒドロビオプテリンの有意な減少および亜硝酸塩の減少を示した。LCM培地で培養した同じ細胞はGCH1発現を有さなかった。
しかし、細胞はノックアウト後にかなりの量のテトラヒドロビオプテリンおよび亜硝酸塩を産生する。8日目に、異なる濃度のタモキシフェンにおける非活性化対照とGCHノックアウトBMDMとの間に形態に有意差はなかった。BMDMは、丸い付着細胞と細長い四肢を有する非刺激マクロファージに期待される特徴を示す。
このような一次細胞を扱う場合、すべての組織と機器を徹底的に滅菌することが不可欠です。さらに、適切な培地およびサプリメントを選択することは、低一酸化窒素およびBH4環境を維持するために重要である。細胞ペレットおよび培地は、一酸化窒素、ビオプテリン、または細胞酸化還元状態の役割に焦点を当てて、様々な下流用途に使用することができる。
それは、とりわけHPLC、qPCR、およびウェスタンブロットを含み得る。
概要
このプロトコルでは、テトラヒドロビオプテリン（BH4）および誘導型一酸化窒素シンターゼ（iNOS）欠損マウス一次マクロファージの培養法について解説します。実験の精度を高めるため、従来の培養法におけるコンタミネーションやアーティファクトを最小限に抑えることに重点を置いています。
研究の主要構成要素
科学分野
- 神経科学
- 細胞生物学
- レドックス生物学
背景
- 骨髄由来マクロファージは、一酸化窒素の生物学的研究において極めて重要です。
- 従来の分離方法では、結果に影響を及ぼす不純物が混入する可能性があります。
- BH4および硝酸塩のレベルを低く維持するためには、慎重な培地選択が不可欠です。
- 正確な実験結果を得るためには、酸化還元メカニズムを理解することが不可欠です。
研究目的
- 遺伝子組み換えマウスからマクロファージを培養するための信頼性の高いプロトコルを開発すること。
- 実験モデルにおける一酸化窒素による干渉を低減すること。
- ビオプテリンおよび一酸化窒素の正確な測定を容易にすること。
使用した手法
- iNOS欠損またはBH4欠損マウスからの骨髄の分離。
- 低BH4および低硝酸塩濃度の限定培地の使用。
- M0、M1、およびM2表現型を得るための細胞培養および刺激。
- 各種アッセイによるビオプテリンおよび一酸化窒素レベルの分析。
主な結果
- 培養条件を制御することで、再現性のあるマクロファージモデルが得られた。
- ノックアウト細胞とコントロール細胞の間で、ビプテリンおよび亜硝酸塩レベルに有意な差が観察された。
- 細胞形態は、異なる処理間でも一貫していた。
- 特定のサイトカイン刺激により、マクロファージの効果的な活性化が達成された。
結論
- このプロトコルは、NOレドックス生物学を研究するための堅牢な手法を提供します。
- 正確な結果を得るためには、不純物のレベルを低く維持することが不可欠です。
- 今後の応用として、一酸化窒素およびビオプテリンに関連するさまざまなダウンストリーム解析が考えられます。
よくある質問
産業界における重要性
このプロトコルにより、初代マクロファージ培養における一酸化窒素（NO）およびレドックス環境の精密な制御が可能となり、免疫代謝および炎症性疾患研究における重要な課題を解決できます。BH4およびNOの測定を妨げる不確定成分を最小限に抑えることで、免疫腫瘍学や自己免疫疾患プログラムにおける標的バリデーションに不可欠な、再現性のあるメカニズム研究を支援します。遺伝的に定義されたモデルと定義培地を使用することで、初期探索ワークフローにおける予測の信頼性が向上します。
バイオ医薬品研究開発における戦略的応用
初期探索およびターゲット検証
- 科学的価値： BH4欠損およびiNOS欠損モデルを用いてマクロファージにおけるNOレドックスシグナリング経路の解析を可能にし、治療仮説のリスクを低減します。
- 運用上の価値： 未定義の血清やコンディショニング培地による実験的な変動を抑え、研究室間でのアッセイの再現性を向上させます。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 科学的価値： 一酸化窒素の産生またはビオプテリン代謝を調節する化合物のスクリーニングのための、標準化されたマクロファージモデルを提供します。
- 実用的価値： HPLCによる亜硝酸塩およびビオプテリンレベルなどの定量的な読み取りをサポートし、化合物スクリーニングにおける用量反応分析を可能にします。
トランスレーショナルおよび前臨床研究
- 科学的価値： 疾患関連システムにおける免疫代謝メカニズムの研究を促進し、自然免疫機能とレドックス生物学を関連付けます。
- 運用的価値： 定義されたサイトカイン刺激を用いて一貫した表現型検証（M0、M1、M2）を可能にし、前臨床モデルの再現性をサポートします。
パイプラインおよびワークフローの統合
この手法は、リード化合物の同定前に、ターゲット結合およびパスウェイ解析のための信頼性の高い初代マクロファージのソースを提供することで、初期の創薬ワークフローに組み込まれます。
- 探索生物学：マクロファージが介在する炎症および免疫調節におけるNO依存性経路のメカニズム上のリスク低減を支援します。
- スクリーニング：一酸化窒素およびレドックス共因子のレベルに対する化合物の影響を評価するための、再現性のある細胞システムを提供します。
- 分析：レドックス感受性経路における標的変調を評価するための主要なバイオマーカーである、ビオプテリンおよび亜硝酸塩の正確な定量分析を可能にします。
- トランスレーショナルリサーチ：一貫したマクロファージの活性化と表現型特性評価を通じて、in vitroでの知見を前臨床段階の連続性へと繋げます。
- 企業の再利用：複数の治療領域にわたる免疫代謝およびレドックスメカニズムを研究するための、再利用可能なプラットフォームを確立します。
運用および企業への影響
- 科学的価値：一酸化窒素およびビオプテリン関連シグナリングにおけるメカニズム的な曖昧さを排除することで、予測の信頼性を向上させます。
- 運用上の価値：定義された培地および遺伝子モデルを通じて標準化とスケールアップを促進し、バッチ間の変動を最小限に抑えます。
- 戦略的価値：生理学的に適切な細胞における標的パスウェイ調節に関する信頼性の高いデータを提供することで、go/no-go判定を改善します。
- ポートフォリオへの影響：免疫代謝および炎症パスウェイを標的とする化合物の、リスク調整済み優先順位付けを可能にします。
実施上の考慮事項
- 初代細胞の単離、無菌的な組織操作、およびマクロファージ培養技術の専門知識が必要です。
- 遺伝子改変マウスモデル（例：GCH欠損マウス）へのアクセス、および骨髄フラッシングおよび細胞ストレーニング用の設備に依存します。
- 実験的コントロールを維持するため、低BH4および低硝酸塩レベルの標準化された培地調製が必要です。
- 本プロトコルを他のマクロファージソースや刺激条件に拡張する際は、適応に関する検討が必要です。
- エンドトキシンフリー試薬の使用や、過剰活性化を避けるためのサイトキンの慎重なタイトレーションなど、実用上の制限が含まれます。
