脱細胞化肺スライスから調製された人工肺組織
2022年1月21日
このプロトコールは、脱細胞化された精密切断肺スライスに肺胞上皮2型細胞、線維芽細胞、および内皮細胞を再移入することによって、再現性のある小規模の操作された肺組織を生成する方法を記載している。
このプロトコルは、三次元組織培養基質および適度なスループットとしての無傷の肺細胞外マトリックスの反復可能な使用を可能にする。操作された肺組織システムの主な利点は、プラットフォームの柔軟性です。ELTは、関心のある様々な組織足場、細胞、または培養培地を使用するように適合させることができる。
肺が抽出されたら、10ミリリットルのシリンジにフェノールレッドを含まないアガロースとHBSSを充填します。気管カニューレを介して約10ミリリットルの空気で肺を膨らませ、肺葉の最も遠位先端が膨張するまで、直ちに気管カニューレを介して調製されたアガロースを注入する。4方向活栓から気管カニューレの女性のルアーロックに白いキャップを取り付けて気管をキャップします。
肺を氷の上の150ミリメートルのペトリ皿に入れて、アガロースが固まるようにします。原稿のプロトコルに従って肺スライスを準備し、100ミリメートルのペトリ皿に1/3容量のPBSを充填する。カセットとタブを鉗子を使用して皿に移す。
スライスが凍結している場合は、室温のPBSに注いで一度に1皿ずつ解凍します。次に、解凍したスライスを150ミリメートルのペトリ皿に移す。細かい鉗子または止血剤を使用してスライスを静かに広げ、組織の周囲から余分なPBSを慎重に吸引します。
次に、カミソリの刃の全長を皿にしっかりと押し付け、それを左右にわずかに揺らすことによって、スライスから幅3ミリメートル、少なくとも9ミリメートルの長さのストリップを切り取ります。ティッシュストリップをカセットにクリップで留めるには、カセットの上に浮かべ、両端のクリップの穴を越えて伸びるように慎重に中央に配置します。タブを細い鉗子で片方の端の穴に部分的に入れ、組織を静かにまっすぐにして、2番目のタブをセットします。
最後に、鉗子を使用して各タブを完全に押し込み、組織を固定します。すべての側面をクリッピングした後、カセットを入れた100ミリメートルの皿を層流フードに移します。第1の脱細胞化溶液を含む6ウェルプレートにカセットを移し、湾曲した止血剤を用いて、切り欠きのある側面を把持した。
次いで、6ウェルプレートを30RPMのオービタルシェーカー上に10分間置く。各ウェルから流体を吸引し、次いでそれをウェル当たり3ミリリットルの第2の脱細胞化溶液と交換する。プレートを30RPMのオービタルシェーカーの上に置き、5分間インキュベートする。
原稿の脱細胞化プロトコルに概説されているように、各溶液でこのプロセスを繰り返します。PBSで最終すすぎを行った後、組織を抗生物質および抗真菌剤を含む新鮮なPBSを含む滅菌6ウェルプレートに移し、摂氏37度で48時間インキュベートする。抗生物質および抗真菌剤で滅菌した後、肺組織足場を直ちに播種するか、摂氏4度で最大30日間保存することができる。
培養に利用する前に、摂氏4度で保存した足場を、新鮮なPBSおよび抗生物質および抗真菌薬と共に、追加の滅菌ステップとして摂氏37度で一晩インキュベートする。次いで、足場を滅菌PBSですすぎ、1ウェルあたり5ミリリットル、3回、それぞれ5分間すすいだ。位相差顕微鏡下で足場を倍率5倍で調べ、播種する組織を選択する。
内皮細胞懸濁液を内皮培地中に500万細胞/ミリリットルで調製し、スライスあたり500,000個の内皮細胞を播種するのに十分な細胞を有する。オートクレーブ処理された播種浴を100ミリメートルのペトリ皿に入れ、すすぎ足場を逆さまに慎重に播種浴に移します。調製した細胞懸濁液を穏やかに旋回させて混合する。
次いで、ウェルの基部にある各組織の上に100マイクロリットルの細胞を直接慎重にピペットし、ピペットチップで組織を損傷しないように注意する。播種した組織を細胞培養インキュベーターに移す。内皮細胞播種から24時間後、手動ピペットを用いて予め加温した培養培地900マイクロリットルを各ウェルに加え、次いでプレートをインキュベーターに戻した。
細胞播種24時間後、培地を除去し、1ウェルあたり1ミリリットルの新鮮な内皮培地を交換する。内皮細胞を播種してから72時間後に、AEC2s、又は肺胞上皮II型細胞、及び線維芽細胞を血球計数器を用いて計数し、AEC2増殖培地中の1:1細胞懸濁液を1ミリリットル当たり500万細胞で調製した。各播種浴から培地をよくピペットでピペットし、調製した細胞懸濁液を穏やかに旋回させた。
ウェルの基部にある各組織の上に100マイクロリットルの細胞を直接ピペットする。播種した組織を細胞培養インキュベーターに移す。2時間後、予め加温したAEC2増殖培地900マイクロリットルを各ウェルに加え、次いでプレートをインキュベーターに戻した。
AEC2sおよび線維芽細胞を用いて24時間培養した後、1ウェルあたり、カセットあたり1ミリリットルの予め加温されたAEC2増殖培地を含む12ウェルプレートを作製する。播種浴の各ウェルから800マイクロリットルの培地をピペットし、次いで、播種浴からカセットを取り出し、それらを右側から調製した12ウェルプレートまで移し、1ウェルにつき1つのカセットを移す。ガラス製パスツールピペットを使用して、所望の培養期間の間、1日おきに培地を慎重に交換する。
培養期間を通して5倍の倍率で位相差顕微鏡を介して組織再集団化の程度をモニターする。組織足場のHおよびE染色は、目に見える細胞核を有さずに脱細胞化後に保存された肺胞構造を示した。脱細胞化した細胞外マトリックス足場材を位相差顕微鏡により倍率5倍で観察したときに肺胞組織を観察した。
大きな枝分かれした気道と血管もいくつかのスライスで見えました。培養7日目に、位相差顕微鏡は、操作された肺組織における再細胞化のパターンが、再集団化が成功した場合の組織肺胞構造をエミュレートすることを示した。貧弱な再細胞化も目に見えた。
7日目または8日目のHおよびE染色は、肺胞中隔の再定常性を示した。免疫蛍光静置により、プロコラーゲンI型α1陽性線維芽細胞、ABCA3陽性AEC2s、CD31陽性内皮細胞、SPB陽性AEC2sが豊富に存在することが明らかになった。さらに、チミジンアッセイは、多くの増殖AEC2を示した。
この技術は、肺組織工学のための戦略の開発を容易にし、肺胞内のII型細胞の増殖および分化を支持するキューの調査を可能にした。
概要
このプロトコルは、細胞除去された精密切断肺切片に肺泡上皮細胞2型、線維芽細胞、および内皮細胞を再植入することで、再現性のある小規模な工学的肺組織を生成する方法を説明しています。工学的肺組織システムは、様々な組織足場、細胞、または培養培地を使用する柔軟性を提供します。
主要な研究要素
科学の分野
- 神経科学
- 生物学
- 組織工学
背景
- 細胞除去された肺組織は細胞再植入のための足場を提供します。
- 肺泡上皮細胞2型は肺機能において重要な役割を果たします。
- 組織工学の理解は再生医療を進歩させることができます。
- 中程度のスループット手法は再現性にとって不可欠です。
研究の目的
- 肺組織を工学するための信頼できる方法を開発すること。
- 組織足場の適応性を評価すること。
- 肺細胞の再植入効率を評価すること。
使用された方法
- 細胞除去プロトコルを使用した肺足場の準備。
- 内皮細胞および肺泡上皮細胞2型の播種。
- 位相差顕微鏡による組織再植入のモニタリング。
- 組織構造の評価のためのH and E染色。
主な結果
- 細胞除去後の肺泡構造の成功的な保存。
- 顕微鏡で観察された組織再植入の証拠。
- 再細胞化パターンの変動が認められました。
- 免疫蛍光染色により足場内の細胞存在が確認されました。
結論
- 工学的肺組織システムは適応性があり再現可能です。
- 位相差顕微鏡は組織の健康状態をモニタリングするのに効果的です。
- さらなる最適化により再細胞化の成果が向上する可能性があります。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Engineered lung tissues (ELTs) derived from decellularized precision-cut lung slices provide a physiologically relevant 3D model for studying alveolar biology, enabling mechanistic de-risking of pulmonary targets and pathways. This platform supports target validation by recapitulating native lung extracellular matrix and multi-cellular interactions, improving predictive confidence in early discovery. The system facilitates translational continuity from discovery through preclinical evaluation by maintaining alveolar epithelial type 2 cell function in a disease-relevant system.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses within a native-like alveolar microenvironment comprising epithelium, mesenchyme, and endothelium.
- Operational Value: Supports functional target validation through recellularization of acellular scaffolds with primary lung cells, reducing mechanistic ambiguity.
- Scientific Value: Enhances predictive confidence by modeling cell-cell and cell-matrix interactions within the alveolus, informing pathway clarification and portfolio triage.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems with preserved alveolar architecture for downstream compound screening and biomarker assessment.
- Operational Value: Addresses assay standardization and reproducibility through cassette-based handling and parallel seeding of multiple ELTs.
- Scientific Value: Enables reliable compound evaluation by providing quantitative readouts via phase contrast microscopy, immunofluorescence, and hemocytometer-based cell counting.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports disease relevance through alveolar-like structures containing AEC2s, fibroblasts, and endothelial cells within native-like ECM.
- Operational Value: Ensures translational continuity by maintaining AEC2 phenotype and function for at least 7 days in serum-free, chemically-defined medium.
- Scientific Value: Facilitates risk-adjusted advancement decisions by modeling biochemical signals regulating AEC2s and their niche, enabling mechanistic de-risking.
Pipeline & Workflow Integration
The ELT platform integrates into the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical studies, supported by its ability to model alveolar structure and function.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling studies of cell-cell and cell-matrix interactions within the alveolus.
- Screening: Delivers assay readiness and reproducibility through standardized cassette handling and parallel tissue preparation.
- Analytics: Provides quantitative measurements including phase contrast microscopy for repopulation monitoring, immunofluorescence for cell-specific markers (ABCA3, CD31, pro-collagen I), and hemocytometer-based counting of AEC2s and fibroblasts.
- Translational Research: Connects discovery to preclinical continuity through preserved alveolar septa repopulation and sustained AEC2 marker expression (SPB, ABCA3) over culture duration.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform adaptable to various tissue scaffolds, cell types, and culture media, supporting scalable workflows across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence through mechanistic de-risking of alveolar targets and reduction of biological uncertainty in pulmonary programs.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability via cassette system and parallel processing of multiple ELTs.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions by enabling early assessment of target engagement in a native-like lung microenvironment.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization based on functional readouts of AEC2 proliferation, differentiation, and niche interactions.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue handling, primary cell culture, and decellularization protocols.
- Dependent on instrumentation for precision slicing (450 µm thickness), orbital shaking (30 RPM), and phase contrast microscopy (5X magnification).
- Necessitates cross-team standardization for cassette preparation, sterile seeding, and medium exchange procedures.
- Involves adaptation considerations when applying the system to human or disease-model lung scaffolds.
- Practical limitations include variability in recellularization patterns and dependence on optimal cell seeding density and medium conditions.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:35
Harvest of Rat Lungs
1:15
Cutting and Clipping the Lung Slices
2:25
Slice Decellularization
3:35
Slice Recellularization and Culture
6:20
Results: Visualization of the Structure of Decellularized Lung Scaffolds and Recellularized Engineered Lung Tissues (ELTs)
7:35
Conclusion
