Name: 反復エピゲノム解析のための再利用可能な単一細胞 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-11T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: 学ぶ反復エピゲノム解析法。同一細胞を再利用して複数のエピジェネティックマークと転写因子を解析し、統計的検証を可能にする。希少な患者細胞のエピゲネティック治療設計や遺伝子発現制御研究に有用である。

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プロジェクトの概念化段階でコメントをくださったDavid Sanchez-Martin博士とChristopher B. Buck博士に感謝します。また、予備実験の支援を提供してくれたGenomics Core、Center for Cancer Research、National Cancer Institute、National Institutes of Health、および計算分析のアドバイスを提供してくれたCollaborative Bioinformatics Resource、CCR、NCI、NIHにも感謝します。この方法で使用されるDNAポリメラーゼの最適化を支援してくれたAnna Word氏に感謝します。この研究では、NIHHPCバイオウルフクラスター(http://hpc.nih.gov)の計算リソースを利用しました。このプロジェクトは、がん研究センター、国立がん研究所、国立衛生研究所、NCIディレクターズイノベーションアワード(#397172)、および契約番号HHSN261200800001Eに基づく国立がん研究所からの連邦資金によってサポートされています。Tom Misteli Drs、Carol Thiele、Douglas R. Lowy、および細胞腫瘍学研究所のすべてのメンバーに、生産的なコメントをいただき、感謝します。

<ol><li>Perkel, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+analysis+enters+the+multiomics+age%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-cell analysis enters the multiomics age.</a> Nature. 595 (7868), 614-616 (2021).</li>
<li>Clark, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((scNMT-seq+enables+joint+profiling+of+chromatin+accessibility+DNA+methylation+and+transcription+in+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">scNMT-seq enables joint profiling of chromatin accessibility DNA methylation and transcription in single cells.</a> Nature Communications. 9 (1), 781(2018).</li>
<li>Ma, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+potential+identified+by+shared+single-cell+profiling+of+RNA+and+Chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Chromatin potential identified by shared single-cell profiling of RNA and Chromatin.</a> Cell. 183 (4), 1103-1116 (2020).</li>
<li>Zhu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ultra+high-throughput+method+for+single-cell+joint+analysis+of+open+chromatin+and+transcriptome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">An ultra high-throughput method for single-cell joint analysis of open chromatin and transcriptome.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 26 (11), 1063-1070 (2019).</li>
<li>Zhu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Joint+profiling+of+histone+modifications+and+transcriptome+in+single+cells+from+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Joint profiling of histone modifications and transcriptome in single cells from mouse brain.</a> Nature Methods. 18 (3), 283-292 (2021).</li>
<li>Mimitou, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scalable%2C+multimodal+profiling+of+chromatin+accessibility%2C+gene+expression+and+protein+levels+in+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Scalable, multimodal profiling of chromatin accessibility, gene expression and protein levels in single cells.</a> Nature Biotechnology. 39 (10), 1246-1258 (2021).</li>
<li>Ohnuki, H., Venzon, D. J., Lobanov, A., Tosato, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iterative+epigenomic+analyses+in+the+same+single+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Iterative epigenomic analyses in the same single cell.</a> Genome Research. 31 (10), 1819-1830 (2021).</li>
<li>Tosato, G., Ohnuki, H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTosato%2C+G+%22Methods+of+preparing+a+re-usable+single+cell+and+methods+fro+analyzing+the+epigenome%2C+transcriptome%2C+and+genome+of+a+single+cell%22">Methods of preparing a re-usable single cell and methods fro analyzing the epigenome, transcriptome, and genome of a single cell</a>. , EP 3619307, US 202001026704 (2021).</li>
<li>Harada, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chromatin+integration+labelling+method+enables+epigenomic+profiling+with+lower+input%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A chromatin integration labelling method enables epigenomic profiling with lower input.</a> Nature Cell Biology. 21 (2), 287-296 (2019).</li>
<li>Egelhofer, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+assessment+of+histone-modification+antibody+quality%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">An assessment of histone-modification antibody quality.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 18 (1), 91-93 (2011).</li>
<li>Marina, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TET-catalyzed+oxidation+of+intragenic+5-methylcytosine+regulates+CTCF-dependent+alternative+splicing%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">TET-catalyzed oxidation of intragenic 5-methylcytosine regulates CTCF-dependent alternative splicing.</a> EMBO Journal. 35 (3), 335-355 (2016).</li>
<li>Weast, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWeast%2C+RC+%22Handbook+of+chemistry+and+physics%3A+a+ready-reference+book+of+chemical+and+physical+data.+56th+edn%22">Handbook of chemistry and physics: a ready-reference book of chemical and physical data. 56th edn</a>. Weast, R. C., Astle, M. J., Beyer, W. H. , Chemical Rubber Company Press. (1975).</li>
<li>Aydin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+short+history%2C+principles%2C+and+types+of+ELISA%2C+and+our+laboratory+experience+with+peptide%2Fprotein+analyses+using+ELISA%5BTitle%5D)+AND+%22Peptides%22%5BJournal%5D)">A short history, principles, and types of ELISA, and our laboratory experience with peptide/protein analyses using ELISA.</a> Peptides. 72, 4-15 (2015).</li>
<li>Gan, S. D., Patel, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzyme+immunoassay+and+enzyme-linked+immunosorbent+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Enzyme immunoassay and enzyme-linked immunosorbent assay.</a> Journal of Investigative Dermatology. 133 (9), 12(2013).</li>
<li>Porstmann, T., Kiessig, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzyme+immunoassay+techniques.+An+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Enzyme immunoassay techniques. An overview.</a> Journal of Immunological Methods. 150 (1-2), 5-21 (1992).</li>
<li>Chao, H. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+evaluation+of+RNA-Seq+preparation+protocol+performance%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Systematic evaluation of RNA-Seq preparation protocol performance.</a> BMC Genomics. 20 (1), 571(2019).</li>
<li>Song, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+analysis+of+library+prep+approaches+for+sequencing+low+input+translatome+samples%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">A comparative analysis of library prep approaches for sequencing low input translatome samples.</a> BMC Genomics. 19 (1), 696(2018).</li>
<li>Rotem, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+ChIP-seq+reveals+cell+subpopulations+defined+by+chromatin+state%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Single-cell ChIP-seq reveals cell subpopulations defined by chromatin state.</a> Nature Biotechnology. 33 (11), 1165-1172 (2015).</li>
<li>Ku, W. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+chromatin+immunocleavage+sequencing+%28scChIC-seq%29+to+profile+histone+modification%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Single-cell chromatin immunocleavage sequencing (scChIC-seq) to profile histone modification.</a> Nature Methods. 16 (4), 323-325 (2019).</li>
<li>Carter, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+histone+modifications+in+low+cell+number+and+single+cells+using+antibody-guided+chromatin+tagmentation+%28ACT-seq%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Mapping histone modifications in low cell number and single cells using antibody-guided chromatin tagmentation (ACT-seq).</a> Nature Communications. 10 (1), 3747(2019).</li>
<li>Maskell, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+retroviral+integration+into+nucleosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural basis for retroviral integration into nucleosomes.</a> Nature. 523 (7560), 366-369 (2015).</li>
</ol>

大貫博士と土里博士は、「再利用可能な単一細胞の調製方法および単一細胞のエピゲノム、トランスクリプトームおよびゲノムの解析方法」(EP3619307およびUS20200102604)の共同発明者です。特許出願は、現在の原稿に記載されている技術に関連する予備的な結果に一部基づいて提出されました。この特許出願に記載および請求された発明は、発明者が米国政府のフルタイムの従業員であった間に行われました。したがって、45連邦規則集パート7の下では、この特許出願に対するすべての権利、権原、および利益は、法律によって米国政府に譲渡されているか、譲渡されるべきです。米国政府は、受け取ったロイヤルティの一部を、15 U.S. Code § 3710cに基づいて従業員の発明者に伝えます。

この記事では、再利用可能な単一細胞7を使用した最近報告された単一細胞マルチエピゲノム解析の段階的なプロトコルについて説明します。後続の段落では、プロトコルの潜在的な制限を強調して、重要なポイントについて説明します。 
プロトコル全体(ステップ7.2〜13から)の重要なポイントの1つは、DNase汚染を回避することです。1つの細胞にはゲノムDNAのコピーが2つしかありません。したがって、ゲノムDNAに損傷を与えると、シグナル数が著しく減少します。DNaseによる汚染を回避することは、ゲノムDNAの完全性を保護するために不可欠です。 
細胞膜/細胞壁を横切る試薬の透過性も、プロトコル全体を通して重要です。REpi-seqは、マウスおよびヒト細胞のエピゲノムを単一細胞レベルで解析するために設計されました。この実験方法の最適条件は、各試薬に対する細胞種や核膜の透過性によって異なることが予想される。したがって、本手法を植物細胞、酵母、細菌など、マウスおよびヒト細胞以外の細胞に適用する場合、...

シングルセル技術は、個々のシングルセルオミクス技術を統合したシングルセルマルチオミクスの時代に突入しています1。最近、シングルセルトランスクリプトミクスは、クロマチンアクセシビリティ(scNMT-seq2 およびSHARE-seq 3)またはヒストン修飾(ペア-seq4 およびペアタグ5)を検出するための方法と組み合わせています。最近では、シングルセルトランスクリプトミクスとプロテオミクスがクロマチンアクセシビリティと統合されました(DOGMA-seq6)。これらの方法は、クロマチンアクセシビリティまたはヒストン修飾を検出するためにトランスポザーゼベースのタグ付けを使用します。
トランスポザーゼベースのアプローチは、ゲノムDNAを切断し、ゲノムDNA断片の最後にDNAバーコードを追加します。切断された各ゲノム断片は、最大2つのDNAバーコード(=切断部位ごとに1つのエピジェネティックマーク)しか受け入れることができず、切断部位のゲノムDNAは失われます。したがって、切断ベースのアプローチは、テストされるエピジェネティックマークの数とシグナル密度の間にトレードオフがあります。これは、同じ単一細胞内の複数のエピジェネティックマークの分析を妨げます。この問題を克服するために、ゲノムDNAを切断しない単一細胞エピゲノム法が開発されました7,8。
上記の切断由来の問題に加えて、トランスポザーゼベースのアプローチには他の制限があります。シングルセルエピゲノム解析では、ゲノム上のヒストンやDNA関連タンパク質の位置を知ることが重要です。現在のアプローチでは、これは未固定の単一細胞を使用し、タンパク質-DNAおよびタンパク質-タンパク質相互作用を保持することによって達成されます。しかし、これは、ヒストン修飾の分析においても、アクセス可能なクロマチン領域に強いバイアスを発生させる9。ゲノム上のヒストンおよびゲノム関連タンパク質の位置は、ポリアクリルアミド足場を使用して、タンパク質-DNAおよびタンパク質-タンパク質を架橋することなく保存することができる7,8。このアプローチは、タンパク質-DNAおよびタンパク質-タンパク質相互作用に依存する現在のアプローチで観察される構造バイアスを低減します。
トランスポザーゼベースのアプローチは、単一の細胞から一度だけシグナルを取得できます。したがって、シグナルのドロップオフのために単一細胞の完全なエピゲノムを描写することは困難である。再利用可能な単一細胞は、同じ単一細胞内で反復的なエピゲノム解析を可能にすることにより、現在の制限を克服するために開発されました。

<table><tbody><tr><td>10x CutSmart バッファー</td><td>New England BioLabs</td><td>B6004</td><td>10x Digestion buffer</td></tr><tr><td>200 プルーフ エタノール</td><td>Warner-Graham Company</td><td>200プルーフ</td><td>エタノール</td></tr><tr><td>5-ヒドロキシメチルシトシン (5-hmC) モノクローナル抗体 [HMC/4D9]</td><td>Epigentek</td><td>A-1018-100</td><td>抗 5hmC</td></tr><tr><td>アクリジンオレンジ/プロピジウムヨウ化物染色</td><td>Logos Biosystems</td><td>F23001</td><td>セルカウンター</td></tr><tr><td>アクリルアミド溶液、H2O中40%、分子生物学用</td><td>ミリポアシグマ</td><td>01697-500ML</td><td>40%アクリルアミド溶液</td></tr><tr><td>オールインワン蛍光顕微鏡 BZ-X710</td><td>キーエンス</td><td>BZ-X710</td><td>走査型顕微鏡</td></tr><tr><td>アミコンウルトラ0.5 遠心フィルターユニット</td><td>ミリポアシグマ</td><td>UFC510024</td><td>限外ろ過カセット</td></tr><tr><td>分子生物学</td><td>用過硫酸アンモニウムMilliporeSigma</td><td>A3678-100G</td><td>過硫酸アンモニウム粉末</td></tr><tr><td>無水 DMF</td><td>ベクター研究所</td><td>S-4001-005</td><td>無水 N,N-ジメチルホルムアミド (DMF)</td></tr><tr><td>抗 RNA ポリメラーゼ II CTD リピート YSPTSPS (リン酸化 S5) 抗体 [4H8]</td><td>アブカム</td><td>ab5408</td><td>抗 Pol II</td></tr><tr><td>抗TRAP220/MED1 (リン酸化 T1457) 抗体</td><td>アブカム</td><td>ab60950</td><td>抗 Med1</td></tr><tr><td>BciVI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0596L</td><td>BciVI</td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン溶液、20 mg/mL H2O 溶液、低バイオバーデン、プロテアーゼフリー、分子生物学用</td><td>MilliporeSigma</td><td>B8667-5ML</td><td>20% BSA (表 7)</td></tr><tr><td>Bst DNA ポリメラーゼ、ラージフラグメント</td><td>New England BioLabs</td><td>M0275L</td><td>Bst DNA ポリメラーゼ</td></tr><tr><td>BT10 シリーズ 10 & マイクロ;l バリアチップ</td><td>ネプチューン</td><td>BT10</td><td>P10 ローリテンションチップ</td></tr><tr><td>CellCelector</td><td>自動ラボソリューション</td><td>N/A</td><td>自動シングルセルピッキングロボット</td></tr><tr><td>CellCelector 4 nl シングルセルクローニング用ナノウェルプレート プレート S200-100 100K, 24 well, ULA</td><td>Automated Lab Solutions</td><td>CC0079</td><td>4 nL ナノウェルプレート</td></tr><tr><td>クロロホルム</td><td>ミリポアシグマ</td><td></td><td>クロロホルム</td></tr><tr><td>Corning Costar 96-Well Cell Culture-Treated, Flat-Bottom Microplate</td><td>Corning</td><td>3596</td><td>Flat-bottom 96-well plates</td></tr><tr><td>Deep Vent (exo-) DNA Polymerase</td><td>New England BioLabs</td><td>M0259L</td><td>Exo- DNA ポリメラーゼ</td></tr><tr><td>DNA LoBind Tubes, 0.5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>30108035</td><td>0.5 mL DNA Low-Binding Tube</td></tr><tr><td>DNA Oligo, 1st random primer</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A、表3参照</td><td>第1ランダムプライマー</td></tr><tr><td>DNAオリゴ、第2ランダムプライマー Cell#01</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>該当なし、表3参照</td><td>第2ランダムプライマー</td></tr><tr><td>DNAオリゴ、2nd ランダムプライマー Cell#02</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>該当なし、表3参照</td><td>2nd ランダムプライマー</td></tr><tr><td>DNAオリゴ、2nd ランダムプライマー Cell#03</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>該当なし、表3参照</td><td>2nd ランダムプライマー</td></tr><tr><td>DNAオリゴ、第2ランダムプライマー Cell#04</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A、表3参照</td><td>2ndランダムプライマーDNA</td></tr><tr><td>オリゴ、2nd ランダムプライマー Cell#05</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>該当なし、表3参照</td><td>2ndランダムプライ</td></tr><tr><td>マーDNAオリゴ、2ndランダムプライマー Cell#06</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A、表3参照</td><td>2ndランダムプライマーDNA</td></tr><tr><td>オリゴ、 第2回ランダムプライマー Cell#07</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A、表3参照</td><td>2nd random primer</td></tr><tr><td>DNA Oligo、2nd random primer Cell#08</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A、表3参照</td><td>2nd random</td></tr><tr><td>primer DNA Oligo、2nd random primer Cell#09</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A、表3参照</td><td>2nd random primer</td></tr><tr><td>DNA Oligo、2nd random primer Cell#10</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A、表3参照</td><td>2nd random primer</td></tr><tr><td>DNA Oligo, 2nd random primer Cell#11</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A, see Table 3</td><td>2nd random primer</td></tr><tr><td>DNA Oligo, 2nd random primer Cell#12</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A, see Table 3</td><td>2nd random primer</td></tr><tr><td>DNA Oligo, 2nd synthesis primer</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A, see Table 3</td><td>2nd synthesis primer (表3参照) 2nd synthesis primer</td></tr><tr><td>DNAオリゴ、ライゲーションアダプター統合</td><td>DNAテクノロジー</td><td>N/A、表3</td><td>ライゲーション</td></tr><tr><td>アダプターDNAオリゴ、逆転写プライマー</td><td>統合DNAテクノロジー</td><td>N/Aを参照、表3</td>逆<td>転写プライマー</td></tr><tr><td>DNase I (RNase-free)</td><td>New England BioLabs</td><td>M0303L</td><td>DNase I (RNase-free, 4 U).</td></tr><tr><td>DNase I 反応バッファー</td><td>New England BioLabs</td><td>B0303S</td><td>10x DNase I バッファー (NEB)</td></tr><tr><td>dNTP Mix (各 10 mM)</td><td>Thermo Fisher</td><td>R0192</td><td>10 mM dNTPs</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum, USA origin, Heat-inactivated</td><td>MilliporeSigma</td><td>F4135-500ML</td><td>Fetal Bovine Serum</td></tr><tr><td>HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit</td><td>New England BioLabs</td><td>E2040S</td><td>In-vitro-transcription master mix</td></tr><tr><td>ヒストンH3K27ac抗体</td><td>活性モチーフ</td><td>39133</td><td>抗H3K27ac</td></tr><tr><td>ヒストンH3K27me3抗体</td><td>活性モチーフ</td><td>39155</td><td>抗H3K27me3</td></tr><tr><td>ウサギ血清由来IgG</td><td>ミリポアシグマ</td><td>I5006-10MG</td><td>制御IgG</td></tr><tr><td>酸化鉄(II,III)磁性ナノ粉末、平均30 nm</td><td></td><td></td><td>。NHS エステル修飾 30 nm 酸化鉄粉末</td></tr><tr><td>K-562</td><td>American Type Culture Collection (ATCC)</td><td>CCL-243</td><td>細胞</td></tr><tr><td>リニアアクリルアミド (5 mg/mL)</td><td>サーモフィッシャー</td><td>AM9520</td><td>リニアアクリルアミド</td></tr><tr><td>LUNA-FL デュアル蛍光セルカウンター</td><td>Logos Biosystems</td><td>L20001</td><td>セルカウンター</td></tr><tr><td>LUNA Cell Counting Slides, 50 Slides</td><td>Logos Biosystems</td><td>L12001</td><td>細胞カウンター</td></tr><tr><td>鉱油、BioReagent、分子生物学用、軽油</td><td>MilliporeSigma</td><td>M5904-500ML</td><td>鉱物油</td></tr><tr><td>N,N,N&prime;,N&prime;-分子生物学用テトラメチルエチレンジアミン</td><td>MilliporeSigma</td><td>T7024-100ML</td><td>N,N,N&prime;,N&prime;-テトラメチルエチレンジアミン</td></tr><tr><td>NaCl(5 M)、RNaseフリー</td><td>サーモフィッシャー</td><td>AM9760G</td><td>5M NaCl</td></tr><tr><td>NanoDrop Lite</td><td>サーモフィッシャー</td><td>2516</td><td>&nbsp;マイクロボリューム分光光度計</td></tr><tr><td>NEST 2 mL 96ウェルディープウェルプレート、Vボトム</td><td>Opentrons</td><td>N/A</td><td>2 mL ディープウェル 96ウェルプレート</td></tr><tr><td>ノンスカート 96ウェルPCRプレート</td><td>ジェネシーサイエンティフィック</td><td>27-405</td><td>96ウェルPCRプレート</td></tr><tr><td>NuSive GTG アガロース</td><td>ロンザ</td><td>50081</td><td>アガロー</td></tr>ス<tr><td>OmniPur アクリルアミド:ビスアクリルアミド 19:1、40% 溶液</td><td>ミリポアシグマ</td><td>1300-500ML</td><td>40%アクリルアミド/ビスアクリルアミド</td></tr><tr><td>OT-2 ラボロボット</td><td>Opentrons</td><td>OT2</td><td>自動液体ハンドリングロボット</td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド、EMグレード、精製、20%水溶液</td><td>電子顕微鏡 科学</td><td>15713</td><td>20%パラルマルデヒド</td></tr><tr><td>PBS(10x)、pH 7.4</td><td>サーモフィッシャー</td><td>70011044</td><td>10x PBS</td></tr><tr><td>ピペットマン クラシック P1000</td><td>ギルソン</td><td>F123602</td><td>A P1000ピペット</td></tr><tr><td>Protein LoBind Tubes, 1.5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>925000090</td><td>1.5 mL Protein low-binding tube</td></tr><tr><td>QIAgen Gel Extraction kit</td><td>Qiagen</td><td>28706</td><td>A P1000 pipette</td></tr><tr><td>Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay</td><td>Thermo Fisher</td><td>P11495</td><td>&nbsp;dsDNA 特異的インターカレーター色素</td></tr><tr><td>Quick Ligation kit</td><td>New England BioLabs</td><td>M2200L</td><td>T4 DNA ligase (NEB)</td></tr><tr><td>RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor</td><td>Thermo Fisher</td><td>10777019</td><td>RNAse inhibitor</td></tr><tr><td>S-4FB Crosslinker (DMF-soluble)</td><td>Vector laboratories</td><td>S-1004-105</td><td>Succinimidyl 4-formylbenzoate (S-4FB)</td></tr><tr><td>S-HyNic</td><td>Vector laboratories</td><td>S-1002-105</td><td>スクシンイミジル 6-ヒドラジノニコチン酸アセトンヒドラゾン (S-HyNic)</td></tr><tr><td>酢酸ナトリウム、3 M、pH 5.2、分子生物学グレード</td><td>MilliporeSigma</td><td>567422-100ML</td><td>3M 酢酸ナトリウム (pH 5.2)</td></tr> <tr><td>重炭酸ナトリウム、1M 緩衝液、pH 8.5</td><td>Alfa Aesar</td><td>J60408</td><td>1M 重炭酸ナトリウム緩衝液、pH 8.5</td></tr><tr><td>分子生物学用リン酸二塩基</td>性ナトリウム <td>MilliporeSigma</td><td>S3264-250G</td><td>Na2HPO4</td></tr><tr><td>リン酸ナトリウム 分子生物学用</td><td>MilliporeSigma</td><td>S3139-250G</td><td>NaH2PO4</td></tr><tr><td>SuperScript IV 逆転写酵素</td><td>サーモフィッシャー</td><td>18090050</td><td>逆転写酵素</td></tr><tr><td>SYBR 金核酸ゲル染色 (DMSO 中の 10,000x 濃縮液)</td><td>サーモフィッシャー</td><td>S11494</td> DNA T4 <td>用インターカレーター色素</td></tr><tr><td>DNAリガーゼ反応バッファー</td><td>New England BioLabs</td><td>B0202S</td><td>10x T4 DNAリガーゼ反応バッファー</td></tr><tr><td>ThermoPol 反応バッファーパック</td><td>New England BioLabs</td><td>B9004S</td><td>10x TPM-Tバッファー (Tris-HCl/塩化カリウム/硫酸マグネシウム/Triton X-100)</td></tr><tr><td>TRIzol LS試薬</td><td>サーモフィッシャー</td><td>10296-028</td><td>グアニジニウムチオシアン酸フェノール-クロロホルム抽出</td></tr><tr><td>TruSeq ナノDNAライブラリー調製キット</td><td>Illumina</td><td>20015965</td><td>A DNA Library preparation kit (see also manufacturer instruction)</td></tr><tr><td>Ultramer DNA Oligo, Anti-5hmC_Ab#005</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A, see Table 3 An</td><td>amine-modified DNA probe for antibody</td></tr><tr><td>Ultramer DNA Oligo, Anti-H3K27ac_Ab#002</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A, see Table 3</td><td>An amine-modified DNA probe for antibody</td></tr><tr><td>Ultramer DNA Oligo, Anti-H3K27me3_Ab#003</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A, 表3参照</td><td>抗体用アミン修飾DNAプローブ</td></tr><tr><td>Ultramer DNA Oligo, Anti-Med1_Ab#004</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A, 表3参照</td> 抗体<td>用アミン修飾DNAプローブ</td></tr><tr><td>Ultramer DNA Oligo, Anti-Pol II_Ab#006</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A, 表3参照</td> 抗体<td>用アミン修飾DNAプローブ</td></tr><tr><td>Ultramer DNA Oligo, Control IgG_Ab#001</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A, 表 3 参照</td><td>コントロール用アミン修飾 DNA プローブ IgG</td></tr><tr><td>UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0</td><td>Thermo Fisher</td><td>15575020</td><td>0.5M EDTA, pH 8.0</td></tr><tr><td>UltraPure DNase/RNase-Free 蒸留水</td><td>Thermo Fisher</td><td>10977023</td><td>Ultrapure water</td></tr><tr><td>Zeba Splin Desalting Columns, 7K MWCO, 0.5 mL</td><td>Thermo Fisher</td><td>89882</td>脱<td>塩カラム</td></tr></tbody></table>

反復エピゲノム解析のための再利用可能な単一細胞

Reusable Single Cell for Iterative Epigenomic Analyses

現在のシングルセルエピゲノム解析は、シングルユース向けに設計されています。細胞は1回の使用で廃棄されるため、単一細胞内の複数のエピジェネティックマークの分析が妨げられ、単一細胞内の実験的バックグラウンドノイズからシグナルを区別するために他の細胞からのデータが必要になります。この論文では、反復的なエピゲノム解析のために同じ単一細胞を再利用する方法について説明します。 
この実験方法では、細胞タンパク質をタンパク質やDNAに架橋するのではなく、まずポリアクリルアミドポリマーに固定し、構造バイアスを軽減します。この重要なステップにより、同じ単一細胞で繰り返し実験を行うことができます。次に、近接ライゲーション用のスキャフォールド配列を有するランダムプライマーをゲノムDNAにアニーリングし、DNAポリメラーゼを用いて伸長によりゲノム配列をプライマーに付加する。続いて、それぞれ異なるDNAプローブで標識されたエピジェネティックマーカーおよびコントロールIgGに対する抗体を、同じ単一細胞内のそれぞれの標的に結合させる。 
ランダムプライマーと抗体-DNAプローブの足場配列に相補配列を有するコネクターDNAを付加することにより、ランダムプライマーと抗体との間の近接ライゲーションが誘導される。このアプローチは、抗体情報と近くのゲノム配列を近接ライゲーションの単一のDNA産物に統合します。同じ単一細胞で実験を繰り返すことで、希少細胞からのデータ密度を高め、同一細胞のIgGと抗体データのみを用いた統計解析を可能にします。この方法で調製された再利用可能な単一細胞は、少なくとも数ヶ月間保存し、後で再利用してエピジェネティックな特性評価を広げ、データ密度を高めることができます。この方法は、研究者とそのプロジェクトに柔軟性を提供します。

K562単一細胞は、ステップ8に記載されるプロトコルを用いて生成された( 図5参照)。単一細胞は、ポリアクリルアミドビーズの外層に包埋した。細胞DNAを染色し、DNA染色用のインターカレーター色素を用いて可視化した。
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63456/63456fig05.jpg"> 図5:生成された再利用可能な単一セル。 細胞をDNA用のインターカレーター色素(緑色蛍光)で染色する。白い矢印は、ポリアクリルアミドビーズの外層に埋め込まれた単一細胞を示す。再利用可能な単一セルは、96ウェルの平底プレートに入れられます。画像は走査型顕微鏡BZ-X710で撮影しました。スケールバー= 1 mm。 <a href="https://www.jove.com/files/f...

本プロトコルは、再利用可能な単一細胞を用いた反復エピゲノム解析のための単一細胞法を記載する。再利用可能なシングルセルにより、同じシングルセル内の複数のエピジェネティックマークの分析と結果の統計的検証が可能になります。

Current single-cell epigenome analyses are designed for single use. The cell is discarded after a single use, preventing analysis of multiple epigenetic ...

この実験方法は、エピゲノム試験のために再利用可能な単一細胞の長期保存を可能にする。また、同じ単一細胞内の多くのエピジェネティックマークと転写因子の分析も可能です。現在のシングルセルエピゲノム解析法では、同じシングルセルを再解析することはできません。しかし、再利用可能な単一細胞では、同じ単一細胞を何度も再解析することができます。この技術は、特に患者の細胞数が限られている場合に、エピジェネティック治療の診断と設計に役立ちます。この方法は、エピジェネティックマークに対する特異的抗体が利用可能である限り、エピゲノム、遺伝子発現の制御、およびその他のシステムの研究に最も適しています。この手法を初めて試すときは、あまり貴重ではないサンプルで練習し、MiSeq や iSeq 100 などの浅いシーケンスを使用して実験を検証することをお勧めします。まず、クリーンな層流フード内で、1ミリリットルの細胞懸濁液と、DNA用のインターカレーター色素を含む1ミリモルのEDTA PBS199ミリリットルを混合します。混合後、200マイクロリットルの細胞懸濁液を平底96ウェルプレートの各ウェルに移す。カバーを96ウェルプレートに置き、走査型顕微鏡を使用してプレートをスキャンします。次に、プレートを傾け、単一セルがウェルの下端に沈むまで数分待ちます。次に、ピペットチップを下隅に置き、シングルセルとバッファーをPCRチューブに移します。蛍光顕微鏡を用いてウェルを確認し、転写を確認する。単一の細胞がまだウェル内にある場合は、DNA用のインターカレーター色素を含む1ミリモルのEDTA PBSをウェルあたり200マイクロリットル添加し、転写を繰り返します。移管後、96ウェルPCRプレートにカバーを置き、スイングローターを使用してプレートを中断なく遠心分離します。遠心分離後、自動リキッドハンドリングロボットのデッキにプレートを置きます。次に、補足コード1を液体処理ロボットのソフトウェアウィンドウにドラッグアンドドロップし、プログラムを実行して、非常に遅いピペッティング速度で195マイクロリットルの上清を除去します。50マイクロリットルの4%TEMEDまたは鉱物油を加え、プレートを室温で一晩インキュベートします。翌日、ピペッティングで鉱油を取り除き、200マイクロリットルのTPマグネシウム陰性緩衝液で細胞を5回洗浄します。最後の洗浄後、上清を除去し、15マイクロリットルのアニーリングバッファーを加え、氷上で1時間インキュベートします。インキュベーション後、PCRチューブをサーマルサイクラーに置き、摂氏94度で3分間加熱します。次に、チューブを氷冷した金属ブロックに移し、2分間インキュベートします。次に、4マイクロリットルの硫酸マグネシウム - 塩化ナトリウムを加え、DNTPを混合し、最高速度でボルテックスして混合する。次に、1マイクロリットルのBSTポリメラーゼラージフラグメントを加え、ボルテックスで混合し、シェーカーで4時間インキュベートします。インキュベーション後、PCRチューブをサーマルサイクラーに置き、本文に記載されているように4時間または一晩のプログラムを実行します。抗体結合のために、1.625マイクロリットルの塩化ナトリウムEDTA BSA溶液をチューブに加える。低速でボルテックスして混合し、チューブを氷上で1時間インキュベートします。次に、抗体1ミリリットルあたり0.1マイクログラムを加え、抗体プローブと結合させたコントロールIgGを加えます。抗体を添加した後、穏やかに振とうしながら氷上でチューブをインキュベートします。翌日、氷上で200マイクロリットルのTPM-Tバッファーで細胞を2回洗浄します。その後、上清を除去し、T4 DNAリガーゼバッファーで1回洗浄する。次に、19マイクロリットルのライゲーションアダプター溶液を加え、摂氏25度で1時間インキュベートします。次に、1マイクロリットルのT4 DNAリガーゼを添加し、中速でボルテックスしてチューブを混合します。チューブをサーマルサイクラーに置き、近接結紮プログラムを実行します。実行後、200マイクロリットルのBSTマグネシウム陰性EDTA陽性バッファーで細胞を2回洗浄し、摂氏4度で一晩保存します。翌日、200マイクロリットルのBSTマグネシウム陰性EDTA陰性バッファーで細胞を2回洗浄し、BST、DNTP、および硫酸マグネシウムを含む混合物20マイクロリットルを加えます。次に、ボルテックスミキサーで混合し、オービタルシェーカーでチューブを4時間インキュベートします。インキュベーション後、チューブをサーマルサイクラーに置き、テキスト原稿に記載されているように完全な拡張プログラムを実行します。次に、多重置換増幅のために、0.4マイクロリットルの100マイクロモル第2ランダムプライマーを添加し、ボルテックスにより混合する。次に、チューブをオービタルシェーカーで2時間インキュベートしてから、チューブをサーマルサイクラーに乗せて摂氏94度に加熱します。3分後、チューブを氷冷した金属ブロックに入れ、1マイクロリットルのBST DNAポリメラーゼを加えます。チューブを低速でボルテックスします。次に、チューブをサーマルサイクラーに配置して、多重変位増幅プログラムを実行します。プログラム終了後、約20マイクロリットルの上清をPCRチューブに移し、マイナス80°Cで保存します。次に、再利用可能な単一細胞を含むPCRチューブに20マイクロリットルの0.05%TWEEN 20および0.1X TEバッファーを加え、チューブを摂氏4度で一晩インキュベートします。翌日、上清を採取し、先に採取した上清と合わせる。次に、50%グリセロール、5ミリモルEDTA、0.5%BSA、および0.05%TWEEN 20を含む再利用可能なシングルセルおよびTBSバッファーを浸し、オービタルシェーカーで30分間インキュベートします。インキュベーション後、再利用可能な単一細胞をさらに使用するまで摂氏マイナス20度で保管します。最後に、40マイクロリットルのExoネガティブマスターミックスを追加し、チューブをサーマルサイクラーに置いて、テキスト原稿に記載されているようにプログラムを実行します。K562再利用可能な単一細胞を、このプロトコルを用いて生成した。単一細胞をポリアクリルアミドビーズの外層に包埋し、DNA染色用のインターカレーター色素を用いて可視化した。BciVI消化前後のDNA産物をここに示します。制限酵素消化により、予想される19〜20、31〜32、49、および49を超える塩基対フラグメントが生成されました。また、構築したDNAライブラリーを、目的物についてキャピラリー電気泳動により解析した。シーケンシングの結果は、抗ヒストンH3アセチル化リジン27および抗ヒストンH3トリメチル化リジン27からのユニークなマッピングリードが対照IgGからのものよりも有意に多いことを示しました。REpiシーケンシングシグナルは、REpiシーケンシングデータとバルクChIPシーケンシングデータを比較することによって評価した。平均して、REpiシーケンシングからのヒストンH3アセチル化リジン27シグナルの約91%が、バルクChIPシーケンシングにおけるヒストンH-3アセチル化リジン27ピークと重複した。不活性ヒストンマークであるヒストンH3トリメチル化リジン27のREpiシーケンシングの精度は52%でしたREpiシーケンシングの感度を分析して、REpiシーケンシング再生リードによってバルクChIPシーケンシングのピークがいくつ検出されたかを測定しました。REpiシーケンシングの感度は、ヒストンH3アセチル化リジン27で55.30%、ヒストンH3トリメチル化リジン27で50.94%でした。必ずDNSフリーの試薬を使用してください。また、チューブリードまたは試薬リードを開くことを含むすべての操作は、清潔なフード内で実行する必要があります。この手順のDNA産物は配列決定され、次にゲノムにマッピングされ、単一細胞のゲノムのどの領域にどのヒストン修飾が存在するかを明らかにします。この技術により、同一細胞内の複数のエピジェネティックマークの解析が可能になり、任意の単一細胞におけるマルチオミクス解析への道が開かれました。

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Research

JoVE Journal

Genetics

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反復エピゲノム解析のための再利用可能な単一細胞

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