生物医学研究に使用するための3D犬肝および腸オルガノイド培養の標準化と維持
January 31st, 2022
イヌの腸組織および肝組織から成体幹細胞を採取して3Dオルガノイド培養物を確立するための実験方法が記載されている。さらに、一貫した成長を確保し、イヌの腸および肝臓オルガノイド培養物を収穫、バイオバンク、および復活させるための標準的な操作手順を提供するための実験室技術が議論される。
イヌの肝臓および腸内オルガノイドの培養のためのプロトコルは、この新規技術を標準化するために重要である。この技術は、オルガノイドの単離、維持、収穫、およびその後のサンプルのバイオバンキングを含む、イヌオルガノイド培養の信頼性が高く再現可能な確立を可能にする。犬オルガノイドは、生物学、感染症開発、薬物検査と発見、そして伝染医学にまたがる多数の用途のための優れたモデルを提供することができます。
まず、5ミリリットルの1X完全キレート溶液を含む5つの15ミリリットル遠沈管、3ミリリットルの1X完全キレート溶液を含む1つのチューブ、1つの空のチューブ、および5ミリリットルの1X完全キレート溶液を含む1つのチューブ、および2ミリリットルのウシ胎児血清を準備する。単離の日に、滅菌ペトリ皿、メス、アイスバケツ、および冷たい高度なDMEM栄養素混合物F12をバイオセーフティキャビネットに入れます。必要数の24穴細胞培養プレートを二酸化炭素インキュベーターに入れ、予備加温する。
融解のために可溶化した細胞外膜マトリックスを氷上に置く。遠心分離機を摂氏4度に予冷します。直接光への暴露を避けて、成長因子を含む完全な培地を冷凍庫から摂氏37度の水浴に移す。
輸送管内の組織サンプルを30秒間振盪する。0.5ミリリットルがチューブ内に残るまで、流体表面の近くでゆっくりとピペッティングすることによって、組織を捨てることなく過剰な上清を除去する。組織および残りの上清を滅菌ペトリ皿に移す。
使い捨てメスを使用して、組織を切断し、マッシュの一貫性に似た小さな断片に約5分間細かく刻む。ペトリ皿からの液体でミンチ組織を最初の完全なキレート溶液チューブにピペットし、次いで2ミリリットルの高度なDMEM栄養混合物F12をペトリ皿に加える。残りの組織をフラッシュし、最初の完全なキレート溶液チューブに移す。
1X完全キレート溶液チューブを5秒間約5回ボルテックスします。生検をチューブの底に1分間沈降させ、5ミリリットルが残るまで上清を除去する。1X完全キレート溶液を新しいチューブからサンプルチューブに移します。
次の 2 本のチューブについて、前の手順を繰り返します。そして最後の2回の洗浄で、チューブに残っている3ミリリットルまで上清を取り除きます。生検および1X完全キレート溶液をサンプルチューブから6ウェルプレートの1ウェルに移す。
3ミリリットルの1X完全キレート溶液をサンプルチューブに加える。静かに旋回して残りの組織を収集し、プレートの同じウェルに移します。ウェルに150マイクロリットルの0.5モルエチレンジアミン四酢酸を加え、6ウェルプレートを摂氏4度の20度24RPMロッカー上に置きます。
肝臓サンプルを10分間、腸サンプルを移動ロッカー上で1時間インキュベートする。6ウェルプレートをバイオセーフティキャビネットに戻し、ミンチ組織と液体をウシ胎児血清を含む1X完全キレート溶液を含むチューブに移します。組織が沈降し、組織の上部の0.2ミリリットルで上清を空のチューブに輸送する。
サンプルを入れたチューブを700 XGで4°Cで5分間スピンダウンします。幹細胞は現在、ミンチ組織とともにペレット化されている。ペレットを乱さないように上澄み液を慎重に取り除いて捨てます。
ペレットを高度なDMEM F12に再懸濁する。チューブを再び回転させ、ペレットを乱すことなく上清を吸引する。可溶化された細胞外膜マトリックスの計算された体積をサンプル管に加える。
細胞ペレットを失わないように培地を除去するときは注意してください。細胞外膜マトリックスを添加する場合、ピペットはオルガノイド懸濁液中に過剰な気泡を生じないようにゆっくりとする。可溶化された細胞外膜マトリックスを含むサンプルを氷上に保管し、可溶化された細胞外膜マトリックスがドーム様構造を形成するように、ウェルの中央に懸濁液を播種する。
プレートをインキュベーターに輸送し、可溶化された細胞外膜マトリックスを30分間固化させる。ROCK阻害剤およびGSK3ベータを成長因子を含む完全な培地で混合し、この溶液を500マイクロリットルをすべてのウェルに加える。プレートをインキュベーターに入れます。
イヌオルガノイドプロトコルは、典型的には、ウェル当たり約50,000〜150,000個の腸細胞または肝細胞を生成する。幹細胞単離後、肝臓犬オルガノイドは拡大スフェロイドとしてライフサイクルを開始し、7日後には出芽および分化オルガノイドに変わります。回転楕円体の体積、表面積、2D楕円領域、および円周を計算した。
2D楕円領域および円周を使用して、オルガノイド培養の健康状態を評価した。半定量的様式でのマーカーの発現の評価は、スフェロイドが1〜26%の範囲の胆管細胞マーカーKRT7を優先的に発現することを示した幹細胞マーカーLGR5発現は0.17〜0.78%の範囲であったが、肝細胞マーカーはフォークヘッドボックス1Aでは0.05〜0.34%、シトクロム−P450では0.03〜0.28%と低い程度に発現していた。トリプシン様プロテアーゼとの12分間のインキュベーションは、オルガノイド増殖を阻害しなかった。
しかし、オルガノイドの成長は、24分間のインキュベーションを使用して悪影響を受けました。不利な環境におけるイヌ肝オルガノイドの生存率を分析して、肝臓オルガノイドの成長と生存を成功させるために必要なオルガノイド培地および地下マトリックスの量を決定した。オルガノイドの生存率は12.9日から18日の範囲であった。
基本的な細胞培養技術と無菌アプローチは、適切なオルガノイドの単離と維持に不可欠な前提条件です。
概要
この記事では、犬の腸および肝臓組織から成体幹細胞を収穫し、3Dオルガノイド培養を確立するための実験的方法について説明します。一貫した成長のための実験技術と、これらのオルガノイド培養の収穫、バイオバンキング、再活性化のための標準的な運用手順を概説しています。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 神経科学
- 幹細胞生物学
- オルガノイド技術
背景
- 犬のオルガノイドは様々な生物学的応用のためのモデルとして機能します。
- オルガノイド培養プロトコルの標準化は再現性にとって重要です。
- 技術には、オルガノイドの分離、維持、および収穫が含まれます。
- 研究への応用のために、オルガノイドの成長力学を理解することが不可欠です。
研究の目的
- 犬の腸および肝臓オルガノイド培養のための信頼できるプロトコルを確立すること。
- オルガノイドサンプルのバイオバンキングと再活性化を促進すること。
- 様々な条件下でのオルガノイドの成長と健康を評価すること。
使用した方法
- キレート化溶液と細胞培養プレートの準備。
- 組織サンプルの分離とミンシング。
- 成長を促進するための特定の溶液でサンプルのインキュベーション。
- 形態学的測定を通じたオルガノイドの健康評価。
主要な結果
- 犬のオルガノイドプロトコルは1ウェルあたり50,000から150,000の細胞を生成します。
- オルガノイドは異なる成長段階とマーカー発現を示します。
- オルガノイドの生存率は環境条件によって異なります。
- インキュベーション時間はオルガノイドの成長結果に大きな影響を与えます。
結論
- 標準化されたプロトコルは犬のオルガノイド培養の信頼性を高めます。
- 成長力学を理解することは成功した応用にとって重要です。
- 将来の研究では、これらのオルガノイドを薬物試験や疾病モデリングに活用できます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Standardized 3D canine hepatic and intestinal organoid cultures provide a reproducible, scalable platform for translational drug discovery and toxicology assessment. These organoid systems enable predictive modeling of complex disease biology, supporting mechanistic de-risking and target validation in large animal models relevant to human medicine. Biobanking and maintenance protocols further enhance portfolio continuity and reduce reliance on continuous tissue harvesting.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of therapeutic hypotheses in disease-relevant canine models.
- Supports mechanistic de-risking by modeling multifactorial disease pathways in vitro.
- Facilitates functional target validation through quantitative marker expression and morphological assessment.
- Provides a platform for predictive confidence in early-stage portfolio triage.
Screening & Assay Development
- Delivers standardized, reproducible organoid cultures for downstream compound screening.
- Enables quantitative assessment of organoid health via 2D ellipse area and circumference measurements.
- Supports assay scalability and platform reuse through biobanking and indefinite sub-culturing.
- Improves reliability of drug permeability and toxicology testing in a controlled system.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with translational biomarker strategies by modeling canine diseases analogous to human conditions.
- Ensures continuity from discovery through preclinical validation using biobanked organoid lines.
- Reduces biological risk by providing a robust, disease-relevant preclinical model.
- Enables risk-adjusted advancement decisions based on organoid viability and marker expression data.
Pipeline & Workflow Integration
These protocols position canine organoid cultures as a bridge from early discovery through lead identification and preclinical research, supporting hypothesis testing and mechanistic studies in a scalable, reusable format.
- Discovery Biology: Facilitates pathway clarification and biological de-risking via marker expression and morphological metrics.
- Screening: Provides assay-ready, reproducible organoid systems for compound evaluation and toxicology assessment.
- Analytics: Enables quantitative readouts such as cell yield, viability, and marker expression for condition comparison.
- Translational Research: Supports preclinical continuity and biomarker alignment in disease-relevant canine models.
- Enterprise Reuse: Biobanking protocols allow for long-term storage and repeated use across multiple R&D programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes workflows, enhances reproducibility, and supports scalable culture expansion.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making and capital efficiency by reducing late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of candidates using robust, reproducible data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture and aseptic technique for reliable organoid isolation and maintenance.
- Demands access to specialized instrumentation, including biosafety cabinets, incubators, and imaging systems.
- Necessitates cross-team standardization of protocols for reproducibility and data comparability.
- Adaptation may be needed for different tissue sources or disease models within the canine system.
- Limitations include sensitivity to incubation times and environmental conditions affecting organoid viability.
