Transplantation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Microglia in Immunocompetent Mice Brain via Non-Invasive Transnasal Route

Bijay Parajuli; Youichi Shinozaki; Eiji Shigetomi; Schuichi Koizumi

doi:10.3791/63574

ヒト人工多能性幹細胞由来ミクログリアの免疫適格マウス脳への非侵襲的経鼻経路による移植

JoVE Journal
Neuroscience

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Transplantation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Microglia in Immunocompetent Mice Brain via Non-Invasive Transnasal Route

ヒト人工多能性幹細胞由来ミクログリアの免疫適格マウス脳への非侵襲的経鼻経路による移植

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May 31, 2022

DOI: 10.3791/63574-v

Bijay Parajuli^1,2, Youichi Shinozaki^1,2, Eiji Shigetomi^1,2, Schuichi Koizumi^1,2

¹Department of Neuropharmacology, Interdisciplinary Graduate School of Medicine,University of Yamanashi, ²GLIA Center,University of Yamanashi

Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.

Overview

This study presents a non-invasive method for the transplantation of induced pluripotent stem cell-derived human microglia (iPSMG) into the brain of immunocompetent mice via a transnasal route. The protocol leverages cytokine administration and the deletion of endogenous microglia to enable effective integration of iPSMG, potentially paving the way for therapeutic approaches in neurodegenerative diseases.

Key Study Components

Area of Science

Neuroscience
Stem Cell Research
Microglial Biology

Background

Induced pluripotent stem cells can be differentiated into functional microglia.
Microglial dysfunction is implicated in various neurodegenerative diseases.
Transnasal delivery presents a novel approach to cell transplantation.
Administering cytokines is crucial for cell viability post-transplantation.

Purpose of Study

To develop a method for non-invasive microglial transplantation.
To assess the feasibility of transnasal delivery in maintaining normal brain function.
To evaluate the potential of iPSMG in replacing dysfunctional microglia.

Methods Used

The primary platform involves transnasal transplantation of iPSMG in immunocompetent mice.
Male mice were pre-treated with CSF1 receptor antagonist PLX5622 and a hyaluronidase solution to enhance nasal permeability.
Cell suspensions were administered in multiple doses over specified timelines to ensure proper integration.
Post-transplant monitoring involved assessing the presence and viability of transplanted cells.

Main Results

Transplanted iPSMG were successfully integrated into the mouse hippocampus without damaging endogenous microglia.
Cytokine administration every 12 hours was critical for maintaining cell viability after transplantation.
This method allows the examination of iPSMG responses in both normal and diseased models.

Conclusions

This protocol facilitates the study of iPSMG in vivo, which could inform future gene therapies for neurodegenerative diseases.
Understanding the behavior of transplanted microglia can help delineate their role in brain health.
This approach may open avenues for novel therapeutic targets in treating microglial-related pathologies.

Frequently Asked Questions

What are the advantages of transnasal transplantation?

Transnasal transplantation is a non-invasive approach that minimizes brain damage and allows for direct delivery of cells into the brain.

How is the microglial cell model prepared?

Microglial cells are prepared from induced pluripotent stem cells, thawed, and cultured before transplantation.

What types of outcomes can be measured post-transplantation?

Outcomes include the integration of iPSMG into the brain tissue and their functional viability, assessed through specific marker detection.

Can this method be adapted for other types of cells?

While primarily designed for iPSMG, the transnasal delivery method may potentially be adapted for other cell types, pending compatibility.

What are the limitations of this protocol?

Limitations include the requirement for careful preparation of cells and the need for continuous cytokine administration to ensure cell viability.

ここに提示されたプロトコールは、免疫適格マウスにおける鼻腔内経路を介して誘導多能性幹細胞由来ヒトミクログリア(iPSMG)の脳への移植を可能にする。iPSMGの維持のための細胞の調製および経鼻移植ならびにサイトカイン混合物の投与のための方法が示されている。

このプロトコールは、CSF1受容体アンタゴニストPLX5622の薬理学的オン/オフと経鼻移植を組み合わせることにより、免疫適格マウス脳へのiPSMGの非侵襲的移植を可能にする。この技術の主な利点は、免疫適格マウスにおいても脳損傷を誘発することなくiPSMGを移植できることである。ミクログリア移植は、将来、様々な神経変性疾患において、機能不全のミクログリアを機能的なミクログリアと交換するための潜在的な治療法として役立つ可能性がある。

手順を実演するのは、私の研究室の研究者であるBijay Parajuliです。まず、凍結した誘導多能性幹細胞由来ヒトミクログリア細胞を摂氏37度の水浴中で素早く解凍することから始める。目に見えるすべての氷が溶けるまでサンプルを渦巻きます。

解凍したiPSMGを培地に加え、摂氏37度に加温した。10ミリリットルの培養培地に1ミリリットルの細胞を加える。細胞を300倍gで5分間遠心分離し、細胞ペレットを得た。

細胞ペレットを乱すことなく上清を除去する。移植用培地を添加し、マイクロリットル当たり第5細胞に対して10の細胞濃度を得た。iPSMGを氷の上に置き、直ちに移植に進む。

経鼻移植用のマウスを準備するために、雄マウスにPLXを含む飼料を7日間給餌する。7日目の終わりに、PLXダイエットを中止し、マウスに通常の食事を与えてください。iPSMGの経鼻移植の1時間前に、10マイクロリットルのピペットチップを用いてPBS中の2.5マイクロリットルのヒアルロニダーゼを各鼻孔に2回投与し、鼻粘膜への透過性を高めた。

ヒアルロニダーゼ適用後の仰臥位にマウスを置く。iPSMGの経鼻移植の10分前に2.5マイクロリットルのヒアルロニダーゼを投与する。10マイクロリットルのピペットチップを使用して、マウスの1つの鼻孔に2.5マイクロリットルの細胞懸濁液を塗布する。

マウスを5分間仰臥位に置き、細胞懸濁液を他方の鼻孔に投与する。細胞懸濁液を4回投与し、1匹あたり20マイクロリットルの全容量を塗布する。PLX給餌の停止から48時間後、同じマウスにヒアルロニダーゼおよび細胞懸濁液の投与を繰り返す。

サイトカインの投与のために、10マイクロリットルのピペットチップを用いて、マウスの1つの鼻孔に2.5マイクロリットルの移植培地を塗布する。経鼻移植の2ヶ月後、移植細胞の数は、ヒト特異的マーカーおよび汎ミクログリアマーカーの両方に陽性である細胞を計数することによって決定することができる。内因性マウスミクログリアは、汎ミクログリアマーカーについてのみ陽性である。

対照マウスでは、マウスミクログリアのみが皮質および海馬の両方で検出された。iPSMG移植マウスの皮質では、マウスミクログリアのみが検出されたのに対し、海馬ではiPSMGが検出された。このプロトコールを試みる場合、サイトカインの希釈を防ぐために上清の完全な除去が不可欠である。

移植細胞の生存率のために12時間ごとにサイトカインを適用することが重要です。内因性マウスミクログリアの枯渇は、iPSMGの移植に必要である。この手順により、iPSMGを正常または罹患したマウス脳に移植することができる。

これにより、iPSMGの特徴ならびに疾患に対する応答性を決定することができる。この技術は、マウス脳におけるiPSMGのin vivo特性を決定するのに適している。したがって、iPSMGを疾患モデルマウスに移植することは、応答を理解するのに役立ち、新しい治療標的への道を開く可能性があります。

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神経科学第183号