ヒト人工多能性幹細胞由来ミクログリアの免疫適格マウス脳への非侵襲的経鼻経路による移植
2022年5月31日
ここに提示されたプロトコールは、免疫適格マウスにおける鼻腔内経路を介して誘導多能性幹細胞由来ヒトミクログリア(iPSMG)の脳への移植を可能にする。iPSMGの維持のための細胞の調製および経鼻移植ならびにサイトカイン混合物の投与のための方法が示されている。
このプロトコールは、CSF1受容体アンタゴニストPLX5622の薬理学的オン/オフと経鼻移植を組み合わせることにより、免疫適格マウス脳へのiPSMGの非侵襲的移植を可能にする。この技術の主な利点は、免疫適格マウスにおいても脳損傷を誘発することなくiPSMGを移植できることである。ミクログリア移植は、将来、様々な神経変性疾患において、機能不全のミクログリアを機能的なミクログリアと交換するための潜在的な治療法として役立つ可能性がある。
手順を実演するのは、私の研究室の研究者であるBijay Parajuliです。まず、凍結した誘導多能性幹細胞由来ヒトミクログリア細胞を摂氏37度の水浴中で素早く解凍することから始める。目に見えるすべての氷が溶けるまでサンプルを渦巻きます。
解凍したiPSMGを培地に加え、摂氏37度に加温した。10ミリリットルの培養培地に1ミリリットルの細胞を加える。細胞を300倍gで5分間遠心分離し、細胞ペレットを得た。
細胞ペレットを乱すことなく上清を除去する。移植用培地を添加し、マイクロリットル当たり第5細胞に対して10の細胞濃度を得た。iPSMGを氷の上に置き、直ちに移植に進む。
経鼻移植用のマウスを準備するために、雄マウスにPLXを含む飼料を7日間給餌する。7日目の終わりに、PLXダイエットを中止し、マウスに通常の食事を与えてください。iPSMGの経鼻移植の1時間前に、10マイクロリットルのピペットチップを用いてPBS中の2.5マイクロリットルのヒアルロニダーゼを各鼻孔に2回投与し、鼻粘膜への透過性を高めた。
ヒアルロニダーゼ適用後の仰臥位にマウスを置く。iPSMGの経鼻移植の10分前に2.5マイクロリットルのヒアルロニダーゼを投与する。10マイクロリットルのピペットチップを使用して、マウスの1つの鼻孔に2.5マイクロリットルの細胞懸濁液を塗布する。
マウスを5分間仰臥位に置き、細胞懸濁液を他方の鼻孔に投与する。細胞懸濁液を4回投与し、1匹あたり20マイクロリットルの全容量を塗布する。PLX給餌の停止から48時間後、同じマウスにヒアルロニダーゼおよび細胞懸濁液の投与を繰り返す。
サイトカインの投与のために、10マイクロリットルのピペットチップを用いて、マウスの1つの鼻孔に2.5マイクロリットルの移植培地を塗布する。経鼻移植の2ヶ月後、移植細胞の数は、ヒト特異的マーカーおよび汎ミクログリアマーカーの両方に陽性である細胞を計数することによって決定することができる。内因性マウスミクログリアは、汎ミクログリアマーカーについてのみ陽性である。
対照マウスでは、マウスミクログリアのみが皮質および海馬の両方で検出された。iPSMG移植マウスの皮質では、マウスミクログリアのみが検出されたのに対し、海馬ではiPSMGが検出された。このプロトコールを試みる場合、サイトカインの希釈を防ぐために上清の完全な除去が不可欠である。
移植細胞の生存率のために12時間ごとにサイトカインを適用することが重要です。内因性マウスミクログリアの枯渇は、iPSMGの移植に必要である。この手順により、iPSMGを正常または罹患したマウス脳に移植することができる。
これにより、iPSMGの特徴ならびに疾患に対する応答性を決定することができる。この技術は、マウス脳におけるiPSMGのin vivo特性を決定するのに適している。したがって、iPSMGを疾患モデルマウスに移植することは、応答を理解するのに役立ち、新しい治療標的への道を開く可能性があります。
概要
本研究では、経鼻経路を通じて免疫能を持つマウスの脳へ、誘導多能性幹細胞由来ヒトミクログリア（iPSMG）を移植する非侵襲的な手法を提示します。このプロトコルでは、サイトカインの投与と内在性ミクログリアの除去を利用してiPSMGの効果的な統合を可能にしており、神経変性疾患に対する治療的アプローチへの道を切り開く可能性があります。
研究の主要構成要素
科学分野
- 神経科学
- 幹細胞研究
- ミクログリア生物学
背景
- 誘導多能性幹細胞は、機能的なミクログリアへと分化させることができる。
- ミクログリアの機能不全は、さまざまな神経変性疾患に関与している。
- 経鼻投与は、細胞移植への新しいアプローチとなる。
- 移植後の細胞生存率を維持するためには、サイトカインの投与が不可欠である。
研究目的
- 非侵襲的なミクログリア移植法の開発。
- 正常な脳機能を維持する上での経鼻投与の実現可能性を評価すること。
- 機能不全に陥ったミクログリアを置換するiPSMGの潜在能力を評価すること。
使用方法
- 主要なプラットフォームでは、免疫能を有するマウスへのiPSMGの経鼻移植を行う。
- 鼻腔の透過性を高めるため、雄マウスにCSF1受容体拮抗薬PLX5622およびヒアルロニダーゼ溶液を前処置した。
- 適切な生着を確実にするため、細胞懸濁液を規定のスケジュールに従って複数回投与した。
- 移植後のモニタリングでは、移植細胞の存在および生存能を評価した。
主要な結果
- 移植されたiPSMGは、内在性のミクログリアに損傷を与えることなく、マウス海馬に正常に統合されました。
- 移植後の細胞生存率を維持するためには、12時間ごとのサイトカイン投与が極めて重要でした。
- 本手法により、正常モデルおよび疾患モデルの両方においてiPSMGの応答を検討することが可能になります。
結論
- このプロトコールはiPSMGのin vivoでの研究を促進し、神経変性疾患に対する将来的な遺伝子治療に寄与する可能性があります。
- 移植されたミクログリアの挙動を理解することは、脳の健康におけるそれらの役割を明らかにすることに役立ちます。
- このアプローチは、ミクログリア関連疾患の治療における新たな治療標的への道を開く可能性があります。
よくある質問
業界における重要性
ヒトiPSC由来ミクログリアを免疫能を有するマウス脳へ非侵襲的に移植することで、ヒトミクログリアの機能および疾患応答をin vivoで直接的に研究することが可能になります。このアプローチは、齧歯類とヒトのミクログリア間のトランスレーショナルなギャップを埋め、神経変性疾患研究においてより予測精度の高い前臨床モデルを構築することを支援します。本プロトコルは、初期探索および前臨床の転換点において、ターゲットの検証とメカニズムのリスク低減を促進します。
バイオ製薬研究開発における戦略的応用
初期発見およびターゲットバリデーション
- 哺乳類の脳環境におけるヒトミクログリア生物学のin vivoでの解析を可能にします。
- ヒト特有のミクログリア応答をマウスモデルと区別することで、メカニズム的なリスク低減を支援します。
- 神経炎症および神経変性経路における機能的ターゲットの検証を促進します。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 生体内（in vivo）におけるヒトミクログリアの統合および生存能を評価するための、検証済みシステムを提供します。
- 特異的マーカーを用いて、移植ミクログリアと内在性ミクログリアの再現性のある定量化を可能にします。
- 生理学的条件下におけるヒトミクログリア機能を標的とした化合物のダウンストリームスクリーニングを支援します。
トランスレーショナル・前臨床研究
- ヒトのミクログリアをマウス脳に導入することで、前臨床モデルをヒトの疾患との関連性に適応させます。
- 正常マウスおよび疾患モデルマウスの両方において、ヒトミクログリアの反応を評価することが可能になります。
- トランスレーショナルなバイオマーカーの探索および治療仮説の検証における予測の信頼性を向上させます。
パイプラインおよびワークフローの統合
本プロトコールは、ヒトミクログリアのin vivoでの機能研究を可能にすることで、初期探索から前臨床研究への橋渡しを行い、リード化合物の同定とトランスレーショナルな連続性を支援します。
- 発見生物学： 脳の生理および病態におけるヒトミクログリアの役割に関する仮説検証をサポートします。
- スクリーニング： 移植後の細胞の統合および生存率の定量的リードアウトを提供します。
- 分析： マーカーに基づいたヒトミクログリアとマウスミクログリアの識別を可能にし、堅牢なデータ分析を実現します。
- トランスレーショナルリサーチ： iPSMGを疾患モデルマウスに移植することで、疾患に関連したモデリングを促進します。
- 企業的な再利用： 複数の疾患コンテキストにわたってヒトミクログリア機能を評価するための再利用可能なプラットフォームを構築します。
運用および企業への影響
- 科学的価値：神経炎症研究における予測の信頼性を高め、種固有の曖昧さを軽減する。
- 運用的価値：非侵襲的な細胞導入および定量化のワークフローを標準化し、研究間の再現性を確保する。
- 戦略的価値：ヒトに関連するデータを提供することで、ミクログリア標的治療薬の開発におけるGo/No-Go判断をより適切なものにする。
- ポートフォリオへの影響：モデルの忠実度を向上させることで、神経変性疾患プログラムのリスク調整済み優先順位付けを支援する。
実施上の検討事項
- iPSC培養、ミクログリア分化、およびin vivo移植技術に関する専門知識が必要です。
- 内因性ミクログリアの除去およびサイトカインサポートのための薬理学的薬剤へのアクセスが必要です。
- 細胞調製、移植、および移植後解析のための標準化されたプロトコルが必要です。
- 他のモデルシステムに適応させる場合は、導入および除去パラメータの最適化が必要になる場合があります。
- プロトコルで示されている通り、移植細胞の生存能を維持するためには、継続的なサイトカイン投与が極めて重要です。
