Name: マウスモデルを用いた家族性肥大型心筋症におけるMYH7変異Gly823Gluの病態解明 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 3 min 45 s
Description: 学ぶCRISPR/Cas9によるMYH7 G823Eノックインマウス作成と超音波心エコー評価法。家族性肥大型心筋症の病態遺伝子解析と治療開発への応用可能性を示す貴重なモデルです。

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この研究は、広東省の医学研究基金プロジェクト(A2022363)および中国広東省科学技術委員会の主要プロジェクト(助成金番号2022)によってサポートされました。
この原稿の準備に協力してくれたメリーランド大学カレッジパーク校のQingjian Chenに感謝します。

家族の歴史は、家族にインタビューすることによって得られました。この研究は、広東省中医薬病院の倫理委員会(第2019074号)によって承認されました。家族全員から書面による同意を得た。すべての動物は、広東省中医薬病院(中国、広州)の倫理ガイドラインに従って治療されます。
1. 学習テーマ
注:発端者III-3は、2019年7月に広東省中医薬病院の心臓血管外科で医師の診察を受けました。
<ol><li>発端者の詳細な家族病歴を取得します。発端者の家族全員に通知して電話をかけます。家族全員が綿密な身体検査を受けています。<ol><li>医療記録、ECG、心エコー図、心臓カテーテル検査レポートなど、すべての臨床データの系統的レビューを実行します。</li>
		<li>介入または手術中にすべての患者の心臓表現型を再確認します。</li>
	</ol></li>
	<li>ローカルデータベースから合計174の人口ベースの健康対照を選択します。各患者から約4.0mLの末梢静脈血を採取します。.</li>
</ol>2.DNA抽出
注:DNAは、製造元の指示に従って市販の血液キットで抽出されます。
<ol><li>メーカーのプロトコルに従って、DNA安定剤の存在下で陰イオン界面活性剤で血球を溶解します。</li>
	<li>細胞ライセートに10 μLのRNase A溶液を加え、チューブを25回反転させて混合します。37°Cで15分から1時間インキュベートします。</li>
	<li>塩沈殿によってタンパク質を除去します。タンパク質沈殿溶液(25 mLの蒸留水に溶解した0.25 mgのウシ血清アルブミン)と100%イソプロパノールを使用してタンパク質を沈殿させます。次に、200 μLの70%エタノールを使用し、12,000 x g/minで4°Cで15分間遠心分離を行い、DNAペレットを洗浄します。</li>
	<li>500 μLの70%エタノールで沈殿させることにより、ゲノムDNAを回収します。12,000 x g で30秒間遠心分離します。ペレットを吸引し、水和溶液(1 mM EDTA、10 mM Tris·Cl, pH 7.5)。</li>
	<li>分光光度計(NanoDrop 2000など)を使用して純度を測定します。精製されたDNAは通常、A260 / A280の比率が1.7〜1.9で、サイズが最大200kbです。</li>
	<li>DNAを2-8、-20、または-80°Cで長期間保存します。</li>
</ol>3. 全エクソームシーケンシングとバリアント解析
注:疾患の原因となる遺伝子変異を系統的に検索するために、影響を受けた個人(II-5、II-7、III-3、III-7、III-8、III-9、およびIV-3)および非影響を受けた個人(III-2、III-5、IV-4)のエクソーム配列決定が行われました。
<ol><li>製造元の指示に従ってエクソームプローブを使用して、エクソームキャプチャを実行します。</li>
	<li>認定ライブラリをHiSeq X-tenプラットフォーム上の2×150 bpのペアエンドシーケンシングに適用します。 補足ファイル1を参照してください。</li>
	<li>FASTQファイルをBWA v0.7.1318,19を使用してヒトリファレンスゲノム(hg19 / GRCh37)にアラインメントします。整列されたファイル(sam / bam形式のファイル)をsamtoolsで並べ替えてから、Picardを使用して重複にフラグを付けます。 補足ファイル1を参照してください。</li>
	<li>GATKを使用し、読み取りをローカルで再調整し、基本品質を再調整します。 補足ファイル1を参照してください。</li>
	<li>BEDToolsと社内のperl/pythonスクリプトによって再調整されたファイルからカバレッジと深度を含むマッピング統計を生成します。</li>
	<li>GATKのHaplotypeCallerツールのマルチサンプル処理モードを使用して再調整されたBAMファイルからの遺伝子型バリアント(SNVおよびインデル)。</li>
	<li>VQSR (バリアント品質スコアの再調整) を使用して、バリアント通話の誤検知を減らします。</li>
	<li>エクソームアグリゲーションコンソーシアム(ExAC)(http://exac.broadinstitute.org)、エクソームシーケンシングプロジェクト(ESP)(https://esp.gs.washington.edu)、1,000 G(http://www.1000genomes.org)などの複数のデータベースに対して、ANNOVARソフトウェア21を使用してSNVとインデルに注釈を付けます。ACMGガイドラインに従って配列変異体の病原性を解釈します。</li>
</ol>4. サンガーシーケンシング
<ol><li>サンガーシーケンシングを実行して、潜在的な原因バリアントを確認し、ABI 3500シーケンサー23を使用してファミリー内のバリアント分離を決定します。</li>
	<li>MYH7遺伝子(NM_000257)における変異体のプライマー配列を以下のように設計する:5'−TTCAAACAGAGACCTGCAGG-3'および5'−CGGACTTCTCTAGCGCCTCTT −3'。</li>
	<li>バリアントを確認し、利用可能なすべてのファミリーメンバーをスクリーニングして、ファミリー23内のバリアント分離を決定します。</li>
</ol>5. C57BL/6N-MYH7em1(G823E) ノックインマウスの作製
<ol><li>CRISPR/Cas9システムを使用して、C57BL/6N-Myh7em1(G823E) ノックインマウスを生成します。マウス Myh7 遺伝子(GenBankアクセッション番号:NM_001361607.1;アンサンブル:ENSMUSG00000053093)は、マウスの染色体14に位置し、41個のエクソンを有する。ATG開始コドンはエクソン4に、TAG終止コドンはエクソン41にあり、G823Eはエクソン23に位置しています。ターゲットサイトとしてエクソン23を選択します。</li>
	<li>gRNAターゲティングベクターとドナーオリゴの配列を設計します(両側に134 bpの相同配列が組み合わされたターゲティング配列で挟まれています)。<ol><li>NCBIのウェブサイトにログインし、右側の BLASTオンラインプライマーデザイン 機能をクリックしてください。</li>
		<li>ページ下部の プライマー-BLAST 機能をクリックして、プライマーを設計します。</li>
		<li>MYH7 NCBIリファレンスシーケンス番号NM_000257.4をPCRテンプレートボックスに貼り付けます。</li>
		<li>ターゲットフラグメント(MYH7 cDNAエクソン23とその隣接エクソン)を増幅して、エクソン21(2392-2528)の上流プライマーとエクソン25(3205-3350)の下流プライマーを設計します。上流および下流プライマーのエクソン番号を右の範囲ボックスに入力します。</li>
		<li>下部にある[プライマー の取得] ボタンをクリックすると、複数のプライマーペアが自動的に生成されます。</li>
	</ol></li>
	<li>MYH7遺伝子をZFINデータベースに入力し、ドナーオリゴヌクレオチドのp.g823e(GGGからGAG)変異部位を導入し、p.r819(AGGからCGA)をエクソン23に導入します。サイレント変異は、相同性指向修復後のgRNAによる配列の結合および再切断を妨げる。<ol><li>一般的な配列に従ってgRNAを設計し、両端の配列はTAATACGACTCACTATA-および-GTTTTAGAGCTAである。配列の中央は、上記の標的部位である。</li>
	</ol></li>
	<li>Cas9 mRNA、 in vitro 転写によって生成されたgRNA、およびドナーオリゴをKIマウス生産用の受精卵に共注入します。<ol><li>Cas9/gRNAターゲット効率検出キットを使用して、設計されたgRNAターゲットを in vitro でgRNAに転写し、メーカーのプロトコルに従って転写産物の活性を検出します(特定の検出方法についてはVK007キットの説明を参照してください)。</li>
		<li>T7 ARC mRNAキットの成分を解凍し、マイクロフュージで混合し、パルススピンして、チューブの底部に溶液を採取します。室温で、ARCA/NTPミックス2回から10 μL、鋳型DNA1 μg、T7 RNAポリメラーゼミックス2 μL、ヌクレアーゼフリー水20 μLの順に反応を組み立てます。</li>
		<li>完全に混合し、マイクロフュージでパルススピンします。37°Cで30分間インキュベートします。</li>
		<li>DNase Iを2 μL加えて鋳型DNAを除去し、よく混合し、37°Cで15分間インキュベートしてmRNAを取得します。</li>
		<li>血清ゴナドトロピンおよびヒト絨毛性ゴナドトロピンを、約4週齢の0.5mLシリンジで0.5mLシリンジで約48時間の2回の注射の間隔で約48時間の間隔で、予め調製されたC57BL / 6雌マウスに腹腔内注射する。</li>
		<li>投与から18時間後、ホルモン注射後の頸部脱臼により、C57BL / 6雌マウスと8〜12週齢のC57BL / 6雄マウス1匹を屠殺します。.卵子と精子を別々に集めます。</li>
		<li>精子は能力付与液中で能力付与される。体液の端にある精子を短命の卵細胞に取り、3〜4時間の 体外 受精のために落とします。</li>
		<li>転写に成功したgRNAおよびCas9 mRNAをRNaseフリー水で in vitro で25 ng/μLおよび50 ng/μLに希釈し、マイクロインジェクションによりマウス受精卵の細胞質に導入する。良好な状態の受精卵を雌マウスの肥大卵管に移植する。結紮された雄マウスとのコケージ。</li>
	</ol></li>
	<li>PCRによる子犬の遺伝子型決定。次のPCR条件を使用します:94°Cで3分間、94°Cで30秒、60°Cで35秒、72°Cで35秒の35サイクル。72°Cで5分間続いてシーケンス分析を行います。<ol><li>生後4ヶ月のマウスの尾をハサミで切り、1.5mLのEPチューブに入れます。テールピースあたり180 μLのバッファーGL、20 μLのプロテイナーゼK、および10 μLのRNase Aをマイクロ遠心チューブ(2〜5 mm)に追加します。尾を切りすぎないように注意してください。</li>
		<li>チューブを56°Cで一晩インキュベートします。</li>
		<li>微量遠心チューブ内で1,000 x g で2分間回転させ、不純物を除去します。</li>
		<li>十分な混合を行いながら、バッファーGB200 μLと無水エチルアルコール200 μLを加えます。</li>
		<li>スピンカラムを収集チューブに入れます。サンプルをスピンに適用し、1,000 x g で2分間遠心分離します。フロースルーを破棄します。</li>
		<li>500 μLのバッファーWAをスピンカラムに加え、1,000 x g で1分間遠心分離します。フロースルーを破棄します。</li>
		<li>700 μLのバッファーWBをスピンカラムに加え、1,000 x g で1分間遠心分離します。フロースルーを破棄します。 注意: バッファーWBが100%エタノールと事前に混合されていることを確認してください。バッファーWBを追加する場合は、チューブ壁に追加して残留塩を洗い流します。</li>
		<li>手順 5.5.7 を繰り返します。</li>
		<li>スピンカラムを収集チューブに入れ、1,000 x g で2分間遠心分離します。</li>
		<li>スピンカラムを新しい1.5 mLチューブに入れます。カラムメンブレンの中央に50〜200 μLの滅菌水または溶出バッファーを加え、カラムを5分間静置します。 注:滅菌水または溶出バッファーを65°Cまで加熱すると、溶出収率が向上します。</li>
		<li>DNAを溶出するには、カラムを1,000 x g で2分間遠心分離します。DNAの収率を高めるには、フロースルーおよび/または50〜200 μLの滅菌水または溶出バッファーをスピンカラムメンブレンの中央に加え、カラムを5分間静置します。1,000 x g で2分間遠心分離します。</li>
		<li>溶出したゲノムDNAを電気泳動で定量します。</li>
	</ol></li>
</ol>6.心臓の形態と機能の評価
注:Mモード心エコー検査を適用して、C57BL / 6N-Myh7em1(G823E) ノックインマウスの心臓の形態と機能を評価します。
<ol><li>ノックインマウスを麻酔器に接続された閉じたアクリルボックスに入れ、イソフルラン(濃度:3%)がアクリルボックスに流れるように三方向インターフェースを調整します。ノックインマウスが自律的に動くのをやめたら、ノックインマウスを取り外します。</li>
	<li>ノックインマウスを小動物麻酔器の生命監視プラットフォームに平らに置き、酸素(流量:0.8 L / min)とイソフルラン(濃度:3%)を混合した連続吸入麻酔を行います。麻酔をかけたマウスに眼脂を塗布して、角膜の乾燥を防ぎます。</li>
	<li>ノックインマウスをプラットフォームに水平に固定します。プラットフォームをノックインマウスに対して30°尾側に傾けます。脱毛クリームを使用して、ノックマウスの前胸壁の毛を取り除きます。</li>
	<li>隆起を動物の頭に向けてプローブを垂直に配置します。次に、プローブを反時計回りに約45°回転させます。</li>
	<li>胸骨傍長軸ビューで、プローブを時計回りに90°回転させて、傍胸骨短軸ビューを観察します。プローブを90°回転させた後、y軸の変位を調整して正しいスライスを取得します。</li>
	<li>心臓の長軸画像(図1C)を観察し、Mモード測定データを選択します。</li>
	<li>マウスの胸骨傍長軸図から超音波データを取得します(図1)。心拍数(HR)、左心室駆出率(LVEF)、心拍出量(CO)、左心室拡張末期寸法(LVDd)、LVDの左心室末期収縮期寸法(LVSd)、心室中隔(IVS)、および左心室後壁(LVPW)が測定されます。</li>
	<li>測定後、マウスに酸素を供給し、自律活動が回復したらそれぞれのケージに戻します。</li>
</ol>

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<li>Lafreniere-Roula, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Family+screening+for+hypertrophic+cardiomyopathy%3A+Is+it+time+to+change+practice+guidelines%5BTitle%5D)+AND+%22European+Heart+Journal%22%5BJournal%5D)">Family screening for hypertrophic cardiomyopathy: Is it time to change practice guidelines.</a> European Heart Journal. 40 (45), 3672-3681 (2019).</li>
<li>Winkelmann, D. A., Forgacs, E., Miller, M. T., Stock, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+drug-induced+allosteric+changes+to+human+beta-cardiac+myosin+motor+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Structural basis for drug-induced allosteric changes to human beta-cardiac myosin motor activity.</a> Nature Communications. 6, 7974(2015).</li>
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<li>Majewski, J., Schwartzentruber, J., Lalonde, E., Montpetit, A., Jabado, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+can+exome+sequencing+do+for+you%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Genetics%22%5BJournal%5D)">What can exome sequencing do for you.</a> Journal of Medical Genetics. 48 (9), 580-589 (2011).</li>
</ol>

著者は、宣言する金銭的利益相反はありません。

本研究では,HCMを有する中国漢族の家族について述べる。遺伝学解析により、ヘテロ接合型のMYH6変異p.G823Eは、常染色体優性遺伝の家族において疾患と共分離することが明らかになりました。G823E変異の病原性を検証し、そのメカニズムを議論するために、CRISPR/Cas9を介したゲノムエンジニアリングにより、マウスMyh7遺伝子座にG823Eを備えたC57BL/6Nマウスモデルを作成しました。
C57BL/6N-Myh7em1(G823E) ノックインマウスの表現型特性を心エコー検査により評価した。C57BL/6N-Myh7em1(G823E) ノックインマウスでは、対照と比較して、多重線維柱帯と非圧縮心筋層の比率が高いことが見られました。トランスジェニックマウスはまた、LVPWおよびIVS肥大およびHRの増加を示した。しかし、心臓の機能は2つのグループ間で有意な変化を示さなかった。これらの結果から,HRの増加は心臓リモデリング時の脳室機能の維持に代償効果を示す可能性が示唆された。心臓の形態と機能を観察および分析するには、さらなる研究...

肥大型心筋症(HCM、OMIM:613690)は中国で最も一般的な心筋症であり、推定発生率は0.2%で、15万人が罹患しています1,2。
HCMを特徴付ける病理学的解剖学的特徴は非対称心室肥大であり、これはしばしば心室流出路および/または心室中隔を含む3。臨床症状は、労作性呼吸困難、疲労、および胸痛です。HCMの個々の表現型は、臨床的に潜行性から重度の心不全までの範囲の変動性を有する。HCMの患者は、治療、心臓移植、生命維持装置、および学際的なフォローアップを必要とします4。
前世紀、PCR技術はDNA5の研究方法を変えました。臨床診断のためのDNAシーケンシング法がSangerらによって発見された6。サンガー法はその後、ヒトゲノムプロジェクトに適用されましたが、このアプローチはコストと時間がかかりました7。全ゲノムシーケンス(WGS)の出現により、ヒトの遺伝病に関する洞察が新たな高みに達しましたが、コストの点で法外なままでした。全エクソームシーケンシング(WES)技術は、生殖細胞系列の変異を検出するために長い間使用されており8 、さまざまな癌のエクソームにおける体細胞ドライバー変異の特定に成功しています9。WESによるDNAエクソンまたはコード領域の検出は、ほとんどのメンデル病における病原性多様体を明らかにするために使用することができる。今日、シーケンシングのコストが下がるにつれて、WGSはゲノミクス研究の重要なツールになると期待されており、ゲノム中の病原性多様体の検出に広く使用することができます。
WES技術は、病因をさらに解明するために病原性多様体を特定するために、遺伝性心筋症でも使用されています。新たな証拠は、MYH7 10、MYH6 11、MYBPC3 12、MYL2 13、MYL3 14、TNNT215、TNNI3 16、TNNC1 17、およびTPM1 18などのサルコメア構造タンパク質遺伝子変異をコードする遺伝子がHCMの遺伝的病因の原因であることを示唆している。希少疾患の原因となる遺伝子(例えば、オブスクリン、細胞骨格カルモジュリンおよびチチン相互作用のRhoGEF(OBSCN、OMIM:608616)19、作用アルファ2(ACTN2、OMIM:102573)20、およびシステインおよびグリシンリッチタンパク質3(CSRP3、OMIM:600824)21)における病原性多様体の認識もHCMと関連しています。現在の遺伝学的研究では、HCM患者の約40%〜60%でサルコメアタンパク質遺伝子に複数の異なる病原性多様体が同定されており、HCM患者の遺伝子検査により、ほとんどの病原性多様体はミオシン重鎖(MYH7)およびミオシン結合タンパク質C(MYBPC3)で発生することが明らかになりました。しかし、HCMの遺伝的根拠はとらえどころのないままです。ヒトHCM患者の根底にあるこれらの変動の病原性を調査することは、依然として大きな課題です22。
本研究では、WESによるHCMを有する中国の漢族におけるMYH7の病原性多様体を報告する。この変異株の病原性を検証するために、CRISPR/Cas9システムを使用してC57BL/6N-Myh7em1(G823E) ノックインマウスを樹立しました。また、このバリアントのもっともらしいメカニズムについても説明します。

<table><tbody><tr><td>0.5倍;TBE</td><td>上海三言2</td><td></td><td></td></tr><tr><td>回;Taq Master Mix(ダイプラス)</td><td>Nanjing Novizan Biotechnology Co., Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>アガロース</td><td>・レグ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>小動物用麻酔器</td><td>Reward Life Technology Co., Ltd.</td><td>R500</td><td></td></tr><tr><td>BEDTools</td><td></td><td>2.16.1</td><td></td></tr><tr><td>Cas9 in vitro 消化法によるgRNA検出目標効率キット</td><td>Viewsolid Biotechnology Co., Ltd.</td><td>VK007</td><td></td></tr><tr><td>DNAマーカー</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DNA安定剤</td><td>Shanghai Seebio Biotechnology Co., Ltd.</td><td>DNA安定LD</td>は<td>DNAの分解を防ぐ</td></tr><tr><td>電気パラフィンミクロトーム</td><td>Shenyang Hengsong Technology Co., Ltd.</td><td>HS-S7220-B</td><td></td></tr><tr><td>GATK</td><td></td><td>v3.5</td><td></td></tr><tr><td>Gentra Puregene 血液キット</td><td>サンタ クララ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ガラス スライド、カバースリップ</td><td>Jiangsu Invotech Biotechnology Co., Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ヘマトキシリン染色液、エオシン染色液</td><td>Shanghai Biyuntian Biotechnology Co., Ltd.</td><td>C0107-500ml、C0109</td><td></td></tr><tr><td>HiSeq X-tenプラットフォーム</td><td>Illumina</td><td></td>は<td>、捕捉されたライブラリのシーケンシングを実行します</td></tr><tr><td>絨毛性ゴナドトロピン</td><td>Livzon Pharmaceutical Group Inc.の注射。</td><td></td><td></td></tr><tr><td>妊娠中の牝馬血清ゴナドトロピンの注射</td><td>Livzon Pharmaceutical Group Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>イソフルラン</td><td>現地サプライヤー</td><td></td><td>吸入 麻酔</td></tr><tr><td>マイクロインジェクション 顕微鏡</td><td>ニコン</td><td>ECLIPSE TS2</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>2000</td><td></td></tr><tr><td>パラフィン埋入機</td><td>瀋陽恒松技術有限公司</td><td>HS-B7126-B</td><td></td></tr><tr><td>Picard</td><td></td><td>(2.2.4) 20</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Merck KGaA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>samtools</td><td></td><td>1.3</td><td></td></tr><tr><td>シーケンサー</td><td>Applied Biosystems</td><td>ABI 3500</td><td></td></tr><tr><td>実体顕微鏡</td><td>Nikon</td><td>SMZ745T</td><td></td></tr><tr><td>SureSelect Human All Exon V6</td><td>Agilent Technology Co., Ltd.</td><td></td><td>エクソームプローブ</td></tr><tr><td>T7 ARCA mRNA Kit</td><td>New England BioLabs, Inc.</td><td>NEB-E2065S</td><td></td></tr><tr><td>温度ボックス</td><td>BINDER GmbH</td><td>KBF-S Solid.Line</td><td></td></tr><tr><td>Trizma 塩酸塩溶液</td><td>Sigma, Merck KGaA</td><td>No. T2663</td><td></td></tr><tr><td>獣医用超音波システム</td><td>Royal Philips</td><td>CX50</td><td></td></tr></tbody></table>

マウスモデルを用いた家族性肥大型心筋症におけるmyh7変異gly823gluの病態解明

Investigating the Pathogenesis of MYH7 Mutation Gly823Glu in Familial Hypertrophic Cardiomyopathy using a Mouse Model

家族性肥大型心筋症(HCM、OMIM:613690)は、中国で最も一般的な心筋症です。しかし、HCMの根底にある遺伝的病因はとらえどころのないままです。
我々は以前、HCMを有する中国の大規模な漢族において、ミオシン重鎖7(MYH7)遺伝子ヘテロ接合型変異体NM_000257.4:c.G2468A(p.G823E)を同定した。このファミリーでは、バリアントG823Eは常染色体優性障害と共離します。この変異体は、MYH7タンパク質の頸部領域のレバーアームドメインに位置し、相同ミオシンおよび種の間で高度に保存されています。G823E変異体の病原性を検証するために、CRISPR/Cas9を介したゲノムエンジニアリングにより、マウスMYH7遺伝子座に点突然変異(G823E)を有するC57BL/6Nマウスモデルを作製しました。gRNAターゲティングベクターとドナーオリゴヌクレオチド(ターゲティング配列に134 bpの相同性)を設計しました。ドナーオリゴヌクレオチド中のp.G823E(GGGからGAG)部位を、相同性指向修復によってMYH7のエクソン23に導入した。サイレンシングされたp.R819(AGGからCGAへ)も挿入され、相同性指向修復後の配列のgRNA結合および再切断を防止した。心エコー検査で生後2カ月齢のMYH7 G823E/-マウスに収縮期を伴う左室後壁(LVPW)肥大を認めた.これらの結果は、同様に組織学的分析によって検証されました(図3)。
これらの結果は、G823E変異体がHCMの病因において重要な役割を果たすことを示しています。今回の知見は、家族性HCMに関連するMYH7変異体のスペクトルを豊かにし、この中国人科における遺伝カウンセリングと出生前診断の指針となる可能性がある。

家族の臨床プロファイル HCMの家系血歴が得られ、 図2に示されている。文書化された家族全員が登録時にHCMと診断されました。
家族(図2A)では、発端者は患者III-7であり、46歳でHCMと左心室流出路閉塞(LVOTO)と診断され、心臓手術を受けました。患者III-3は、外科的治療を必要としない軽度のHCMを有していた。患者IV-3も軽度のHCMを有しており、これは彼の父親である患者III-3と同様であった。患者II-5はHCMを患っており、LVOTOによる51歳で欠陥を修復する手術を受けました。患者I-1と患者II-2はそれぞれ57歳と46歳で心臓事故のために死亡しました。患者I-1の病歴は利用できませんでした。患者II-7および患者III-9は息切れを呈し、HCMと診断された。
エクソーム配列解析と変異体の分離 このファミリーでは、5人のエクソームシーケンシングにより、合計19,978,7...

我々の臨床研究で発見された家族性遺伝性心筋症ファミリーに基づいて、CRISPR/Cas9を介したゲノム工学により、マウスMYH7遺伝子座に点突然変異(G823E)を有するC57BL/6Nマウスモデルを作成し、この変異を検証しました。

マウスモデルを用いた家族性肥大型心筋症におけるMYH7変異Gly823Gluの病態解明

Familial hypertrophic cardiomyopathy (HCM, OMIM: 613690) is the most common cardiomyopathy in China. However, the underlying genetic etiology of HCM ...

このプロトコルは、小動物の超音波のデモンストレーションを提供できるため、重要です。この技術は、遺伝性心筋症における病原性遺伝子の発見への洞察を提供する可能性があります。ノックインマウスをプラットフォームに水平に固定し、プラットフォームをノックインマウスに合わせて30度傾けます。脱毛クリームを使用してノックインマウスの前胸壁の毛を取り除き、隆起を動物の頭に向けてプローブを垂直に配置します。次に、プローブを傍胸骨長軸ビューで反時計回りに約45度回転させます。プローブを時計回りに90度回転させて、傍胸骨短軸ビューを取得します。プローブを回転させた後、Y軸の変位を調整して正しいスライスを取得します。心臓の長軸画像を観察し、Mモード測定データを選択します。マウスの胸骨傍長軸図から超音波データを取得し、心拍数、左心室駆出率、心拍出量、左心室および拡張期寸法、左心室および収縮期寸法を測定します。左心室後壁と心室中隔。肥大型心筋症の家族血統が得られ、文書化された家族全員が肥大型心筋症の登録と診断されました。サンガーシーケンシングは、すべての患者で同じM Y H 7 P G 8 23 E変異体を確認したが、家族の健康な個人では確認しなかった。174個の対照と、ヘテロ接合型MYH7PG823Eをこのファミリーに完全に共分離した。MYh7のネックドメイン領域におけるコドン8 23におけるグリシン残基は、利用可能な全ての脊椎動物ミオシン配列において高度に保存された。A C M G 標準およびガイドラインによれば、M Y H 7 P G 8 23 E変異体は病原性多様体であると予測された。ノックインマウスは、出生後に加齢依存性心肥大を発症した。心エコー検査で,ノックインマウスでは心室中隔と左室後壁が発達し,心拍数が上昇した.組織学的分析によっても確認された。ウイルス超音波データは、マウス用語の異なるセクション上でプローブを異なる角度で回転させることによって得ることができる。

investigating-pathogenesis-myh7-mutation-gly823glu-familial

Research

JoVE Journal

Genetics

遺伝学

マウスの横大動脈狭窄（TAC）は、心肥大や心不全の開発の基礎となるメカニズムを研究するために一般的に使用される実験的なモデルです。ここで、我々は、マウスの心肥大の再現性の学位を作成するために大動脈を収縮する手順を説明します。...

マウスの横大動脈狭窄

ここでは、ランゲンドルフ灌流システムを使用して、成体マウスcardiomyoctyesの単離を記載している。得られた細胞は、電気的に休止状態、のCa 2 +·トレラントであり、培養およびアデノ又は遺伝子発現を操作するためのレンチウイルスでトランスフェクトすることができる。それらの機能は、MMSYSシステムおよびパッチクランプ技術を用いて分析することができる。...

アイソレーション、文化、および成体マウスCardiomyoctyesの機能解析

マウスをモデルシステムとして使用して、ヒトの疾患に関連する遺伝子ファミリーを理解するための逆遺伝学的なアプローチが提示され、その後のマウス表現型スケジュールが記述されています。目的の遺伝子であるHtrA2に欠損のあるマウスはパーキンソン病の症状を発現したため、表現型判定レジメンは神経学的欠陥の特定に焦点を当てています。...

老化のヒトの疾患に関与する遺伝子を研究するために使用される遺伝子改変マウス用表現型レジメン

心エコー検査は、マウスで多用されます。高価な高分解能超音波デバイスは、この目的のために開発されています。このプロトコルでは、心臓形態を決定する組織学的形態計測学的解析と組み合わせて現実的な心エコー手順について説明します。...

マウスの心臓形態の心エコー検査・組織学的検討

このプロトコルの目的は、段階的に説明するマウスにおける低侵襲横大動脈狭窄 (TAC) の技術。挿管や一般的に使用される標準的な手順に必要な換気の除去、TAC...

左室肥大の誘導マウスにおける低侵襲の横大動脈狭窄のテクニック

アダルト ゼブラフィッシュ (動脈分布) のドキソルビシン誘発心筋症モデルを生成する方法を次に紹介します。腹腔内投与の 2...

大人のゼブラフィッシュのドキソルビシン誘発心筋症モデル

このプロトコルは、低酸素症への暴露およびVEGF受容体拮抗薬の注射に基づくマウスにおける肺高血圧(PH)の誘導について説明する。動物は、プロトコルの開始から3週間後にPHおよび右心室(RV)肥大を発症する。モデルの機能的および形態的特徴付けも提示される。...

低酸素/SU5416モデルを用いたマウスにおける肺高血圧の誘導と特徴づけ

本論文では、異なる病理を表す異なる形状を有する心臓筋細胞を成長させ、それらの形態に基づいてこれらの付着性心筋細胞を単一細胞レベルで選別する方法を提示する。提案されたプラットホームは心不全の異なったタイプのための高い効率および薬物スクリーニングへの新しいアプローチを提供する。...

単一細胞レベルでの形状依存性転写論の研究方法

本プロトコールは、完全長コネキシン43生成を保持するが、より小さなGJA1-20k内部翻訳アイソフォームの翻訳を防止する、Gja1における単一のM213L変異を記載する。...

完全長タンパク質の発現を維持しながらmRNAからの内部翻訳開始部位を除去する

このプロトコルは、駆出率が維持された高脂血症誘発性心不全(HFpEF)のマウスモデルを再現するための詳細なアプローチを示しています。このデザインは、アデノ随伴ウイルス9-心筋トロポニンT-低密度リポタンパク質受容体(AAV9-cTnT-LDLR)とポロキサマー-407(P-407)の投与を組み合わせたものです。...

駆出率を維持した高脂血症誘発性心不全のマウスモデル

学ぶCRISPR/Cas9によるMYH7 G823Eノックインマウス作成と超音波心エコー評価法。家族性肥大型心筋症の病態遺伝子解析と治療開発への応用可能性を示す貴重なモデルです。

マウスモデルを用いた家族性肥大型心筋症におけるMYH7変異Gly823Gluの病態解明

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