ミクロゲルロッドからの連結マクロポーラス3D足場
2022年6月16日
相補的な反応性基を有するミクロゲルロッドは、水溶液中で相互連結する能力を有するマイクロフルイディクスを介して製造される。異方性ミクロゲルは、球形ベースのシステムと比較して、より大きな細孔を有する安定した構築物に詰まりそして相互連結する。GRGDS-PCで修飾されたミクロゲルは、細胞培養に使用できるマクロポーラス3Dコンストラクトを形成します。
このプロトコルは、マイクロポア足場に相互リンクするマイクロゲルロッドの製造について説明しています。これらの足場は、効率的な細胞細胞相互作用に必要なスペースを提供する細胞と組み合わせて利用することができます。2つの異なるタイプのマイクロゲルロッドは、接触すると相互リンクします。
高アスペクト比では、球状マイクロゲルと比較して少ない合成材料を使用して足場の安定性を維持しながら、より大きな細孔をもたらす。微細孔足場は、損傷した組織を修復するための内因性細胞の浸潤と相互作用を大幅に増強します。大きな毛穴は血管形成を促進し、成長組織に栄養素を交換します。
足場材料の減少は、組織形成のために提供されるより多くのオープンスペースとして有益であり、これはin vitroおよびin vivoアプリケーションの両方にとって重要である。重要な側面は、マイクロフィティックオンチップ技術です。マイクロゲルロッドの連続生産を確実にするために、製品は目詰まりすることなくチューブから効果的に輸送されなければなりません。
はじめに、針をポリエチレンチューブに挿入し、シリンジとチューブからガスを取り除きます。次に、追加のポリエチレンチューブをコンセントに挿入して製品を収集します。次に、すべてのガラスシリンジとシリンジポンプを配置し、各チューブの端を対応する入口に挿入します。
次に、顕微鏡を油水断面に焦点を合わせます。最初のオイルシリンジポンプを始動して、分散相によるチャネルの濡れを防ぐために、最初にチャネルをオイルで満たします。次に、最初のオイル流量を毎時30マイクロリットルに減らし、分散した水相が断面で観察できるまでプレポリマーシリンジポンプを起動します。
次に、プレポリマーの流量を毎時30マイクロリットルに設定し、顕微鏡を出口に焦点を合わせます。次に、2番目のオイルシリンジポンプを始動し、流量レジームが安定するまで待ちます。出口管を回収容器に入れ、放射照度が900〜1000ミリワット/平方の範囲になるようにUV照射システムを設定します。
そして照射スポットは出口の前の直流路部分です。UV照射前に、プレポリマーと第1油の流量を調整して3.0〜4.5の範囲で所望のアスペクト比を達成し、分散相の照射時間を照射スポットの大きさに応じて約2.3秒に設定する。その後、UV照射を開始し、必要に応じて、前のサブセクションに従って流量を再度調整します。
次に、回収容器を変更し、製品の回収開始時刻と流量をメモします。収集を終了するには、時刻をメモして収集コンテナーを削除します。その後、照射とすべてのシリンジポンプを停止します。
その後、製品をn-ヘキサン、イソプロパノール、および脱イオン水でそれぞれ5回洗浄します。次に、ロッド沈降後の上澄み液を除去します。第1成分分散液を円錐形の1.5または2ミリリットルの透明バイアルに移す。
次に、100マイクロリットルのピペットを使用した連続操作で制御された方法で2番目の成分を追加し、ピペットを使用して内容物を直接混合して液体を取り込み、再度追加します。次に、G R G D S P C溶液を連結構造に加え、遊離アミンとチヤールを有する細胞接着ペプチドで残りのすべてのエポキシ基を修飾し、室温で一晩放置します。次に、イオン交換水で洗浄して未反応分子を除去し、上清を除去する。
水位を下げた後、バイアルを開け、波長250〜300ナノメートルのUV光を除染します。次に、バイアルを閉じて、バイアルをクリーンベンチに移します。その後、滅菌水で洗ってください。
バイアル内の水を細胞培養培地と交換し、5分間平衡化します。次に、マクロ多孔質足場をスパチュラを用いて流し込むか、実験用の細胞培養ウェルプレートに移す。共焦点顕微鏡検査により、3Dマクロ多孔質構造は、相互結合したアミンとエポキシ官能化マイクロゲルロッドで構成されていることが明らかになりました。
この構築物は、2〜3秒以内に形成された約10, 000本のマイクロゲルロッドのコンパクトな形状を示す。アミンおよびエポキシマイクロゲルロッドの有効ヤング率、ならびにアミンおよびエポキシマイクロゲル球は、ナノインデンテーションによって測定されます。活性官能基を検出するために、フルオレセインイソチオシアネートを使用して第一級アミノ基を可視化することができ、フルオレセインアミン異性体1つをエポキシ基の標識に使用することができます。
アミンマイクロゲルロッドの寸法は、脱イオン水中での平均長さ553マイクロメートル、平均幅193マイクロメートルであり、アスペクト比は約3.0です。マクロ細孔とマイクロゲル棒で構成された足場の平均値は100マイクロメートルで、細孔径の90%は30マイクロメートルから150マイクロメートル以上の範囲です。マイクロゲルのような球は、約10〜55マイクロメートルの細孔サイズを持つクラスターをもたらし、平均値は約22マイクロメートルです。
記載されたマイクロゲルロッドは、ランダム混合によって連結されたミクロ細孔足場を生成するように設計されている。制御された混合手順により、将来、よりカスタマイズされた足場形状の製造が可能になります。マイクロゲルの剛性と生化学的手がかりは、販売要件に基づいて変えることができます。
異なるビルディングブロックを組み合わせることで、1つの足場内でさまざまな形状とプロパティを実現できます。このようにして、特定の細胞を効率的に標的にして多細胞組織を形成することができます。
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概要
本記事では、細胞培養に適したマイクロポア・スキャフォールド（微細孔足場）を形成するために相互連結するマイクロゲルロッドの作製について解説します。この独自の設計により、安定性を維持しつつより大きなポアを実現でき、細胞相互作用と組織修復を促進します。
研究の主要構成要素
科学分野
- 神経科学
- バイオマテリアル
- 組織工学
背景
- マイクロゲルロッドは、マイクロ流路法を用いて作製されます。
- これらは、相互連結のための相補的な反応基を有しています。
- これらの構造は、球状のマイクロゲルと比較して、より大きな細孔を形成します。
- マクロ多孔性構造体は、細胞培養を効果的にサポートすることができます。
研究目的
- 安定したスキャフォールドに相互連結可能なマイクロゲルロッドを作製すること。
- 組織工学への応用において、細胞間相互作用を促進すること。
- より大きな孔構造を通じて、栄養素の交換を改善すること。
使用した手法
- マイクロ流路を用いたマイクロゲルロッドの作製。
- GRGDS-PCによるマイクロゲルの修飾。
- 足場の安定性と孔径の評価。
- マクロ多孔質構造体における細胞培養効率の評価。
主要な結果
- マイクロゲルロッドは接触時に相互連結し、安定したスキャフォールドを形成します。
- 高いアスペクト比により、より大きなマイクロポアが形成されます。
- 合成材料を少なくしても、スキャフォールドの安定性が維持されます。
- 組織修復のための細胞の浸潤と相互作用が促進されます。
結論
- マイクロゲルロッドは、細胞培養用のスキャフォールド（足場）を作成するのに有効です。
- 孔径が大きいほど、血管形成と栄養交換が促進されます。
- この手法は、組織工学への応用に大きく寄与することが期待されます。
よくある質問
産業上の重要性
機能化されたマイクロゲルロッドから作製された相互連結マクロ多孔質3Dスキャフォールドにより、高度な細胞ベースのアッセイや組織工学モデルに適した、高気孔率で機械的に安定した構造体の構築が可能になります。このプラットフォームは効率的な細胞浸潤と相互作用をサポートし、生理学的に適切な環境を必要とする探索段階の研究に強固な基盤を提供します。本手法のモジュール性と調整可能な特性により、トランスレーショナルリサーチおよび前臨床モデル開発において再利用可能な技術として活用できます。
バイオ医薬品研究開発における戦略的応用
初期発見およびターゲット検証
- 制御された3D環境における細胞-マトリックス相互作用の解析を容易にします。
- バイオマテリアルによる細胞応答の機能的検証を可能にします。
- 組織工学における初期段階の仮説に対する予測的信頼性を支持します。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 定量的な細胞ベースアッセイのための、標準化され再現性のあるスキャフォールドを提供します。
- 化合物スクリーニングワークフローに向けた、高気孔率構造体の作製を可能にします。
- 複数のアッセイフォーマットにおけるスケーラビリティとプラットフォームの再利用をサポートします。
トランスレーショナル・前臨床研究
- 疾患に関連する組織モデルにスキャフォールド構造を適合させることで、トランスレーショナルな連続性を確保します。
- 細胞の機能的な結果に基づき、リスクを調整しながらバイオマテリアル候補を推進させることが可能です。
- 活性機能基の事後修飾を可能にすることで、メカニズム的なリスク低減をサポートします。
パイプラインおよびワークフローの統合
このスキャフォールド作製法は、初期の探索から前臨床研究までを統合し、リード化合物の同定およびトランスレーショナルモデルの開発を支援します。
- 発見生物学：調整可能な3Dマトリックスにおける細胞挙動の仮説検証を可能にします。
- スクリーニング：細胞生存率および相互作用研究において、再現性と定量性のあるリードアウトを提供します。
- 分析：比較分析のために、孔径分布やスキャフォールド剛性などの測定可能な出力データを提供します。
- トランスレーショナルリサーチ：カスタマイズ可能なスキャフォールド特性を通じて、in vitroでの知見を前臨床組織モデルへと橋渡しします。
- エンタープライズでの再利用：多様な細胞種や実験的ニーズに適応可能なモジュール式プラットフォームを提供します。
運用および企業への影響
- 科学的価値： 細胞とマトリックスの研究における予測の信頼性を高め、メカニズムの曖昧さを軽減します。
- 運用の価値： 再現性と拡張性を確保するため、スキャフォールド製造を標準化します。
- 戦略的価値： 堅牢で生理学的に適切なアッセイを可能にすることで、ゴー/ノーゴー判断を改善します。
- ポートフォリオへの影響： バイオマテリアルおよび組織工学プログラムの、リスク調整後の優先順位付けをサポートします。
実施上の検討事項
- スキャフォールドの作製には、マイクロフルイディクスおよび高分子化学の専門知識が必要です。
- スキャフォールドの特性評価には、UV照射装置および分析ツールへのアクセスが必要です。
- スキャフォールドの特性の再現性とアッセイの統合には、チーム間での標準化が求められます。
- 後修飾オプションにより、さまざまな細胞型や実験モデルに適応可能です。
- 実用上の制限として、フロー制御の精度およびマイクロゲルロッド作製時の目詰まりの可能性が挙げられます。
バイオファーマに関するよくある質問
Chapters in this video
0:05
Introduction
1:11
Production and Purification of Amine and Epoxy Functionalized Microgel Rods
3:34
Macroporous Scaffold Formation and Cell Adhesive Post-Modification
4:24
Sterilization and Transfer into Cell Culture Media
5:02
Results: Interlinked Macroporous 3D Scaffolds from Microgel Rods
6:41
Conclusion
