レギノンを用いたステージチルトを用いた単粒子クライオ電子顕微鏡データ収集
2022年7月1日
本プロトコルは、クライオEM実験における傾斜した単一粒子データ収集のための一般化された実装が容易なスキームを記述している。このような手順は、空気-水界面への付着による優先配向バイアスに苦しんでいるサンプルの高品質のEMマップを取得するのに特に役立ちます。
試料ステージを傾けると、単一粒子クライオEMデータ収集中の粒子の配向分布を増加させる簡単で一般化可能な方法が提供されます。標本ステージの傾きによって得られる粒子の均一な分布により、全体的なマップの品質と解釈性が向上します。顕微鏡の位置を合わせることから始めて、標本の平行照明を確保し、コマ収差を最小限に抑えます。
データ収集に適した正方形を特定するには、ステージチルトなしまたはステージチルトのあるグリッドアトラスを記録し、全体的なグリッド品質の概要とデータ収集に適した領域の初期表示を提供します。正方形取得ノードで使用される倍率で正方形を手動で検査します。ホイルが無傷で、脱水状態ではなく、理想的な氷の厚さがある正方形を探し、試験片ステージを目的の正方形に移動します。
ステージ位置のユーセントリック高さを約15度のステージ傾斜でアルファワブラーを使用して決定し、顕微鏡のキーパッドパネルを使用してステージをユーセントリック高さになるようにZ高さを調整します。アルファウォブルルーチン中の画像シフトが最小限であることを確認します。より正確なZ高さを見つけるには、正方形取得ノードで使用される倍率でフォーカサーノードで推定します。
フォーカサーノードの設定を調整し、正方形の初期キューイング中に細かいZフォーカスオプションを有効または無効にします。次に、[シミュレート]を押します。真のユーセントリック高さでデータ収集のために、試料ステージを希望の傾斜角度に傾け、必要に応じてステージを再センタリングします。
正方形の集録ノードで[シミュレート]を押して、集録ノード全体のエクスポージャーのターゲットのキューイングを開始します。次に、Zフォーカスターゲットと高倍率露光に適した穴のある領域を選択し、ターゲットをイメージング用のキューに送信します。試験片ステージを傾けていない状態に戻し、次の正方形に移動します。
十分な数の露出全体がキューに入れられるまで、これらの手順を繰り返します。すべてのマスがキューに入れられたら、ターゲットノード全体に移動し、[キューに入れられたターゲットの送信]を押します。ノード設定で選択したターゲットのユーザー検証を許可するを選択し、高倍率露光取得ノードによって選択されたターゲットを手動で検査して、自動EMホールファインダーが試料ステージを傾けたときに画像取得に適した領域を正確に識別できるかどうかをテストします。
ユーザーがターゲティングの精度に満足したら、自動データ収集の [選択したターゲットのユーザー確認を許可する] オプションをオフにします。ここでは、ユーセントリックZ高さの近くと遠くで収集された異なる傾斜角での正方形倍率でのグリッドの代表的な画像を示します。ビームの中心は赤い同心円リングの中心で示され、緑の矢印は対象の正方形を示します。
参照用に関心のある正方形に隣接して壊れたグリッド フィーチャがあります。ここに示されているのは、0度、30度、および60度の傾斜角度で収集された代表的な穴露出と2Dクラス平均です。タンパク質濃度は異なる傾斜角にわたって変化しませんが、傾斜角を高くすると、画像化された領域が粒子濃度の点でより混雑しているように見えます。
過密の影響を受ける 2D クラス平均は、この赤いボックスに表示されます。プロトコルのシンプルさにより、顕微鏡の標準的なユーザーは、傾斜したデータ収集戦略を簡単に適応させることができます。
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概要
本プロトコルでは、試料ステージを傾斜させることで、単粒子クライオ電子顕微鏡（cryo-EM）のデータ収集を効率化する簡便な方法について説明します。このアプローチは、優先的な配向バイアスを示す試料のEMマップの品質を向上させる上で特に有用です。
研究の主要構成要素
科学分野
- クライオ電子顕微鏡 (cryo-EM)
- 構造生物学
- 単粒子解析
背景
- 単粒子クライオ電子顕微鏡（cryo-EM）は、生物学的高分子の構造決定において極めて重要です。
- 試料は、表面に付着する際に配向バイアスが生じることが多々あります。
- 粒子の配向を改善することで、マップの品質を高めることができます。
- ステージ傾斜は、より均一な粒子分布を実現するための手法です。
研究の目的
- クライオ電子顕微鏡（cryo-EM）のデータ収集時に試料ステージを傾斜させるためのプロトコルを提供する。
- 試料における優先配向のバイアスを低減する。
- EMマップの解釈性を向上させる。
使用した方法
- 最適な照明を得るための顕微鏡の調整。
- グリッド品質を評価するためのグリッドアトラスの記録。
- データ収集前に、最適な条件を満たすスクエアを検査。
- フォイルの完全性と氷の厚さに基づいてスクエアを手動で選択。
主な結果
- ステージを傾斜させることで、粒子の配向分布が向上します。
- 全体的なマップの品質と解釈可能性の改善が観察されました。
- データ収集に適した領域の特定に成功しました。
- 適切なアライメントにより、コマ収差が低減しました。
結論
- 試料ステージを傾斜させることは、クライオ電子顕微鏡（cryo-EM）における有効な戦略です。
- この手法により、EMマップの品質を大幅に向上させることができます。
- 今後の応用により、データ収集技術がさらに洗練される可能性があります。
よくある質問
業界における実用的な重要性
ステージ傾斜を伴う単粒子クライオ電子顕微鏡（cryo-EM）は、マップの解釈可能性や解像度を制限し得る粒子の優先的な配向性を克服することで、構造生物学における重大なボトルネックを解消します。この機能により、高分子構造決定における予測の信頼性が向上し、初期探索およびターゲット検証の重要な転換点に直接的な影響を与えます。この手法は標準的なTEMプラットフォームと広く互換性があり、バイオ医薬品の研究開発ポートフォリオ全体で、拡張性と再現性のあるデータ収集を可能にします。
バイオファーマR&Dにおける戦略的応用
初期発見およびターゲットバリデーション
- 配向分布を改善することにより、高分子標的の包括的な構造解析を可能にする。
- 等方的なマップ分解能により、標的バリデーションにおけるメカニズム的な曖昧さを低減する。
- 構造ベースの創薬設計およびポートフォリオの優先順位付けにおける予測信頼性を向上させる。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- ダウンストリームの計算およびスクリーニングワークフローに向けた、検証済みの構造データセットを準備します。
- 異なる条件下における粒子分布の、再現性のある定量的な評価を容易にします。
- サンプル調製プロトコルおよびグリッド品質の信頼性の高い評価を可能にします。
翻訳・前臨床研究
- 高品質な構造データを提供することで、創薬から前臨床検証までの連続性を向上させます。
- マップの解釈性を高めることで、リスクを調整した開発推進の意思決定をサポートします。
- 構造的知見を機能的アッセイに反映させることで、トランスレーショナルバイオマーカー戦略との整合性を図ります。
パイプラインおよびワークフローの統合
ステージ傾斜クライオ電子顕微鏡（cryo-EM）によるデータ収集は、パイプラインの初期および中間段階において堅牢な構造解析を可能にすることで、創薬から前臨床に至る連続的なプロセスに統合されます。
- 発見生物学：配向バイアスを軽減し、高分子構造を明確にすることで、仮説検証能力を向上させます。
- スクリーニング：アッセイへの適用および手法の標準化に向けた、再現性のある定量的な配向分布を提供します。
- 分析：比較分析および条件最適化のための、高品質な等方性マップを提供します。
- トランスレーショナルリサーチ：ダウンストリームのアプリケーションにおける構造データの信頼性を確保し、前臨床段階の連続性をサポートします。
- エンタープライズでの再利用：多様なターゲットやプロジェクトで繰り返し利用可能な、汎用性と機器互換性のあるワークフローを提供します。
運用および企業への影響
- 科学的価値： ターゲットバリデーションにおける予測の信頼性を高め、構造的な曖昧さを低減します。
- 運用の価値： データ収集を標準化し、再現性を向上させるとともに、既存のTEMインフラストラクチャとの互換性を確保します。
- 戦略的価値： 強固な構造的根拠を提供することで、go/no-go判断の質を向上させ、後期段階のリスクを軽減します。
- ポートフォリオへの影響： 構造的に検証されたターゲットの、リスク調整後の優先順位付けおよび推進を可能にします。
実施上の考慮事項
- クライオ電子顕微鏡（cryo-EM）のアライメントおよび試料ハンドリングに関する専門知識が必要です。
- 標準的な透過電子顕微鏡（TEM）および自動データ収集用のLeginonソフトウェアへのアクセスが必要です。
- グリッド調製およびデータ収集プロトコルのチーム間での標準化が求められます。
- 広範囲のマクロ分子試料およびグリッドタイプに適応可能です。
- 高傾斜角におけるオーバークラウディング（過密状態）の可能性を監視し、軽減する必要があります。
